还原和氧化的多糖及其使用方法

还原和氧化的多糖及其使用方法
1.本技术是申请日为2016年10月26日、申请号为201680062497. 7、发明名称为“还原和氧化的多糖及其使用方法”的中国发明专利申 请的分案申请。
2.相关申请
3.本技术要求于2015年10月26日提交的美国临时申请号 62/246,462以及于2016年6月16日提交的美国临时申请号 62/351,162的优先权。上述临时申请中的每一个的全部内容通过引用 并入本文。


背景技术：

4.水凝胶是包含交联聚合物链的网络的聚合物凝胶。水凝胶的网 络结构使其能够吸收大量的水。一些水凝胶是高度伸缩性和弹性的； 其他的则是粘弹性的。水凝胶已用于治疗应用，例如作为体内递送 治疗剂如小分子、细胞和生物制剂的载体。
5.水凝胶通常由多糖如藻酸盐制成。可以化学操纵多糖来调节它 们的性质以及所得水凝胶的性质。例如，通过使多糖与将多糖中的 醇转化为醛的氧化剂反应来氧化的多糖，其显著增加了所得水凝胶 的生物降解性。然而，多糖的氧化也与不希望的副作用相关。例如， 通过氧化产生的醛可以与存在于蛋白质或其他分子上的氨基反应， 从而造成体内毒性和/或对可由氧化的多糖产生的水凝胶所包封的治 疗剂(货物(cargo))造成损害。存在于氧化的多糖中的醛还可以 与多糖附近可能存在的各种化学部分(例如点击试剂)反应，导致 其降解。因此，本领域需要可用于制备无毒、无反应性和生物可降 解的水凝胶的生物可降解多糖。本领域还需要可用于制备用于包封 小分子量治疗剂的具有足够小孔径的水凝胶的多糖。本领域还需要 可用于制备能够包封和保留脂质体并将脂质体递送至体内所需位置 的水凝胶的多糖。


技术实现要素：

6.本发明提供了包含某些还原的和某些高度氧化的多糖的组合 物。令人惊讶地发现，这些还原的和高度氧化的多糖特别适合于生 产可用于包封治疗剂或诊断剂或者用于包封基于脂质的纳米颗粒如 脂质体或病毒体以用于递送至受试者的水凝胶，所述纳米颗粒用于 包封治疗剂或诊断剂。使用还原的和/或高度氧化的多糖生产的本发 明水凝胶是可生物降解的，并且比本领域先前已知的水凝胶具有更 低的毒性和反应性。
7.因此，在一些实施方式中，本发明提供了包含还原的多糖的组 合物，其中还原的多糖包含少于2％的残余醛。
8.在一些实施方式中，本发明还提供了包含还原的多糖的组合物， 其中还原的多糖包含少于3％的残余醛；其中还原的多糖是通过如下 产生：使多糖与二醇特异性氧化剂反应，由此产生包含0.1％或更多 的摩尔氧化度(oxidation)的氧化的多糖；随后使所述氧化的多糖与 水溶性醛特异性还原剂反应以产生还原的多糖。
9.在一些方面中，还原的多糖通过如下产生：使多糖与二醇特异 性氧化剂反应，由此产生包含0.1％或更多的摩尔氧化度的含有二醇 的氧化的多糖；随后使所述氧化的多糖
与水溶性醛特异性还原剂反 应以产生所述还原的多糖。
10.在一些方面中，还提供了包含还原的多糖的组合物，其中还原 的多糖通过如下产生：使多糖与二醇特异性氧化剂反应，由此产生 含有二醇的氧化的多糖；随后使氧化的多糖与水溶性醛特异性还原 剂反应以产生所述还原的多糖。在一些方面中，多糖包含小于15 ％的残余醛，例如14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7 ％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％或0.1％。
11.在一些实施方式中，多糖选自藻酸盐、琼脂糖、普鲁兰多糖、 硬葡聚糖、壳聚糖、爱生兰(elsinan)、黄原胶、葡聚糖、甘露糖、 结冷胶、左聚糖、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素a、硫酸软骨素c、 硫酸软骨素e和β-d-葡聚糖。在一个实施方式中，多糖是藻酸盐。在 一个实施方式中，还原的多糖包含具有以下结构的藻氧醇 (algoxinol)：
[0012][0013]
在一些方面中，醛特异性水溶性还原剂选自硼氢化钠(nabh4)； 氰基硼氢化钠(nacnbh3)；催化剂存在下的氢气(h2)；氨硼烷 (h3nbh3)；和硼烷复合物。在一个具体实施方式中，醛特异性 水溶性还原剂是氨硼烷。在另一个具体实施方式中，二醇特异性氧 化剂是高碘酸钠。
[0014]
在一些实施方式中，组合物还包含连接至还原的多糖的交联剂。 在一些方面中，交联剂是点击试剂，例如点击试剂选自叠氮化物、 二苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0015]
在一些实施方式中，本发明还提供了包含还原的多糖和连接至 还原的多糖的交联剂的组合物。在一些方面中，多糖是藻酸盐聚合 物。在一些实施方式中，还原的多糖包含具有以下结构的藻氧醇：
[0016][0017]
在一些实施方式中，还原的多糖是通过包括以下步骤的方法生 产的：使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖； 和使氧化的多糖与水溶性醛特异性还原剂反应以产生还原的多糖。
[0018]
在一些实施方式中，二醇特异性氧化剂是高碘酸钠。在一些实 施方式中，水溶性
醛特异性还原剂是氨硼烷。
[0019]
在一些方面中，提供了包含高度氧化的多糖和连接至高度氧化 的多糖的交联剂的组合物。在一些实施方式中，多糖是藻酸盐聚合 物。在一些方面中，高度氧化的多糖包含具有以下结构的藻氧羧酸 盐(algoxalate)：
[0020][0021]
在一些实施方式中，高度氧化的多糖是通过包括以下步骤的方 法生产的：使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多 糖；和使氧化的多糖与将醛转化成羧酸的第二氧化剂反应以产生所 述高度氧化的多糖。
[0022]
在一个方面中，二醇特异性氧化剂是高碘酸钠。在另一个方面 中，第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0023]
在一些实施方式中，交联剂为点击试剂，例如选自叠氮化物、 二苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体的 点击试剂。
[0024]
在一些实施方式中，本发明还提供了包含本发明组合物的水凝 胶。
[0025]
在一些方面中，水凝胶还可包含例如选自细胞、小分子和生物 制剂的治疗剂。在一些实施方式中，生物制剂选自肽、dna分子、 rna分子和pna分子。在一个实施方式中，生物制剂是肽，例如血 管生成因子，例如选自fgf、vegf、vegfr、igf、nrp-1、ang1、 ang2、pdgf、pdgfr、tgf-β、内皮糖蛋白(endoglin)、tgf-β 受体、mcp-1、整合素、ve-钙粘蛋白、cd31、肝配蛋白、纤溶酶 原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、enos、cox-2、ac133、id1、 id3和hgf。在一个具体方面中，血管生成因子是vegf。
[0026]
在一些实施方式中，本发明的水凝胶还包含细胞，例如哺乳动 物细胞，如人间充质干细胞(hmsc)。
[0027]
在一些方面中，本发明提供了包含彼此交联的多个还原的和/或 氧化的多糖的水凝胶，其中水凝胶包含约10nm或更小，例如约 10nm、约9nm、约8nm、约7nm、约6nm、约5nm、约4nm、约3nm、 约2nm或约1nm或更小的目径(mesh size)。
[0028]
在一些实施方式中，氧化的多糖是高度氧化的藻酸盐聚合物。 在一些实施方式中，高度氧化的藻酸盐聚合物是通过包括以下步骤 的方法生产的：使藻酸盐与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧 化的藻酸盐；和使含醛的氧化的藻酸盐与将醛转化成羧酸的第二氧 化剂反应，由此产生所述高度氧化的藻酸盐聚合物。
[0029]
在一个实施方式中，二醇特异性氧化剂是高碘酸钠。在另一个 实施方式中，第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0030]
在一些实施方式中，氧化的藻酸盐聚合物为约0.1％、1％、5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％氧化的。
[0031]
在一些实施方式中，还原的多糖是还原的藻酸盐聚合物。在一 些实施方式中，所述还原的藻酸盐聚合物是通过包括以下步骤的方 法生产的：使藻酸盐与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的 藻酸盐；和使含醛的氧化的藻酸盐与水溶性醛特异性还原剂反应， 由此产生所述还原的藻酸盐聚合物。
[0032]
在一个实施方式中，二醇特异性氧化剂是高碘酸钠。在另一个 实施方式中，水溶性醛特异性还原剂是氨硼烷。
[0033]
在一些方面中，本发明的水凝胶包含约10nm至约1nm、约10nm 至约4nm、约7nm至约3nm、约5nm至约1nm、约4nm至约2nm、 或约3nm至约0.5nm的平均目径。
[0034]
在一些方面中，本发明的水凝胶还包含治疗剂或诊断剂，例如 细胞、小分子和生物制剂。在一些方面中，生物制剂选自肽、dna 分子、rna分子和pna分子。
[0035]
在一些实施方式中，生物制品是肽。在一些实施方式中，肽具 有500kda或更小，例如约450kda或更小、约300kda或更小、约 150kda或更小、约100kda或更小、约50kda或更小、约25kda或 更小或者约10kda或更小的分子量。
[0036]
在一些方面中，肽是血管生成因子，例如fgf、vegf、vegfr、 nrp-1、ang1、ang2、pdgf、pdgfr、igf、tgf-β、内皮糖蛋白、 tgf-β受体、mcp-1、整合素、整合素配体、ve-钙粘蛋白、cd31、 肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、enos、 cox-2、ac133、id1、id3和hgf。在一个具体实施方式中，血管 生成因子是vegf。
[0037]
在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如人间充质干细 胞(hmsc)。
[0038]
在一些实施方式中，多糖包含连接至多糖的交联剂。在一些方 面中，交联剂是点击试剂，例如叠氮化物、二苯并环辛炔、反式环 辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0039]
在一些实施方式中，本发明还提供了包含本发明水凝胶的可植 入或可注射装置。
[0040]
在一些方面中，本发明还提供了生产还原的多糖的方法，该方 法包括以下步骤：使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧 化的多糖；和使含醛的氧化的多糖与醛特异性水溶性还原剂反应， 由此产生还原的多糖。
[0041]
在一些实施方式中，醛特异性水溶性还原剂是硼氢化钠 (nabh4)；氰基硼氢化钠(nacnbh3)；催化剂如镍(ni)、铂 (p1)或钯(pd)催化剂存在下的氢气(h2)；氨硼烷(h3nbh3)； 或硼烷复合物，例如双碳酸盐硼烷复合物([(bh3)2co2]
2-·
2na
+
)， 硼烷二甲胺复合物[(ch3)2nh
·
bh3]；硼烷叔丁胺复合物[(ch3)3cnh2·
bh3]；或硼烷-嘧啶复合物。在一个具体实施方式中，醛特异性水 溶性还原剂是氨硼烷。在另一个具体实施方式中，二醇特异性氧化 剂是高碘酸钠。
[0042]
