一种在Raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法与流程

一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物技术及基因工程领域，尤其是一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法。


背景技术：

2.腹膜透析对于终末期肾病患者来说是一种成功的肾脏替代疗法，而腹膜炎是导致腹膜透析失败甚至患者死亡的主要原因，外界病原体的侵入，诱导巨噬细胞及白细胞等侵入腹膜。
3.巨噬细胞是属于吞噬细胞的一种细胞，是人体免疫系统的主要成员之一，能识别不同的病原微生物，并且能够快速做出有效反应,起到清除病原体的作用,是机体抵御外来感染的第一道防线。
4.pparγ即过氧化物酶体增殖物活化受体γ，是一种核激素受体超家族中的脂肪酸激活转录因子，经研究，pparγ在许多炎症疾病包括腹膜炎，脑损伤中的炎症，肺炎，肠炎，乳腺炎等许多不同部位的炎症中，pparγ都起着抗炎的作用。因此，通过研究pparγ是否以外泌体的形式从巨噬细胞中分泌出来，以及进一步研究分泌的pparγ调控腹膜炎性损伤的机制研究能够从机体防御的角度，为腹膜炎的预防及治疗提供新的思路。
5.在该研究过程中，在巨噬细胞raw264.7细胞中构建pparγ稳定高表达的细胞株是实验开展的基础，然而，慢病毒感染raw264.7十分困难，因此，提供一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达pparγ的细胞株的方法并进行应用是需要解决的一个技术问题。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，解决了raw264.7难感染的问题。
7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，包括以下步骤：（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态dh5α；（2）对转化后的dh5α扩大培养，提取质粒；（3）将获得的质粒转染293t细胞，获得慢病毒液；（4）利用ptg8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入raw264.7细胞；（6）稳定表达细胞的筛选；（7）细胞扩增；（8）获得稳定高表达目的基因的raw264.7细胞株。
8.慢病毒感染并非平常的感染，而是将包装好的慢病毒颗粒在借助外力的作用下（电转仪），通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的病毒颗粒，实现构建稳定高表达目的基因的细胞株。本发明其能够实现目标基因pparγ的稳定
过表达，进而为在raw264.7细胞中研究pparγ的分泌，以及分泌的pparγ调控腹膜炎性损伤的机制研究提供了实验材料，且该细胞株过表达pparγ稳定，可以用于定量和定性检测pparγ过表达状态下相关蛋白质的表达情况。
9.作为改进，所述raw264.7细胞为宿主细胞。
10.作为改进，述步骤（3）的具体步骤包括：a）转染前24h用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，接种于10cm大皿中，37℃、5%co2培养箱内用10%血清的dmem培养基培养；b）取2个无菌1.5ml离心管置于离心管架分别a管和b管，取650ulopti-mem 加入到两个离心管，取36μl lipofectamine 2000于a管中，分别取8ug质粒 3*flag-pparγ-egfp、6μgplp1、6μg plp2、6μg vsvg 加入b管中，室温静置5min；c）将长至80%的293t培养基弃掉，pbs清洗后换成opti-mem培养基培养；d）5min后，将a、b两管混合，室温静置20min；e）将a、b混合液转移至293t细胞的培养液中，混匀，于37℃、5% co2细胞培养箱中培养；f）培养6 h后弃去含有a、b混和物的培养基， pbs清洗，加入含10%灭活血清的dmem细胞培养基6 ml，于37℃、5% co2培养箱内继续培养48 h；g）收集上清，1000 rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液用0.45 μm pvdf滤器过滤至5 ml圆底离心管中。