在一些实施方式中，该方法还包括使所述多糖与交联剂反应。 在一些方面中，交联试剂是点击试剂，例如叠氮化物、二苯并环辛 炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。在一个具体 实施方式中，多糖是藻酸盐聚合物。在一个实施方式中，藻酸盐聚 合物具有小于500kda的分子量。在一个实施方式中，还原的多糖包 含具有以下结构的藻氧醇：
[0043][0044]
在一些方面中，本发明还提供了生产共价连接至交联剂的高度 氧化的多糖的方法，该方法包括以下步骤：使多糖与二醇特异性氧 化剂反应以产生含醛的氧化的多糖；使含醛的氧化的多糖与将醛转 化成羧酸的第二氧化剂反应，由此产生高度氧化的多糖；和使多糖 与交联剂反应。
[0045]
在一些方面中，第二氧化剂选自亚氯酸钠、溴、稀硝酸(nho3)、 氧化银、铜(ii)配合物、高锰酸钾(kmno4)和过氧化氢(h2o2)。 在一个具体实施方式中，第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0046]
在一些实施方式中，交联剂是点击试剂，例如叠氮化物、二苯 并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0047]
在一些方面中，多糖是藻酸盐聚合物。在一个方面中，藻酸盐 聚合物具有小于500kda的分子量。
[0048]
在一个实施方式中，高度氧化的聚合物包含具有以下结构的藻 氧羧酸盐：
[0049][0050]
本发明还提供了一种药物递送组合物，其包含包封治疗剂或诊 断剂的基于脂质的纳米颗粒；和包封基于脂质的纳米颗粒的本发明 水凝胶。在一个实施方式中，基于脂质的纳米颗粒是脂质体或病毒 体。
[0051]
在一些实施方式中，基于脂质的纳米颗粒保持包封在水凝胶中 至少1天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少 30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55 天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75天或至少80天。
[0052]
在一些方面中，治疗剂或诊断剂选自细胞、小分子和生物制剂。 在一些方面中，生物制剂选自肽、抗体或其片段、疫苗、dna分子、 rna分子和pna分子。在一些方面中，治疗剂或诊断剂选自sting 佐剂、crispr-cas9试剂和佐剂负载的源自经破坏癌细胞的亚细胞 囊泡。在一些方面中，治疗剂或诊断剂是疫苗。
[0053]
在一些方面中，本发明还提供了药物递送组合物，其包含包封 治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒；和包封基于脂质的纳米颗 粒的点击物缀合的聚合物水凝胶，其中该
点击物缀合的聚合物水凝 胶包含生物可降解聚合物；并且其中聚合物不易被宿主内源性酶降 解。在一个实施方式中，基于脂质的纳米颗粒是脂质体或病毒体。
[0054]
在一些实施方式中，药物递送组合物允许将完整的基于脂质的 纳米颗粒持续递送至宿主中的期望位置。
[0055]
在一些实施方式中，多糖选自藻酸盐、琼脂糖、普鲁兰多糖、 硬葡聚糖，壳聚糖、爱生兰、黄原胶、葡聚糖、甘露糖、结冷胶、 左聚糖、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素a、硫酸软骨素c、硫酸 软骨素e和β-d-葡聚糖。在一个具体实施方式中，多糖是藻酸盐。
[0056]
在一些方面中，通过使用选自叠氮化物、二苯并环辛炔、反式 环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体的至少一种点击试剂来产生点击 物缀合的聚合物水凝胶。
[0057]
在一些实施方式中，藻酸盐包含约0.01％至约99％，例如约0.01 ％至约0.05％、约0.02％至约0.1％、约0.05％至约0.5％、约0.1％ 至约1％、约0.5％至约15％、约5％至约10％、约2％至约20％、 约15％至约40％、约30％至约50％、约40％至约70％、约50％至 约80％或约60％至约99％的点击取代度。在一些方面中，点击物缀 合的聚合物水凝胶包含约0.1％至约99％氧化的，例如约0.1％至约 0.5％、约0.2％至约1％、约0.5％至约10％、约5％至约20％、约 15％至约40％、约25％至约50％、约40％至约70％、约50％至约 80％或约75％至约99％氧化的藻酸盐。
[0058]
在一些方面中，点击物缀合的的藻酸盐水凝胶已经由以约1％至 约99％w/v，例如约1％至约5％、约2％至约10％、约5％至约20 ％、约10％至约30％、约20％至约50％、约40％至约70％、约60 ％至约80％或约75％至约99％w/v的浓度存在的藻酸盐制备。在一 些实施方式中，基于脂质的纳米颗粒保持包封在点击物缀合的聚合 物水凝胶中至少1天，至少10天，至少15天，至少20天，至少25 天，至少30天，至少35天，至少40天，至少45天，至少50天， 至少55天，至少60天，至少65天，至少70天，至少75天或至少 80天。
[0059]
在一些方面中，本发明还提供了药物递送组合物，其包含包封 治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒；和包封该基于脂质的纳米 颗粒的藻酸盐水凝胶，其中该水凝胶包含藻酸盐，该藻酸盐包含约 50％或更少的摩尔氧化度，例如约45％或更少、约40％或更少、约 35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约 15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约1％或更少、约0.5 ％或更少或者约0.1％或更少。在一个实施方式中，基于脂质的纳米 颗粒是脂质体或病毒体。在一个方面中，组合物允许将完整的基于 脂质的纳米颗粒持续递送至宿主中的期望位置。
[0060]
在一些方面中，通过使用至少一种选自叠氮化物、二苯并环辛 炔、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体的点击试剂来产生点击 物缀合的聚合物水凝胶。在一些方面中，藻酸盐与点击试剂缀合， 并且其中藻酸盐包含约0.01％至约90％的点击取代度。
[0061]
在一些方面中，点击物缀合的聚合物水凝胶包含约0.1％至约99 ％氧化的藻酸盐。
[0062]
在一些实施方式中，藻酸盐水凝胶已由以约1％至约80％w/v的 浓度存在的藻酸盐制备。在一些实施方式中，基于脂质的纳米颗粒 保持包封在水凝胶中至少1天、至少10天、至少15天、至少20天、 至少25天、至少30天、至少35天、在至少40天、至少45天、至 少50天、至少55天、至少60天、至少65天、至少70天、至少75 天或至少80天。
[0063]
在一些方面中，治疗剂或诊断剂选自细胞、小分子和生物制剂。 在一些实施方式
中，生物制剂选自肽、抗体或其片段、疫苗、dna 分子、rna分子和pna分子。在一些实施方式中，rna分子选自 mrna、rnai、sirna、shrna、microrna、isrna、lncrna和反 义rna。
[0064]
在一些方面中，治疗剂或诊断剂选自sting佐剂、crispr-cas9 试剂和佐剂负载的源自经破坏癌细胞的亚细胞囊泡。
[0065]
在一些实施方式中，脂质体是阳离子脂质体。在一些方面中， 期望的位置是细胞的胞液。
[0066]
在一些实施方式中，本发明还提供了用于治疗有需要的受试者 的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的水凝胶、可植 入或可注射装置或者药物递送组合物，由此治疗所述受试者。
[0067]
在一些方面中，受试者患有选自局部缺血、眼睛相关的病症或 耳部相关的病症的疾病或症状。
[0068]
在一些实施方式中，本发明还提供了在有需要的受试者中治疗 慢性局部缺血或增强移植组织的移植成活率(engraftment)的方法， 该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的水凝胶、可植入或 可注射装置或者药物递送组合物，由此在所述受试者中治疗所述慢 性局部缺血或增强所述移植组织的移植成活率。
[0069]
在一些方面中，将水凝胶或者或可植入或可注射装置或者药物 递送组合物局部施用至例如局部缺血部位，或在移植之前和/或之后 局部施用至进行移植的组织。
[0070]
在一些方面中，当以可溶形式递送肽时，水凝胶或者可植入或 可注射装置或者药物递送组合物以比所述肽的推荐肽剂量小至少约 10倍，例如小约15倍、小约20倍、小约50倍的剂量包含所述肽。
[0071]
在一个具体方面中，肽是vegf和igf。在一个实施例中，受 试者是人。
[0072]
本发明还涉及以下项目：
[0073]
1.一种包含还原的多糖的组合物，其中所述还原的多糖包含少 于2％的残余醛。
[0074]
2.一种包含还原的多糖的组合物，其中所述还原的多糖包含少 于3％的残余醛；
[0075]
其中所述还原的多糖是通过以下产生的：使多糖与二醇特异性 氧化剂反应，由此产生包含0.1％或更多的摩尔氧化度的氧化的多 糖；
[0076]
随后使所述所述氧化的多糖与水溶性醛特异性还原剂反应以产 生所述还原的多糖。
[0077]
3.项目1所述的组合物，其中所述还原的多糖是通过以下产生 的：使多糖与二醇特异性氧化剂反应，由此产生包含0.1％或更多的 摩尔氧化度的含有二醇的氧化的多糖；
[0078]
随后使所述氧化的多糖与水溶性醛特异性还原剂反应以产生所 述还原的多糖。
[0079]
4.一种包含还原的多糖的组合物，其中
[0080]
所述还原的多糖是通过以下产生的：使多糖与二醇特异性氧化 剂反应，由此产生含有二醇的氧化的多糖；
[0081]
随后使所述氧化的多糖与水溶性醛特异性还原剂反应以产生所 述还原的多糖。
[0082]
5.项目3所述的组合物，其中所述还原的多糖包含少于15％的 残余醛。
[0083]
6.项目1-5中任一项所述的组合物，其中所述多糖选自藻酸盐、 琼脂糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、壳聚糖、爱生兰、黄原胶、葡聚 糖、甘露糖、结冷胶、左聚糖、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素a、 硫酸软骨素c、硫酸软骨素e和β-d-葡聚糖。
[0084]
7.项目6所述的组合物，其中所述多糖是藻酸盐。
[0085]
8.项目1-7中任一项所述的组合物，其中所述还原的多糖包含 具有以下结构的藻氧醇(algoxinol)：
[0086][0087]
9.项目2-4中任一项所述的组合物，其中所述醛特异性水溶性 还原剂选自硼氢化钠(nabh4)；氰基硼氢化钠(nacnbh3)；催 化剂存在下的氢气(h2)；氨硼烷(h3nbh3)；和硼烷复合物。
[0088]
10.项目9所述的组合物，其中所述醛特异性水溶性还原剂是氨 硼烷。
[0089]
11.项目2-4中任一项所述的组合物，其中所述二醇特异性氧化 剂是高碘酸钠。
[0090]
12.项目1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含 连接至所述还原的多糖的交联剂。
[0091]
13.项目12所述的组合物，其中所述交联剂是点击试剂。
[0092]
14.项目13所述的组合物，其中所述点击试剂选自叠氮化物、 二苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0093]
15.一种组合物，其包含还原的多糖和连接至所述还原的多糖的 交联剂。
[0094]
16.项目15所述的组合物，其中所述还原的多糖是还原的藻酸 盐聚合物。
[0095]
17.项目15或16所述的组合物，其中所述还原的多糖包含具有 以下结构的藻氧醇：
[0096][0097]
18.项目15-17中任一项所述的组合物，其中所述还原的多糖是 通过包括以下步骤的方法产生的：
[0098]
使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖；和
[0099]
使所述氧化的多糖与水溶性醛特异还原剂反应以产生所述还原 的多糖。
[0100]
19.项目18所述的组合物，其中所述二醇特异性氧化剂是高碘 酸钠。
[0101]
20.项目18或19所述的组合物，其中所述水溶性醛特异性还原 剂是氨硼烷。
[0102]
21.一种组合物，其包含高度氧化的多糖和连接至所述高度氧化 的多糖的交联剂。
[0103]
22.项目21所述的组合物，其中所述高度氧化的多糖是藻酸盐 聚合物。
[0104]
23.项目21或22所述的组合物，其中所述高度氧化的多糖包含 具有以下结构的藻氧羧酸盐(algoxalate)：
[0105][0106]
24.项目21-23中任一项所述的组合物，其中所述高度氧化的多 糖是通过包括以下步骤的方法产生的：
[0107]
使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖；和
[0108]
使所述氧化的多糖与将醛转化成羧酸的第二氧化剂反应以产生 所述高度氧化的多糖。
[0109]
25.项目24所述的组合物，其中所述二醇特异性氧化剂是高碘 酸钠。
[0110]
26.项目24或25所述的组合物，其中所述第二氧化剂是亚氯酸 钠。
[0111]
27.项目15-26中任一项所述的组合物，其中所述交联剂是点击 试剂。
[0112]
28.项目27所述的组合物，其中所述点击试剂选自叠氮化物、 二苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0113]
29.一种水凝胶，其包含项目1-28中任一项所述的组合物。
[0114]
30.项目29所述的水凝胶，其还包含治疗剂。
[0115]
31.项目30所述的水凝胶，其中所述治疗剂选自细胞、小分子 和生物制剂。
[0116]
32.项目31所述的水凝胶，其中所述生物制剂选自肽、dna分 子、rna分子和pna分子。
[0117]
33.项目32所述的水凝胶，其中所述生物制剂是肽。
[0118]
34.项目33所述的水凝胶，其中所述肽是血管生成因子。
[0119]
35.项目34所述的水凝胶，其中所述血管生成因子选自fgf、 vegf、vegfr、igf、nrp-1、ang1、ang2、pdgf、pdgfr、tgf-β、 内皮糖蛋白、tgf-β受体、mcp-1、整合素、ve-钙粘蛋白、cd31、 肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂-1、enos、 cox-2、ac133、id1、id3和hgf。
[0120]
36.项目35所述的水凝胶，其中所述血管生成因子是vegf。
[0121]
37.项目31所述的水凝胶，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
[0122]
38.项目37所述的水凝胶，其中所述哺乳动物细胞是人间充质 干细胞(hmsc)。
[0123]
39.一种水凝胶，其包含彼此交联的多个还原的和/或高度氧化 的多糖，其中所述水凝胶包含10nm或更小的目径。
[0124]
40.项目39所述的水凝胶，其中所述高度氧化的多糖是高度氧 化的藻酸盐聚合物。
[0125]
41.项目40所述的水凝胶，其中所述高度氧化的藻酸盐聚合物 是通过包括以下步
骤的方法产生的：
[0126]
使藻酸盐与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的藻酸 盐；和
[0127]
使所述含醛的氧化的藻酸盐与将醛转化成羧酸的第二氧化剂反 应，由此产生所述高度氧化的藻酸盐聚合物。
[0128]
42.项目41所述的水凝胶，其中所述二醇特异性氧化剂是高碘 酸钠。
[0129]
43.项目41所述的水凝胶，其中所述第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0130]
44.项目40所述的水凝胶，其中所述高度氧化的藻酸盐聚合物 为约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40 ％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、 90％、95％或99％氧化的。
[0131]
45.项目39所述的水凝胶，其中所述还原的多糖是还原的藻酸 盐聚合物。
[0132]
46.项目45所述的水凝胶，其中所述还原的藻酸盐聚合物是通 过包括以下步骤的方法产生的：
[0133]
使藻酸盐与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的藻酸 盐；和
[0134]
使所述含醛的氧化的藻酸盐与水溶性醛特异性还原剂反应，由 此产生所述还原的藻酸盐聚合物。
[0135]
47.项目46所述的水凝胶，其中所述二醇特异性氧化剂是高碘 酸钠。
[0136]
48.项目46所述的水凝胶，其中所述水溶性醛特异性还原剂是 氨硼烷。
[0137]
49.项目39-48中任一项所述的水凝胶，其中所述水凝胶包含约 10nm至约1nm、约10nm至约4nm、约7nm至约3nm、约5nm至约 1nm、约4nm至约2nm或约3nm至约0.5nm的平均目径。
[0138]
50.项目49所述的水凝胶，其还包含治疗剂或诊断剂。
[0139]
51.项目50所述的水凝胶，其中所述治疗剂或诊断剂选自细胞、 小分子和生物制剂。
[0140]
52.项目51所述的水凝胶，其中所述生物制剂选自肽、dna分 子、rna分子和pna分子。
[0141]
53.项目52所述的水凝胶，其中所述生物制剂是肽。
[0142]
54.项目53所述的水凝胶，其中所述肽具有500kda或更小的 分子量。
[0143]
55.项目53所述的水凝胶，其中所述肽是血管生成因子。
[0144]
56.项目55所述的水凝胶，其中所述血管生成因子选自fgf、 vegf、vegfr、nrp-1、ang1、ang2、pdgf、pdgfr、igf、tgf-β、 内皮糖蛋白、tgf-β受体、mcp-1、整合素、整合素配体、ve-钙粘 蛋白、cd31、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂
ꢀ‑
1、enos、cox-2、ac133、id1、id3和hgf。
[0145]
57.项目56所述的水凝胶，其中所述血管生成因子是vegf。
[0146]
58.项目51所述的水凝胶，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
[0147]
59.项目58所述的水凝胶，其中所述哺乳动物细胞是人间充质 干细胞(hmsc)。
[0148]
60.项目39所述的水凝胶，其中所述多糖包含连接至所述多糖 的交联剂。
[0149]
61.项目60所述的水凝胶，其中所述交联剂是点击试剂。
[0150]
62.项目61所述的水凝胶，其中所述点击试剂选自叠氮化物， 二苯并环辛炔，反式环辛烯，四嗪和降冰片烯及其变体。
[0151]
63.包含项目29-62中任一项所述的水凝胶的可植入或可注射装 置。
[0152]
64.一种生产还原的多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
[0153]
使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖；和
[0154]
使所述含醛的氧化的多糖与醛特异性水溶性还原剂反应，由此 产生所述还原的多糖。
[0155]
65.项目64所述的方法，其中所述醛特异性水溶性还原剂选自 硼氢化钠(nabh4)；氰基硼氢化钠(nacnbh3)；催化剂存在下 的氢气(h2)；氨硼烷(h3nbh3)；或硼烷复合物。
[0156]
66.项目65所述的方法，其中所述醛特异性水溶性还原剂是氨 硼烷。
[0157]
67.项目64所述的方法，其中所述二醇特异性氧化剂是高碘酸 钠。
[0158]
68.项目64所述的方法，其还包括使所述还原的多糖与交联剂 反应。
[0159]
69.项目68所述的方法，其中所述交联试剂是点击试剂。
[0160]
70.项目69所述的方法，其中所述点击试剂选自叠氮化物、二 苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0161]
71.项目64-70中任一项所述的方法，其中所述多糖是藻酸盐聚 合物。
[0162]
72.项目71所述的方法，其中所述藻酸盐聚合物具有小于 500kda的分子量。
[0163]
73.项目64-72中任一项所述的方法，其中所述还原的多糖包含 具有以下结构的藻氧醇：
[0164][0165]
74.一种生产共价连接至交联剂的高度氧化的多糖的方法，所述 方法包括以下步骤：
[0166]
使多糖与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖；
[0167]
使所述含醛的氧化的多糖与将醛转化为羧酸的第二氧化剂反 应，由此产生所述高度氧化的多糖；和
[0168]
使所述高度氧化的多糖与交联剂反应。
[0169]
75.项目74所述的方法，其中所述第二氧化剂选自亚氯酸钠、 溴、稀硝酸(nho3)、氧化银、铜(ii)配合物、高锰酸钾(kmno4) 和过氧化氢(h2o2)。
[0170]
76.项目75所述的方法，其中所述第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0171]
77.项目74-76中任一项所述的方法，其中所述交联剂是点击试 剂。
[0172]
78.项目77所述的方法，其中所述点击试剂选自叠氮化物、二 苯并环辛炔(dbco)、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0173]
79.项目74-78中任一项所述的方法，其中所述多糖是藻酸盐聚 合物。
[0174]
80.项目74-79所述的方法，其中所述高度氧化的多糖包含具有 以下结构的藻氧羧酸盐：
[0175][0176]
81.一种药物递送组合物，其包含
[0177]
包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒；和
[0178]
包封所述基于脂质的纳米颗粒的项目29-62中任一项所述的 水凝胶。
[0179]
82.项目81所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳米 颗粒是脂质体。
[0180]
83.项目82所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳米 颗粒是病毒体。
[0181]
84.项目81-83中任一项所述的药物递送组合物，其中所述基于 脂质的纳米颗粒保持包封在所述水凝胶中至少1天、至少10天、至 少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40 天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65天、 至少70天、至少75天或至少80天。