11.作为改进，所述步骤（5）的具体步骤包括：a）将长至70%-80%的两皿raw264.7细胞拿到安全柜中，吹打下细胞，收集细胞沉淀，230g，3min离心；b）弃上清，pbs清洗一遍，分装为两管，230g，3min离心，弃上清；c）电转缓冲液为pbs和灭活的胎牛血清，用1ml血清/pbs重悬，计数，取5
×
106 个细胞于10 μl病毒浓缩液中吹打均匀，使用电极杯配套吸管加入到2mmbtx电极杯中，设置电压为200v，脉冲长度为8毫秒，脉冲数量为1，脉冲场强为1000v/cm，总样本体积为200
µ
l，温度为室温；d）将电转后的细胞悬液吸出加入含有1ml灭活的胎牛血清的六孔板中，37℃、5% co2培养箱内中培养。
12.本发明与现有技术相比所带来的有益效果是：本发明提供的方法通过利用电转仪，通过电转的方式将浓缩病毒转入raw264.7细胞，从而攻克了raw264.7难感染的难题，从而能够快速构建稳定高表达目标基因的raw264.7细胞株，能够通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。
附图说明
13.图1为western blot实验结果图i。
14.图2为western blot实验结果图ii。
15.图3为过表达pparγ后炎症因子下调的实时荧光定量pcr结果图。
具体实施方式
16.下面结合说明书附图对本发明作进一步说明。
17.一种在raw264.7细胞中快速构建稳定高表达细胞株的方法，包括以下步骤：（1）将目的基因与载体连接，转化到感受态dh5α；（2）对转化后的dh5α扩大培养，提取质粒；对转化后dh5α进行质粒提取，获得3*flag-pparγ-egfp质粒；（3）将获得的质粒转染293t细胞，获得慢病毒液；以所述3*flag-pparγ-egfp质粒转染293t细胞，收获病毒液，并以所述病毒液使用peg8000浓缩方法浓缩，利用电转仪感染raw264.7细胞后筛选出阳性克隆，培养10天左右，获得稳定高表达pparγ的细胞株，具体步骤如下：a）转染前24h，观察293t细胞状态，长至90%左右，状态良好；弃旧培养液，加入1ml pbs溶液，缓慢晃动，洗涤细胞，弃去pbs溶液，每皿加入1ml胰酶，消化约30s直到细胞变圆，变亮，弃胰酶，加入2ml ldmem+10％fbs培养基，用枪吹打数次，将皿底的细胞冲洗下来，收集到5ml离心管中， 230g，3min离心；加入1ml dmem+10％fbs培养基重选均匀；接种于10cm大皿中，37℃、5%co2培养箱内培养；b）第二天观察细胞状态，长至70%左右，状态良好；取2个无菌1.5ml离心管置于离心管架分别a管和b管，取650ulopti-mem 加入到两个离心管，取36μl lipofectamine 2000于a管中，分别取8ug质粒 3*flag-pparγ-egfp、6μgplp1、6μg plp2、6μg vsvg 加入b管中，室温静置5min；c）将长至80%的293t培养基弃掉，pbs清洗后换成opti-mem培养基培养；d）5min后，将a、b两管混合，室温静置20min；e）将a、b混合液转移至293t细胞的培养液中，混匀，于37℃、5% co2细胞培养箱中培养；f）培养6 h后弃去含有a、b混和物的培养基， pbs清洗，加入含10%灭活血清的dmem细胞培养基6 ml，于37℃、5% co2培养箱内继续培养48 h；g）收集上清，1000 rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液用0.45 μm pvdf滤器过滤至5 ml圆底离心管中；（4）利用ptg8000浓缩病毒液的方法浓缩病毒液；（5）利用电转仪通过电转的方式将浓缩病毒转入raw264.7细胞；具体步骤如下：a）将长至70%-80%的两皿raw264.7细胞拿到安全柜中，吹打下细胞，收集细胞沉淀，230g，3min离心；b）弃上清，pbs清洗一遍，分装为两管，230g，3min离心，弃上清；c）电转缓冲液为pbs和灭活的胎牛血清，用1ml血清/pbs重悬，计数，取5
×
106 个细胞（不超过200μ）于10 μl病毒浓缩液中吹打均匀，使用电极杯配套吸管加入到2mmbtx电极杯中，设置电压为200v，脉冲长度为8毫秒，脉冲数量为1，脉冲场强为1000v/cm，总样本体积为200
µ
l，温度为室温；d）将电转后的细胞悬液吸出加入含有1ml灭活的胎牛血清的六孔板中，37℃、5% co2培养箱内中培养；e）待细胞个数增长较多时，加入puro2μg/ml(一周左右)进行筛选阳性细胞。扩大