[0182]
85.项目81-84中任一项所述的药物递送组合物，其中所述治疗 剂或诊断剂选自细胞、小分子和生物制剂。
[0183]
86.项目85所述的药物递送组合物，其中所述生物制剂选自肽、 抗体或其片段、疫苗、dna分子、rna分子和pna分子。
[0184]
87.项目81-85中任一项所述的药物递送组合物，其中所述治疗 剂或诊断剂选自sting佐剂、crispr-cas9试剂和佐剂负载的源自 经破坏癌细胞的亚细胞囊泡。
[0185]
88.项目81-86中任一项所述的药物递送组合物，其中所述治疗 剂或诊断剂是疫苗。
[0186]
89.一种药物递送组合物，其包含
[0187]
包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒；和
[0188]
包封所述基于脂质的纳米颗粒的点击物缀合的聚合物水凝胶，
[0189]
其中所述点击物缀合的聚合物水凝胶包含生物可降解的聚合 物；并且
[0190]
其中所述生物可降解的聚合物不易被宿主内源性酶降解。
[0191]
90.项目89所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳米 颗粒是脂质体。
[0192]
91.项目89所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳米 颗粒是病毒体。
[0193]
92.项目89-91中任一项所述的药物递送组合物，其中所述药物 递送组合物允许将完整的基于脂质的纳米颗粒持续递送至所述宿主 中的期望位置。
[0194]
93.项目89-92中任一项所述的药物递送组合物，其中所述生物 可降解的聚合物是多糖。
[0195]
94.项目93所述的药物递送组合物，其中所述多糖选自藻酸盐、 琼脂糖、普鲁兰多糖、硬葡聚糖、壳聚糖、爱生兰、黄原胶、葡聚 糖、甘露糖、结冷胶、左聚糖、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素a、 硫酸软骨素c、硫酸软骨素e和β-d-葡聚糖。
[0196]
95.项目94所述的药物递送组合物，其中所述多糖是藻酸盐。
[0197]
96.项目89-95中任一项所述的药物递送组合物，其中所述点击 物缀合的聚合物水凝胶是通过使用选自以下的至少一种点击试剂而 产生的：叠氮化物、二苯并环辛炔、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯 及其变体。
[0198]
97.项目95或96所述的药物递送组合物，其中所述藻酸盐缀合 至点击试剂，并且其中所述藻酸盐包含约0.01％至约99％的点击取 代度。
[0199]
98.项目97所述的药物递送组合物，其中所述点击物缀合的聚 合物水凝胶包含约0.1％至约99％氧化的藻酸盐。
[0200]
99.项目89所述的药物递送组合物，其中所述点击物缀合的藻 酸盐水凝胶已制备自以约1％至约99％w/v的浓度存在的藻酸盐。
[0201]
100.项目89-99中任一项所述的组合物，其中所述基于脂质的 纳米颗粒保持包封在所述点击物缀合的聚合物水凝胶中至少1天、 至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少 35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60 天、至少65天、至少70天、至少75天或至少80天。
[0202]
101.一种药物递送组合物，其包含
[0203]
包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒；和
[0204]
包封所述基于脂质的纳米颗粒的藻酸盐水凝胶，
[0205]
其中所述水凝胶包含含有50％或更少摩尔氧化度的藻酸盐。
[0206]
102.项目101所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳 米颗粒是脂质体。
[0207]
103.项目101所述的药物递送组合物，其中所述基于脂质的纳 米颗粒是病毒体。
[0208]
104.项目101-103中任一项所述的药物递送组合物，其中所述 组合物允许将完整的基于脂质的纳米颗粒持续递送至宿主中的期望 位置。
[0209]
105.项目101-104中任一项所述的药物递送组合物，其中所述 藻酸盐缀合至点击试剂，并且其中所述藻酸盐包含约0.01％至约90 ％的点击取代度。
[0210]
106.项目105中任一项所述的药物递送组合物，其中所述藻酸 盐水凝胶是通过使用选自以下的至少一种点击试剂而产生的：叠氮 化物、二苯并环辛炔、反式环辛烯、四嗪和降冰片烯及其变体。
[0211]
107.项目101所述的药物递送组合物，其中所述藻酸盐水凝胶 包含为约0.1％至约99％氧化的藻酸盐。
[0212]
108.项目101所述的药物递送组合物，其中所述藻酸盐水凝胶 已制备自以约1％至约80％w/v的浓度存在的藻酸盐。
[0213]
109.项目101-108中任一项所述的药物递送组合物，其中所述 基于脂质的纳米颗粒保持包封在所述水凝胶中至少1天、至少10天、 至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少 40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天、至少65 天、至少70天、至少75天或至少80天。
[0214]
110.项目101-109中任一项所述的药物递送组合物，其中所述 治疗剂或诊断剂选自细胞、小分子和生物制剂。
[0215]
111.项目110所述的药物递送组合物，其中所述生物制剂选自 肽、抗体或其片段、疫苗、dna分子、rna分子和pna分子。
[0216]
112.项目111所述的药物递送组合物，其中所述rna分子选 自mrna、rnai、sirna、
shrna、microrna、isrna、lncrna和 反义rna。
[0217]
113.项目101-109中任一项所述的药物递送组合物，其中所述 治疗剂或诊断剂选自sting佐剂、crispr-cas9试剂和佐剂负载的 源自经破坏癌细胞的亚细胞囊泡。
[0218]
114.项目82、90或102中任一项所述的药物递送组合物，其 中所述脂质体是阳离子脂质体。
[0219]
115.项目92或104所述的药物递送组合物，其中所述期望位 置是细胞的胞液。
[0220]
116.一种用于治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所 述受试者施用有效量的项目30-63中任一项所述的水凝胶、项目64 所述的可植入或可注射装置或者项目82-115中任一项所述的药物递 送组合物，由此治疗所述受试者。
[0221]
117.根据项目116所述的方法，其中所述受试者患有选自以下 的疾病或病症：局部缺血、眼睛相关的病症或耳部相关的病症。
[0222]
118.一种在有需要的受试者中治疗慢性局部缺血或增强移植 组织的移植成活率的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量 的项目29-62中任一项所述的水凝胶、项目63所述的可植入或可注 射装置或者项目81-115中任一项所述的药物递送组合物，由此在所 述受试者中治疗所述慢性局部缺血或增强所述移植组织的移植成活 率。
[0223]
119.项目116-118中任一项所述的方法，其中所述水凝胶或者 所述可植入或可注射装置或者所述药物递送组合物为局部施用。
[0224]
120.项目119所述的方法，其中将所述水凝胶或者所述可植入 或可注射装置或者所述药物递送组合物局部注射至局部缺血部位， 或在移植之前和/或之后局部注射至进行移植的组织。
[0225]
121.项目120所述的方法，其中当以可溶形式递送肽时，所述 水凝胶或者所述可植入或可注射装置或者所述药物递送组合物以比 所述肽的推荐剂量小至少10倍的剂量包含所述肽。
[0226]
122.项目121所述的方法，其中所述肽是vegf和igf。
[0227]
123.项目116-122中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
[0228]
通过以下详细描述和附图进一步说明本发明。
附图说明
[0229]
图1a是显示点击试剂与未氧化的藻酸盐缀合的示意图。
[0230]
图1b是显示点击试剂与氧化的藻酸盐缀合的示意图，示出了不 利于进一步共价点击交联的不稳定(可水解的)亚胺键的形成。
[0231]
图1c是显示点击试剂与高度氧化的藻酸盐缀合的示意图，示出 了可用于点击缀合的所产生的另外羧酸基团。
[0232]
图2a是显示如通过elisa测定的随着暴露于氧化藻酸的盐而变 化的vegf生物活性损失的条形图。
[0233]
图2b是孵育后含有与tz和nb缀合的氧化的藻酸盐的小瓶的图 片，示出由于氧化的藻酸盐中存在的醛而导致的点击缀合物的明显 变化。
[0234]
图3a是显示藻酸盐氧化以产生含反应性醛的氧化的藻酸盐；随 后将氧化的藻酸盐选择性还原或氧化以消除反应性醛的化学方案。
[0235]
图3b是显示用氨硼烷或硼氢化钠进一步还原，或用亚氯酸钠进 一步氧化的氧化的藻酸盐中残余氧化度％的条形图。
[0236]
图4a是显示在ebm中孵育5天后通过elisa测量的vegf生 物活性％变化的条形图，示出了随着暴露于氧化的或还原的藻酸盐 而变化的vegf生物活性损失。
[0237]
图4b是显示在1％bsa溶液中孵育5天后通过elisa测量的 vegf生物活性％变化的条形图，示出了随着暴露于氧化的藻酸盐而 变化的vegf生物活性损失。
[0238]
图5a是在第0天含有与tz和nb缀合的highox藻酸盐的小瓶 (上图)和在第0天含有与tz和nb缀合的highox sc藻酸盐的小 瓶(下图)的两幅图，示出了由于氧化的藻酸盐中醛的存在而导致 的点击缀合物的明显变化，以及在含有藻氧醇和藻氧羧酸盐的缀合 物中没有变化。
[0239]
图5b是显示如通过nmr测量的存在于highox和highox sc 藻酸盐中的tz的相对量的条形图，示出了经由另外的羧酸部分点击 缀合含藻氧羧酸盐的藻酸盐的额外潜能。
[0240]
图6a是在第28天具有20-50％氧化度的tz-缀合的highox藻酸 盐材料的紫外-可见光谱(上图)和在第14天含有20％和30％缀合 的用亚氯酸钠处理的tz-缀合的highox藻酸盐材料的紫外-可见光 谱。图6a示出由点击部分与存在于氧化藻酸盐材料中的藻酸盐醛的 反应引起的tz uv-可见光谱的变化。
[0241]
图6b是含有用氨硼烷处理的tz-缀合的highox藻酸盐材料和用 亚氯酸钠处理的highox藻酸盐材料的小瓶的两幅图。图6b示出了 由点击部分与氧化的藻酸盐材料中存在的藻酸盐醛的反应引起的tz 溶液颜色的变化。
[0242]
图6c是在第28天具有20-50％氧化度的nb-缀合的highox藻 酸盐材料的紫外-可见光谱(上图)和在第14天含有20％-50％缀合 的用亚氯酸钠处理的nb-缀合的highox藻酸盐材料的紫外-可见光 谱。图6c示出了由点击部分与氧化的藻酸盐材料中存在的藻酸盐醛 的反应引起的nb紫外-可见光谱的变化。
[0243]
图6d是在第28天具有20-50％氧化度的nb-缀合的highox藻 酸盐材料(上图)和在第14天含有20％-50％缀合的用亚氯酸钠处 理的nb-缀合的highox藻酸盐材料的小瓶(下图)的两幅图。图6d 示出了由点击部分与氧化的藻酸盐材料中存在的藻酸盐醛的反应引 起的nb溶液颜色的变化。
[0244]
图6e是用高碘酸钠氧化的nb-缀合的藻酸盐材料的nmr谱， 显示了nb峰的展宽以及醛峰的存在。
[0245]
图6f是已经用高碘酸钠氧化的tz-缀合的藻酸盐材料的nmr 谱，显示了nb峰的展宽和醛峰的存在。
[0246]
图6g是已经用高碘酸钠氧化并且随后用亚氯酸钠进一步氧化的nb-缀合的藻酸盐材料的nmr谱，显示nb峰未变宽且没有醛峰。
[0247]
图6h是已经用高碘酸钠氧化并且随后用亚氯酸钠进一步氧化的 tz-缀合的藻酸盐材料的nmr谱，显示nb峰未变宽且没有醛峰。
[0248]
图6i是藻酸盐材料的代表性ftir光谱，证明了在用亚氯酸钠 处理后产生了羧酸峰。
[0249]
图6j是第15天tz-缀合和nb-缀合的藻酸盐材料的紫外-可见光 谱，显示了含有藻氧醇和藻氧羧酸盐的点击物缀合的藻酸盐没有颜 色变化。
[0250]
图6k是用高碘酸钠氧化并用亚氯酸钠进一步氧化的藻酸盐材料 的nmr谱，显示不存在醛相关的峰(～≥5.1ppm)。
[0251]
图7a是显示具有20％氧化度(左图)和50％氧化度(右图) 的tz-缀合和nb-缀合的mvg藻酸盐(约250kda起始mw)的降 解的两幅图，显示了随时间变化的藻酸盐聚合物骨架的水解。
[0252]
图7b是显示对于未处理的藻酸盐(左上图)、用氨硼烷还原处 理的藻酸盐(右上图)、用硼氢化钠还原处理的藻酸盐(左下图) 和用氨硼烷(还原处理的藻酸盐(右下图)的在37℃下含有0％-50 ％氧化度的vlvg(30kda起始mw)藻酸盐的降解的四幅图，显 示了随时间变化的藻酸盐聚合物骨架的水解。
[0253]
图7c是含有具有20％氧化度的mvg和vlvg材料的50％w/v 溶液和用于比较的50％w/v的未氧化的vlvg的小瓶的照片。与母 体藻酸盐不同，含藻氧醇和藻氧羧酸盐的藻酸盐材料显示出增加的 溶解度。
[0254]
图8是显示tz-缀合的藻酸盐材料相对于缀合等同物在515nm处 的紫外-可见吸收的图。
[0255]
图9是显示在孵育2天后在含有0-50％氧化度的氧化的藻酸盐 存在下的相对细胞活力的条形图。
[0256]
图10是显示分子量为250kda的未氧化的藻酸盐(mvg，左条)； 分子量为30kda的未氧化的藻酸盐(vlvg，中心条)；和被氧化 至20％，然后通过使用亚氯酸钠进一步氧化并与点击物(tz或nb， 右条)缀合的vlvg材料的溶解度(％w/v)上限的条形图。图10 说明与未氧化的藻酸盐相比之下，氧化的vlvg材料可溶至至少50 ％w/v。
[0257]
图11a是显示使用tz和nb对mvg和vlvg材料实现的缀合 潜能的条形图。
[0258]
图11b是显示vlvg材料在515nm处的紫外-可见吸光度随tz 的摩尔当量变化的图。
[0259]
图12a是显示vlvg材料在不同取代度和恒定藻酸盐浓度(％ w/v)下储能模量(g')随时间增加的图。
[0260]
图12b是显示在不同取代度和恒定藻酸盐浓度(％w/v)下vlvg 材料的储能模量(g')的最大值(来自图13a)的条形图。
[0261]
图12c是显示由图13b中描绘的最大储能模量(g')得出的vlgg 材料在不同取代度和恒定藻酸盐浓度(％w/v)下的网孔尺寸值的条 形图。
[0262]
图12d是显示被氧化至10％氧化度、用氨硼烷还原且然后使用 250摩尔当量的nb和tz与nb或tz缀合的mvg材料在5％w/v、 10％w/v或15％w/v的还原的藻酸盐浓度下的储能模量(g')随时间 增加的图。
[0263]
图12e是显示被氧化至20％氧化度、用氨硼烷还原且然后使用 250摩尔当量的nb和tz与nb或tz缀合的mvg材料在5％w/v、 10％w/v、15％w/v或20％w/v的还原的藻酸盐浓度下的储能模量(g') 随时间增加的图。
[0264]
图12f是显示被氧化至20％氧化度、用氨硼烷还原且然后使用 1000摩尔当量的nb和tz与nb或tz缀合的lf 20/40材料在5％ w/v、10％w/v、15％w/v或20％w/v的还原的藻酸盐浓度下的储能模 量(g')随时间增加的图。
[0265]
图13a是显示荧光素缀合的胰岛素从使用具有不同点击缀合度 和恒定藻酸盐浓度(％w/v)的点击物缀合的vlvg材料产生的水凝 胶累积释放(以微克计)的图。
[0266]
图13b是显示图14a中曲线的对应于水凝胶形成期间2500摩尔 当量的nb或tz和5％浓度的alg-n和alg-t(2500eq 5％vlvg) 的非平台区和线性拟合的图。
[0267]
图13c是显示荧光素缀合的bsa从使用具有不同点击缀合度和 恒定藻酸盐浓度(％w/v)的点击物缀合的vlvg材料产生的水凝胶 累积释放(以微克计)的图。
[0268]
图13d是显示图14c中曲线的对应于水凝胶形成期间2500摩尔 当量的nb或tz以及5％浓度的alg-n和alg-t(2500eq 5％vlvg) 的非平台区和线性拟合的图。
[0269]
图13e是显示荧光素缀合的igg从使用具有不同点击缀合度和 恒定藻酸盐浓度(％w/v)的点击物缀合的vlvg材料产生的水凝胶 累积释放(以微克计)的图。
[0270]
图13f是显示图13e中曲线的对应于水凝胶形成期间2500摩尔当 量的nb或tz和5％浓度的alg-n和alg-t(2500eq 5％vlvg)的 非平台区和线性拟合的图。
[0271]
图13g是显示荧光素缀合的胰岛素、bsa和igg从通过ca
2+
介 导的交联产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图，在前1-3天内显 示显著的爆发释放(若未完全)。
[0272]
图14a是显示荧光素缀合的胰岛素从使用被氧化至5％或10％且 然后用ab还原处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸 盐产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0273]
图14b是显示荧光素缀合的胰岛素从使用被氧化至5％或10％且 然后用sc氧化处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸 盐产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0274]
图14c是显示荧光素缀合的igg从使用被氧化至5％或10％且然 后用ab还原处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸盐 产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0275]
图14d是显示荧光素缀合的igg从使用被氧化至5％或10％且然 后用sc氧化处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸盐 产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0276]
图15a是在0分钟、40分钟、21.5小时和67.5小时之后拍摄的 在2.3％戊二醛存在下含有与nb(左小瓶)和tz(右小瓶)缀合的 4％mvg材料的玻璃小瓶的一系列图片，其显示出显著的颜色变化， 表明点击部分的修饰。
[0277]
图15b是在0分钟、40分钟、20小时和69小时后拍摄的含有 作为对照的水(左小瓶)或与dbco(中间小瓶)或叠氮化物(右 小瓶)缀合的2％mvg材料的玻璃小瓶的一系列图片，其显示出显 著的颜色变化，表明点击部分的修饰。
[0278]
图16a是显示在pbs
++
(含有ca
2+
和mg
2+
离子的pbs缓冲液) 中50天期间内中性脂质体(dopc：胆固醇)从ca
2+
交联藻酸盐和 从非氧化的点击物缀合的藻酸盐累积释放(％负载)的图。
[0279]
图16b是显示在pbs
++
(含有ca
2+
和mg
2+
离子的pbs缓冲液) 中中性脂质体(dopc：胆固醇)从ca
2+
交联藻酸盐水凝胶、非氧化 的点击物缀合的藻酸盐水凝胶和点击明胶水凝胶累积释放(％负载) 的图。
[0280]
图16c是显示在28天期间内中性脂质体(dopc：胆固醇)从 以5％w/v藻酸盐浓度制备的ca
2+
交联藻酸盐和非氧化的点击物缀合 的藻酸盐水凝胶累积释放(％负载)的图。在作为不含ca
2+
或mg
2+
离子的pbs缓冲液的pbs
‑‑
中体外测量了脂质体释放曲线，并且证明 点击
缀合凝胶能够保留包封的脂质体(扩散受限)，而脂质体能够 扩散出钙交联凝胶。
[0281]
图16d是显示在8天期间内中性脂质体(dopc：胆固醇)从未 氧化的点击物缀合的藻酸盐水凝胶和点击物缀合的明胶水凝胶累积 释放(％负载)的图。第8天分别用藻酸盐裂解酶或胶原酶消化凝 胶以显示回收和质量平衡。
[0282]
图17a是包封在图17d中描绘的凝胶中的脂质体原料的动态光 散射(dls)迹线。
[0283]
图17b是如图17d所示8天后从用藻酸盐裂解酶消化的非氧化 的点击物缀合的藻酸盐水凝胶释放的脂质体的dls迹线，显示出与 存在于储备液中的脂质体的平均直径的最小差异。
[0284]
图17c是28天后从以pbs
—
缓冲液中5％w/v的藻酸盐浓度制备 的未氧化的点击物缀合的藻酸盐水凝胶释放的脂质体的dls迹线， 显示出与存在于储备液中的脂质体的平均直径的最小差异。
[0285]
图17d是8天后从胶原酶消化的点击物缀合的明胶水凝胶释放 的脂质体的dls迹线。
[0286]
图17e是3天后从pbs
—
缓冲液中制备的钙交联藻酸盐释放的脂 质体的dls迹线，显示出释放的脂质体比脂质体标准品更加多分散 且直径更大。
[0287]
图17f是28天后从以pbs
—
缓冲液中5％w/v的藻酸盐浓度制备 的钙交联水凝胶释放的脂质体的dls迹线，显示出释放的脂质体比 脂质体标准品更加多分散且直径更大。
[0288]
图18是显示在pbs中75天内脂质体从在点击缀合之前被氧化 至0％、5％和10％总氧化度并用ab还原处理的点击物缀合的藻酸 盐水凝胶累积释放(％负载)的图。
[0289]
图19a是含有包封脂质体的藻酸盐水凝胶和上清液的管在第0 天的图片。为了制备藻酸盐水凝胶，将藻酸盐氧化至20％，然后用 氨硼烷还原。将凝胶在柠檬酸钠缓冲液(ph5；左边两个小瓶)或硼 烷钠(ph9；右边两个小瓶)中于37℃下孵育。
[0290]
图19b是含有包封脂质体的藻酸盐水凝胶和上清液的管在第1 天的图片。为了制备藻酸盐水凝胶，将藻酸盐氧化至20％，然后用 氨硼烷还原。将凝胶在柠檬酸钠缓冲液(ph5；左边两个小瓶)或硼 烷钠(ph9；右边两个小瓶)中于37℃下孵育。
[0291]
图19c是含有包封脂质体的藻酸盐水凝胶和上清液的管在第7 天的照片。为了制备藻酸盐水凝胶，将藻酸盐氧化至20％，然后用 氨硼烷还原。将凝胶在柠檬酸钠缓冲液(ph5；左边两个小瓶)或硼 烷钠(ph9；右边两个小瓶)中于37℃下孵育。图片显示ph 9样品 在7天后降解，而ph 5样品仍然在一定程度上完整。
[0292]
图19d是包封脂质体的藻酸盐水凝胶和上清液的管在第14天的 图片。为了制备藻酸盐水凝胶，将藻酸盐氧化至20％，然后用氨硼 烷还原。将凝胶在柠檬酸钠缓冲液(ph5；左边两个小瓶)或硼烷钠 (ph9；右边两个小瓶)中于37℃下孵育。图像表明14天后样品在 ph 5和ph 9均降解。
[0293]
图19e是显示中性脂质体(dopc：胆固醇)从通过将藻酸盐氧 化至20％并随后将其用氨硼烷还原而产生的藻酸盐水凝胶的基于降 解的释放的图。样品在ph6.5的mes缓冲液中释放以模拟瘤周微环 境。