培养后，进行验证冻存；（6）稳定表达细胞的筛选；（7）细胞扩增；（8）获得稳定高表达目的基因的raw264.7细胞株。
18.此外，通过该实施例在raw264.7细胞中构建的pparγ过表达稳定细胞株进行鉴定，利用western blot方法检测该细胞株中pparγ表达情况，如图1，2中，pparγ的表达明显增强，flag也明显表达。
19.将本发明实施例构建成的高表达pparγ的raw264.7细胞株进行western blot检测蛋白变化，具体包括以下步骤：（1）将细胞株分为三组进行实验，分别为：raw264.7组、raw264.7vector组、raw264.7oe-pparγ组；（2）提取蛋白；（3）将各实验组细胞收集230g，3min离心，弃上清；用预冷pbs洗3遍，瞬离吸干pbs；加入100μl ebc裂解液（4种蛋白酶抑制剂pmsf,naf,na2vo3,pi按照1：100的比例添加）置于冰上30min，每隔10min弹一弹，4℃，12000g，离心30min；小心吸取上清，转移至干净1 .5ml离心管，bca法测定蛋白浓度后，加入5xsdsloadingbuffer制样,沸水煮十分钟；（4）制胶；根据pparγ融合蛋白分子大小，分别制作分离胶浓度8％sds-page聚丙烯酰胺凝胶；（5）按照聚丙烯酰胺凝胶附带说明书进行配制：8% sds-page:水 6.9 ml，30% 丙烯酰胺溶液4ml，1.5 mol/l tris (ph8.8) 3.8ml ，10% sds 0.15ml ，10% 过硫酸氨0.15ml ，temed 0.009ml；（6）按说明书比例配制好分离胶溶液，迅速混匀后小心加入胶槽，加入无水酒精封闭压平液面，静止至少半小时，待分离胶凝固倒出残余酒精，用滤纸吸干或等待酒精挥发；（7）按照说明书比例配制压缩胶溶液，水4.2ml，30%的丙烯酰胺混合液1ml，1.0mol/ltris 溶液(ph6.8)0.75ml，10%的sds 0.06ml，10%过硫酸铵 0.06ml，temed 0.006ml；迅速混匀后加到分离胶上，插入十孔梳子，避免气泡的产生；静止至少半小时，待压缩胶凝固，准备上样电泳；（8）电泳；取下制好的胶槽放入垂直电泳槽中，加入1
×
甘氨酸电泳缓冲液，高度高于矮的玻片，外槽加入同样的1
×
甘氨酸电泳缓冲液；70v电压压齐，待溴酚蓝跑过压缩胶，marker开始分离，加大电压至100v，37kda跑到接近凝胶底部，停止电泳，取出胶板，用刮板刮开双层玻璃片，再用刮板沿着分离胶最上沿切去上端压缩胶，用刮板将胶块放入盛有转印缓冲液的器皿中，准备转膜；（9）转膜；拿出转膜的滤纸夹板，在转印缓冲液中浸湿；裁剪和凝胶大小一致的pvdf膜2张，在甲醇中浸泡约1min，然后用镊子夹至滤纸上，再用刮板把凝胶轻轻放于膜上，避免气泡的产生，最后用另一张滤纸盖住，把“三明治”夹板卡在电转卡槽中，凝胶在负极，膜在正极；将电转卡槽置于电泳槽中，开启电源，恒压100v，低温转90min；（10）5%脱脂奶粉封闭2小时；（11）孵抗体，4℃孵育过夜；收取一抗，用tbst漂洗8min
×
3次，加入二抗，置于摇床20转，常温2小时，tbst漂洗8min
×
3次；
（12）显影；根据ecl发光试剂盒说明，按照1：1的比例配好发光液，加于膜表面，用凝胶成像系统照相即可。
20.实验结果图1，2为western blot实验结果。3*flag-pparγ-egfp的表达效果如图1，2所示，在过表达flag-pparγ（raw264.7 oe-pparγ）的细胞中，在95kda附件出现了特异性的pparγ条带和falg条带，表明raw264.7细胞中，flag-pparγ稳定过表达成功。
21.将本发明实施例构建成的高表达pparγ的raw264.7细胞株进行qpcr检测相关炎症因子的变化，具体包括以下步骤：（1）将细胞株分为两组进行实验，分别为：raw264.7vector组、raw264.7oe-pparγ组；（2）使用全式金trozol按照说明书提取传代培养后raw264.7vector、raw264.7oe-pparγ细胞的mrna，并进行逆转录，得到cdna；（3）使用全式金实时荧光定量pcr试剂盒进行qpcr检测tnf-α，il-6，il-1β三种炎症因子的变化。
22.如图3所示，结果显示，raw24.7 oe-pparγ细胞中过表达的pparγ显著抑制了炎症因子tnf-α、il-6、il-1β的表达。****：p《0.0001。与vector组进行比较。
23.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过市售购买获得的常规产品。