[0294]
图20a是挤出之前的dotap：hydro soy pc脂质体的dls迹线。
[0295]
图20b是挤出之后的dotap：hydro soy pc脂质体的dls迹 线。
[0296]
图20c是显示17天期间阳离子脂质体(图20a)从ca
2+
交联藻 酸盐和非氧化的点击
物缀合的藻酸盐水凝胶累积释放(％负载)的 图。图21b显示点击物交联的凝胶能够保留包封的脂质体(扩散受 限)，而脂质体能够扩散出钙交联凝胶。
[0297]
图21a是显示igf-1从使用各种藻酸盐组合物制备的点击物缀 合的藻酸盐水凝胶释放的图。
[0298]
图21b是显示vegf
165
从使用各种藻酸盐组合物制备的点击藻 酸盐水凝胶释放的图。
[0299]
图22是显示在不同藻酸盐浓度(％w/v)、氧化程度和用亚氯 酸钠或氨硼烷处理下各种藻酸盐溶液的相对粘度的条形图。数据显 示，与未经氧化的mvg的点击缀合不会导致粘度的实质性差异，而 在点击缀合至含有藻氧醇或藻氧羧酸盐的藻酸盐的情况下，粘度实 质性降低，并且与水的粘度相当(0.890cpa，25℃下)。
具体实施方式
[0300]
i.本发明的还原的和高度氧化的多糖
[0301]
本发明涉及包含还原的多糖的组合物，其中还原的多糖包含少 于2％的残余醛。本发明还涉及包含还原的多糖的组合物，其中还原 的多糖包含少于3％的残余醛，并且其中该多糖通过如下生成：使多 糖与二醇特异性氧化剂反应，由此产生包含以摩尔计15％或更多的 氧化度的氧化的多糖，随后使氧化的多糖与水溶性醛特异性还原剂 反应以产生还原的多糖。
[0302]
本发明组合物中包含的还原的多糖可用于制备水凝胶。这些多 糖是通过两步法生成的。第一步包括使多糖例如藻酸盐与二醇特异 性氧化剂反应以产生含醛的氧化的多糖，例如含醛的氧化的藻酸盐。 第二步包括进一步还原处理含醛的氧化的多糖以产生还原的多糖。 还原过程包括还原存在于氧化的多糖中的醛部分以产生醇部分。因 此，如本文所用，术语“还原的多糖”包括含有醇部分的多糖。在一 些实施方式中，还原的多糖的产生是通过使用二醇特异性氧化剂氧 化多糖以产生含醛的多糖；然后例如通过使用水溶性醛特异还原剂 对氧化的多糖进行还原处理以产生还原的多糖。在某些实例中，还 原的多糖包含具有开环醇的单体亚单元，所述开环醇具有以下结构：
[0303][0304]
如本说明书中使用的术语“多糖”是指由通过糖苷键连接在一起 的单糖单元链组成的任何聚合糖类分子。例如，藻酸盐是包含两种 不同的单体亚单位：β-d-甘露糖醛酸盐(m)和其c-5差向异构体α-l
‑ꢀ
古洛糖醛酸盐(g)的多糖，所述亚单位是(1-4)连接的。
[0305]
多糖链可以是直链或支链的。术语“多糖”还意在包括寡糖。多 糖可以是仅含有一种单体单元(例如葡萄糖)的均多糖或含有不同 种类单体单元(例如葡萄糖和果糖)的杂多糖。在一个实施方式中， 术语“多糖”是指含有二醇，即存在于相邻碳上的两个羟基的聚合
糖 类分子。含二醇的多糖的非限制性实例包括藻酸盐、普鲁兰多糖、 硬葡聚糖、壳聚糖、爱生兰、黄原胶、葡聚糖、甘露糖、结冷胶、 左聚糖、纤维素、透明质酸、硫酸软骨素a、硫酸软骨素c、硫酸 软骨素e和β-d-葡聚糖。
[0306]
在一个具体实施方式中，含二醇的多糖是藻酸盐聚合物。藻酸 盐聚合物由两种不同的单体单元：(1-4)-连接的β-d-甘露糖醛酸(m 单元)和αl-古洛糖醛酸(g单元)组成，所述单体单元可以沿着 聚合物链按比例和顺序分布而变化。藻酸盐聚合物是对二价阳离子 (例如ca
+2
、mg
+2
、ba
+2
)具有强亲和力，并在暴露于这些分子时 形成稳定水凝胶的聚电解质体系(参见martinsen a.等，biotech.& bioeng，33(1989)79-89)。例如，钙交联的藻酸盐水凝胶可用于牙 科应用、伤口敷料、软骨细胞移植和作为其他细胞类型的基质。不 希望受理论束缚，据信g单元优选使用钙交联进行交联，而基于点 击反应的交联相对于g单元或m单元是更加无差别的(即，g和m 单元均可通过点击化学来交联)。
[0307]
与术语“藻酸盐聚合物”可互换使用的术语“藻酸盐”包括未改性 的藻酸盐、氧化的藻酸盐(例如，包含一个或多个藻氧羧酸盐单体 单元)和/或还原的藻酸盐(例如，包含一个或多个藻氧醇单体单元)。 在一些实施方式中，氧化的藻酸盐包括含有一个或多个醛基的藻酸 盐，或含有一个或多个羧酸根基团的藻酸盐。在其他实施方式中， 氧化的藻酸盐包含高度氧化的藻酸盐，例如包含一个或多个藻氧羧 酸盐单元的高度氧化的藻酸盐。氧化的藻酸盐还可以包含相对少量 的醛基(例如，少于15％，例如14％、13％、12％、11％、10％、 9％、8％、7％、6％5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7 ％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少的醛基或氧化 度，以摩尔计)。术语“藻酸盐”或“藻酸盐聚合物”还可包括与如下所 述的至少一种点击试剂缀合的藻酸盐，例如未改性的藻酸盐、氧化 的藻酸盐或还原的藻酸盐。
[0308]
用于本发明上下文中的藻酸盐聚合物的平均分子量可为约 20kda至约500kda，例如约20kda至约40kda，约30kda至约70kda， 约50kda至约150kda，约130kda至约300kda，约230kda至约 400kda，约300kda至约450kda或约320kda至约500kda。在一个 实例中，可用于本发明的藻酸盐聚合物可具有约32kda的平均分子 量。在另一个实例中，可用于本发明的藻酸盐聚合物可具有约265kda 的平均分子量。在一些实施方式中，藻酸盐聚合物的分子量小于约 1000kda，例如小于约900kda，小于约800kda，小于约700kda，小 于约600kda，小于约500kda，小于约400kda，小于约300kda，小 于约200kda，小于约100kda，小于约50kda，小于约40kda，小于 约30kda或小于约25kda。在一些实施方式中，藻酸盐聚合物的分 子量为约1000kda，例如约900kda，约800kda，约700kda，约 600kda，约500kda，约400kda，约300kda，约200kda，约100kda， 约50kda，约40kda，约30kda或约25kda。在一个实施方式中，藻 酸盐聚合物的分子量为约20kda。
[0309][0310][0311]
"ggggrgdsp"公开为seq id no:12。
[0312]
多糖，例如含二醇的多糖如藻酸盐，可以在第一步中与二醇特 异性氧化剂反应。术语“二醇特异性氧化剂”是指与二醇部分(例如 存在于多糖中的二醇部分)特异性反应，并且不氧化也可存在于多 糖中的其他官能团(例如醇)的氧化剂。二醇特异性氧化剂的非限 制性实例包括高碘酸钠(naio4)、高碘酸(hio4)、四乙酸铅 (pb(oac)4)、仲高碘酸钠(na3h2io6)和高碘酸钾(kio4)。在 一个具体实施方式中，二醇特异性氧化剂是高碘酸钠(naio4)。
[0313]
二醇特异性氧化剂与二醇反应以裂解碳-碳键并产生两个醛部 分。在某些实施方
式中，该反应产生的氧化的多糖是至少约0.1％、 0.5％、1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30 ％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65 ％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99 ％或约100％氧化的。所列举值的中间范围也旨在是本发明的一部 分。例如，在某些实施方式中，该反应产生的氧化的多糖可以是约1 ％至约5％、约3％至约10％、约5％至约20％、约10％至约15％、 约12％至约25％、约15％至约30％、约20％至约25％、约25％至 约45％、约30％至约50％、约45％至约60％、约50％至约70％、 约55％至约75％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至 约90％或约85％至约100％氧化的。
[0314]
如本说明书通篇使用的术语“氧化的多糖”，例如“氧化的藻酸盐
”ꢀ
是指已被氧化，例如与氧化剂如二醇特异性氧化剂反应的多糖。氧 化的多糖例如藻酸盐，包含由多糖的氧化产生的醛部分。氧化的多 糖可为约0.1％至约100％氧化的，例如约0.1％至约5％、约1％至 约10％、约5％至约20％、约15％至约40％、约25％至约60％、 约40％至约70％、约55％至约90％或约75％至约100％氧化的。 在一些实施方式中，氧化的多糖可为小于约15％氧化的，例如小于 约14％、小于约13％、小于约12％、小于约11％、小于约10％、 小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小 于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.9％、小 于约0.8％、小于约0.7％、小于约0.6％、小于约0.5％、小于约0.4 ％、小于约0.3％、小于约0.2％或小于约0.1％氧化的。
[0315]
与术语“％摩尔氧化度”可互换使用的术语“％氧化度”或“％氧化 的”、“氧化水平”或“％氧化水平”是指单体亚单元在含二醇的多糖例 如藻酸盐中的％摩尔分数，所述多糖由于氧化而是开环的。在一些情 况下，多糖是已经与二醇特异性氧化剂如高碘酸钠反应的含二醇的 多糖。可用于测量多糖的％氧化度的方法是本领域普通技术人员已 知的，并且可以包括例如qnmr。
[0316]
例如，术语“％氧化度”可以有关于例如被二醇特异性氧化剂氧 化并且含有包含醛部分的开环单体亚单元的多糖而使用。以下显示 了例如藻酸盐中的这样的单体亚单元的一个实例：
[0317][0318]
术语“％氧化度”还可以有关于例如被二醇特异性氧化剂氧化， 且随后例如通过水溶性醛特异性还原剂而还原，并且含有包含醇部 分的开环单体亚单元的多糖而使用。以下显示了这样的单体亚单元 (例如藻氧醇)的一个实例：
[0319][0320]
术语“％氧化度”还可以有关于例如被二醇特异性氧化剂氧化， 且随后例如被第二氧化剂进一步氧化，并且含有包含羧酸部分的开 环单体亚单元的多糖而使用。以下显示了这样的单体亚单元(例如 藻氧羧酸盐)的一个实例：
[0321][0322]
如本文所用，术语“％醛”是指存在于多糖例如含二醇的多糖如 藻酸盐的开环单体亚单元中的醛的％摩尔分数。
[0323]
术语“％残余氧化度”、“残余氧化水平”、“％残余氧化水平”、“％ 残余摩尔氧化度”或“％残余醛”是指残余醛的％摩尔分数，所述残余 醛即为在如下所述的多糖与二醇特异性氧化剂反应且然后用醛特异 性水溶性还原剂还原以产生还原的多糖之后保留在多糖中的醛部 分。在一些实施方式中，还原的多糖(例如还原的藻酸盐)可包含 约0.01％至约3％的残余醛，例如约0.01％至约1％、约0.05％至约 1.5％或约1％至约3％的残余醛。例如，还原的多糖可包含约2％的 残余醛或约3％的残余醛。该术语还可以指残余醛的％摩尔分数，所 述残余醛即为在如下所述的多糖与二醇特异性氧化剂反应且然后例 如用第二氧化剂进一步氧化以产生高度氧化的多糖之后保留在多糖 中的醛部分。在一些实施方式中，高度氧化的多糖(例如高度氧化 的藻酸盐)可包含约0.01％至约3％的残余醛，例如约0.01％至约1 ％、约0.05至约1.5％或约1％至约3％的残余醛。例如，高度氧化 的多糖可以包含约2％的残余醛或约3％的残余醛。
[0324]
多糖的单体单元之间的示例性反应是藻酸盐和二醇特异性氧化 剂高碘酸钠之间的反应，其在方案1中示出：
[0325]
方案1.
[0326][0327]
在本发明方法的第二步中进一步还原处理含醛的氧化的多糖包 括含醛的氧化的多糖与醛特异性水溶性还原剂的反应。术语“醛特异 性水溶性还原剂”是指将醛(例如由于二醇特异性氧化剂的氧化而存 在于多糖中的醛)特异性氧化并将其转化为醇的还原剂。在某些实 施方式中，醛特异性水溶性试剂是无毒的和/或是绿色试剂。醛特异 性水溶性还原剂的非限制性实例包括硼氢化钠(nabh4)；氰基硼氢 化钠(nacnbh3)；催化剂如镍(ni)、铂(p1)或钯(pd)催化 剂存在下的氢气(h2)；氨硼烷(h3nbh3)；或硼烷复合物，例如 双碳酸盐硼烷复合物([(bh3)2co2]
2-·
2na
+
)，硼烷二甲胺复合物 [(ch3)2nh
·
bh3]；硼烷叔丁胺复合物[(ch3)3cnh2·
bh3]；或硼烷
‑ꢀ
嘧啶复合物。在一个具体实例中，醛特异性水溶性还原剂是氨硼烷。 在一个实施方式中，醛特异性水溶性还原剂不是硼氢化钠。
[0328]
方案2中例示了方案1中所示反应的产物氧化葡萄糖醛酸与水 溶性醛特异性还原剂氨硼烷的示例性反应。
[0329]
方案2.
[0330][0331]
在本发明的上下文中，术语“残余醛”是指用醛特异性水溶性还 原剂如氨硼烷完成对氧化的多糖如氧化的藻酸盐完成还原之后保留 在还原的多糖中的醛。存在于多糖中的醛的量，例如用水溶性醛特 异性还原剂还原后存在于多糖中的残余醛的量可以通过本领域技术 人员已知的任何方法测量。例如，可以通过定量nmr测量存在于多 糖中的残余醛的量，其中将藻酸盐(1.5％w/v)醛峰(》5.1ppm)的 积分与内标二甲基丙二酸(2.5mg/ml)进行比较，并且可以表示为 残余醛的％。
[0332]
本发明人惊奇地发现，水溶性醛特异性还原剂如氨硼烷对于还 原氧化的多糖如藻酸盐聚合物中存在的醛，并将其转化为醇而言是 特别有效的。因此，通过与水溶性醛特异性还原剂例如氨硼烷的反 应使氧化的多糖进一步还原处理而获得的还原的多糖含有出乎意料 的低残余醛水平。在一些实施方式中，还原的多糖含有少于2％的残 余醛，例如少
于1.5％、少于1％或少于0.5％的残余醛。在其他实施 方式中，还原的多糖含有少于3％残余醛，例如少于3％、少于2.5 ％、少于2％、少于1.5％、少于1％或少于0.5％的残余醛。
[0333]
希望在用于制备水凝胶的多糖如藻酸盐中具有低水平的醛，因 为醛能够对存在于多糖附近的蛋白质和其他分子造成损害，由此增 加水凝胶的毒性。另外，使用水溶性醛特异性还原剂是特别有利的， 因为这些试剂不产生有毒的副产物并且不需要进一步处理多糖物 质。水溶性醛特异还原剂如氨硼烷也是无毒的和/或被认为是“绿色试 剂”。
[0334]
本发明还利用高度氧化的多糖，例如高度氧化的藻酸盐聚合物。 这些高度带电的氧化的多糖比氧化的多糖更易溶于水，使得其操作 更简单。高度氧化的多糖可以分两步制备。如上所述，第一步包括 使多糖如藻酸盐聚合物与二醇特异性氧化剂反应以产生含醛的氧化 的多糖，例如含醛的氧化的藻酸盐聚合物。第二步包括对含醛的氧 化的多糖进一步氧化处理以产生高度氧化的多糖。氧化的多糖的进 一步氧化处理包括将存在于氧化的多糖中的醛部分转化为羧酸部 分。因此，如本文所用，术语“高度氧化的多糖”包括每单体亚单元 包含至少一个，例如两个另外的羧酸部分的多糖。例如，高度氧化 的多糖可以包含单体亚单元，其是含有开环羧酸的藻酸盐或具有以 下结构的藻氧羧酸盐：
[0335][0336]
含醛的氧化的多糖如藻酸盐聚合物的进一步氧化处理包括含醛 的氧化的多糖与第二氧化剂的反应。如本说明书中使用的术语“第二 氧化剂”是指将醛部分特异性转化为羧酸部分，从而产生高度氧化的 多糖的任何氧化剂。第二氧化剂的非限制性实例包括亚氯酸钠；溴； 稀硝酸(nho3)；氧化银，例如tollens试剂([ag(nh3)2]
+
或agno3)； 铜(ii)配合物，例如fehling试剂(酒石酸铜(ii)溶液)或benedict 试剂(柠檬酸铜(ii)溶液)；高锰酸钾(kmno4)；和过氧化氢(h2o2)。 在一个具体实施方式中，第二氧化剂是亚氯酸钠。
[0337]
多糖的氧化的单体单元的示例性反应是方案1中所示反应的产 物，即氧化的藻酸盐与第二氧化剂亚氯酸钠的反应，其示于方案3 中。
[0338]
方案3.
[0339]
[0340]
令人惊奇地发现，还原的多糖，例如由氧化的多糖与水溶性醛 特异性还原剂(例如氨硼烷)的反应得到的还原的多糖，例如包含 藻氧醇的多糖，以及高度氧化的多糖，例如由氧化的多糖与第二氧 化剂的反应得到的多糖，例如包含藻氧羧酸盐的多糖，以上二者均 特别可用于制备水凝胶。由还原的和高度氧化的多糖例如还原的和 高度氧化的藻酸盐聚合物制备的水凝胶是可生物降解的，并且可用 作药物递送载体。
[0341]
在一些实施方式中，还原的和/或高度氧化的多糖例如还原的和/ 或高度氧化的藻酸盐(例如包含藻氧醇和/或藻氧羧酸盐的藻酸盐) 的溶解度高于未改性的藻酸盐的溶解度。多糖如还原的和/或高度氧 化的多糖的溶解度可以以％w/v或以mg/ml表示，其中1％w/v相当 于10mg/ml的多糖。例如，还原的和/或高度氧化的多糖的溶解度可 以为约10-20％w/v，15-30％w/v，20-40％w/v，30-50％w/v，40-65 ％w/v，50-75％w/v或60-90％w/v。例如，本发明的还原的和/或高 度氧化的多糖的溶解度可以为约10％w/v，约15％w/v，约20％，约 25％w/v，约30％w/v，约35％w/v，约40％w/v，约45％w/v，约 50％w/v，约55％w/v，约60％w/v，约65％w/v，约70％w/v，约75 ％w/v，约80％w/v或约90％w/v。
[0342]
在一些实施方式中，本发明的多糖是可生物降解的。例如，氧 化的、还原的和高度氧化的藻酸盐是可生物降解的。藻酸盐，例如 氧化的、还原的和高度氧化的藻酸盐不易被宿主内源性酶(如可能 存在于人体中的内源性酶)降解。藻酸盐，例如氧化的、还原的和 高度氧化的藻酸盐可以在暴露于酸性或碱性条件下时发生化学降 解，例如水解。酸性条件包含6.5或更低的ph，而碱性条件包含8 或更高的ph。
[0343]
ii.缀合至点击试剂的本发明多糖
[0344]
本发明的还原的和高度氧化的多糖例如藻酸盐可以与点击试剂 缀合。在本说明书中与术语“点击化学试剂”可互换使用的术语“点击 试剂”是在温和条件下在水溶液中能够快速并选择性地与其对应的 点击试剂反应(“点击”)的试剂。温和条件包括中性ph，水溶液和 环境温度，连同低反应物浓度。示例性的点击成对试剂对于本领域 技术人员而言是公知的，并且包括但不限于具有下示结构的叠氮化 物和二苯并环辛炔(dbco)、四嗪和反式环辛烯以及四嗪和降冰片 烯。
[0345]
[0346]
在一些实施方式中，点击试剂是四嗪(tz)。如本文所用，术 语“四嗪”和“四嗪部分”包括以下分子，该分子包含被用于连接至聚合 物的合适间隔基(例如，烷基胺如甲胺或戊胺)取代，且任选还被 一个或多个取代基在任何可用位置取代的1,2,4,5-四嗪。适用于本公 开的组合物和方法的示例性四嗪部分包括但不限于以下所示的结构 (参见例如karver等，(2011)bioconjugate chem.22:2263-2270和 wo2014/065860，其各自的全部内容通过引用并入本文)：
[0347][0348]
四嗪的配对试剂之一是降冰片烯(nb)。如本文所用，术语“降 冰片烯”和“降冰片烯部分”包括但不限于降冰片二烯和降冰片烯基 团，所述基团还包含用于连接至多糖的合适间隔基(例如，烷基胺 如甲胺或戊胺)，且任选还被一个或多个取代基在任何可用位置上 取代。这样的部分包括例如降冰片烯-5-甲胺和降冰片二烯甲胺。
[0349]
点击试剂通常通过羧基部分缀合至多糖如藻酸盐。在图1a所示 的一个具体实例中，点击试剂可以通过藻酸盐中存在于葡糖醛酸中 的羧酸酯部分与藻酸盐聚合物缀合。因此，在未处理的藻酸盐中， 每个葡萄糖醛酸酯可以缀合一个点击分子。用高碘酸钠氧化藻酸盐 后，每个葡萄糖醛酸酯产生两个醛。每个醛部分可以通过亚胺键与 点击试剂缀合(图1b)。点击试剂与氧化的藻酸盐的这种缀合是次 优的，因为在缀合后残留在藻酸盐中的残余醛可能对货物造成毒性 和损害，并造成点击试剂的降解(也参见实施例1和3)。此外，醛 和点击试剂之间的亚胺键易于水解，导致点击试剂从藻酸盐损失。 如图1c中所示，存在于氧化的藻酸盐中的醛的进一步氧化将这些醛 转化为羧酸，从而为点击缀合提供了两个另外的位点。
[0350]
已经令人惊讶地发现，某些高度氧化的多糖如高度氧化的藻酸 盐聚合物相比于氧化的多糖是用于点击试剂缀合的更好的底物，因 为它们含有可用于点击缀合的额外位点。还发现还原的多糖如还原 的藻酸盐相比于氧化的多糖更好地适合于点击试剂缀合，因为它们 含有较少量的可与点击试剂反应而造成其降解的醛。
[0351]
在一些实施方式中，与本发明的多糖例如藻酸盐缀合的点击试 剂也可以与其配对的点击试剂反应，所述配对的点击试剂进而又与 一个部分连接，从而使该部分与多糖缀合。使用点击试剂可将任何 部分缀合至本发明的多糖。这样的部分的非限制性实例包括小有机 分子，小无机分子；糖精；单糖；二糖；三糖；寡糖；多糖；肽； 蛋白质，肽类似物，肽衍生物；拟肽；抗体(多克隆或单克隆)； 抗体的抗原结合片段；核酸，例如寡核苷酸，反义寡核苷酸，sirna， shrna，核酶，适体，microrna，前microrna，irna，质粒dna (例如缩合质粒dna)，改性rna和核酸类似物或衍生物。在一 些实施方式中，该部分是治疗剂。
[0352]
在其他实施方式中，缀合至本发明的多糖如藻酸盐的点击试剂 可以用作交联剂，如下面详细描述的。
[0353]
在某些实施方式中，本发明的多糖如藻酸盐可以缀合至两种或 更多种属于不同点击对的点击试剂。例如，在其中本发明的多糖缀 合至属于两种不同点击对的两种点击试剂的实施方式中，缀合至多 糖的第一点击试剂可以是来自叠氮化物-二苯并环辛炔(叠氮化物
ꢀ‑
dbco)点击对的叠氮化物，并且缀合至多糖的第二点击试剂可以 是来自四嗪-降冰片烯点击对的四嗪。在这样的多糖中，两种点击试 剂可以用于不同的功能。例如，如上所述，第一点击试剂可用于促 进多糖的交联以形成水凝胶，并且第二交联剂可用于将一个部分缀 合至多糖。在一个具体实施方式中，当本发明的多糖与两种或更多 种点击试剂缀合时，与多糖缀合的点击试剂不交叉反应，即不彼此 反应，而是仅与它们的点击对反应。
[0354]
iii.缀合至交联剂的本发明多糖
[0355]
本发明的还原的和高度氧化的多糖可以与交联剂缀合。交联剂 可以离子地、共价地或物理地连接至氧化的多糖。在一个实施方式 中，交联剂共价或非共价连接至本发明的还原的多糖，例如还原的 藻酸盐聚合物。在另一个实施方式中，交联剂共价或非共价连接至 本发明的高度氧化的多糖，例如高度氧化的藻酸盐聚合物。
[0356]
如在本说明书中使用的术语“交联剂”是可影响和促进多糖交联 至特定位置(如受试者细胞或组织内的位置)，或可以促进多糖例 如藻酸盐聚合物的交联的任何试剂。在某些实施方式中，交联剂例 如通过共价键与多糖连接。在某些实施方式中，交联剂仅与一个聚 合物链偶联并用作侧基。
[0357]
在一些实施方式中，交联剂是点击试剂。可用于交联本发明多 糖的示例性的点击试剂对包括但不限于具有如上所示结构的叠氮化 物和二苯并环辛炔(dbco)，四嗪和反式环辛烯以及四嗪和降冰片 烯。
[0358]
用点击试剂修饰的本发明的还原的和/或高度氧化的多糖，例如 缀合至点击试剂的藻酸盐，可以共价交联以形成点击交联的水凝胶， 例如点击藻酸盐水凝胶。通过点击化学形成水凝胶描述于desai等 (2015)biomaterials 50:30-37中，其全部内容在此通过引用并入本文。 交联反应之前已被其他人表明为具有高度特异性、生物正交性和快 速性(参见例如devaraj等(2008),bioconjugate chem. 19(12):2297-2299；karver(2011)bioconjugate chem. 22(11):2263-2270；和alge等(2013)biomacromol.14(4)：949-953)， 允许并入具有高包封后生存力的细胞。
[0359]
例如，为了从本发明的点击物缀合的多糖例如包含藻氧醇和/或 藻氧羧酸盐的点击物缀合的藻酸盐生成水凝胶，与点击对的一个成 员如nb缀合的多糖可以与缀合至点击对的第二成员如tz的多糖混 合，并在温和条件下孵育以产生水凝胶。这样的水凝胶的性质，例 如水凝胶的硬度、凝胶化时间或水凝胶的平均孔径可以通过改变多 种参数来调节，所述参数包括多糖的点击缀合度；多糖氧化度，即 存在于多糖中的％残余醛；和在水凝胶形成过程中点击物缀合的多糖 的浓度，例如即将形成水凝胶之前存在于溶液中的藻酸盐物质的％ w/v。
[0360]
可与术语“取代度”或“ds”互换使用的术语“点击缀合度”是指多 糖的每个单体单元的点击试剂的平均数目，例如藻酸盐中每个单体 单元的点击试剂的平均数目。点击取代度可以通过改变点击缀合反 应中点击试剂对藻酸盐单体摩尔数的摩尔当量数而变化。例如，点 击缀合反应可包含约1至约5000摩尔当量的点击试剂，例如约1、 约5、约10、约20、约50、约100、约150、约200、约250、约300、 约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、
约700、 约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1200、约1500、 约1800、约2000、约2200、约2500、约2800、约3000、约3200、 约3500、约4000、约4200、约4500或约5000摩尔当量的点击试剂。 所列举值的中间范围也旨在是本发明的一部分。例如，点击缀合反 应可以包含约1至约50、约10至约100、约150至约250、约200 至约500、约400至约800、约700至约1000、约1200至约1600、 约1500至约2000、约1800至约3500、或约3200至约5000摩尔当 量的点击试剂。
[0361]
在一些实施方式中，与点击试剂缀合的本发明多糖包含约0.01 ％至约100％，例如约0.01％至约0.5％、约0.1％至约5％、约1％ 至约10％、约5％至约15％、约10％至约20％、约15％至约25％、 约20％至约35％、约30％至约40％、约35％至约50％、约40％ 至约60％、约50％至约75％、约70％至约90％或约85％至约100 ％的点击取代度。例如，与点击试剂缀合的本发明多糖可以为约0.01 ％，约0.05％，约0.1％，约0.5％，约1％，约5％，约10％，约 15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约 50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约 85％，约90％，约95％或约100％。
[0362]
在一些实施方式中，水凝胶形成过程中点击缀合的多糖的浓度， 例如即将形成水凝胶前存在于溶液中的藻酸盐物质的浓度可为约 0.01％至约50％w/v，例如约0.01％至约10％w/v，约0.1％至约5％ w/v，约1％至约15％w/v，约10％至约30％w/v，约12％至约35％ w/v，约15％至约25％w/v，约20％至约45％w/v或约35％至约50 ％w/v。例如，即将形成水凝胶之前存在于溶液中的藻酸盐物质的浓 度可以为约0.01％，约0.05％，约1％，约0.5％，约1％，约2％， 约3％，约4％，约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约 30％，约35％，约40％，约45％或约50％。
[0363]
水凝胶的刚度可取决于点击取代度，并且可通过测量弹性模量 (或储能模量)g'来确定。例如，当在1hz下在1％应变下测量时， 本发明水凝胶的g'可从约0至约40000pa变化，例如约0至约100pa， 约50至约300pa，约100至约450pa，约130至约600pa，约300 至约450pa，约500至约900pa，约600至约1500pa，约1200至约 2000pa或约1900至约40000pa。例如，当在1hz下在1％应变下测 量时，本发明水凝胶的g
′
可为约100pa，约200pa，约500pa，约 1000pa，约1500pa，约2000pa，约2200pa，约2500pa或约3000pa。
[0364]
在一些实施方式中，交联剂是肽，例如细胞粘附肽。因此，本 发明的还原的和/或高度氧化的多糖，例如还原的和/或高度氧化的藻 酸盐聚合物，可以通过细胞粘附肽如细胞外细胞基质(ecm)组分 进行修饰。细胞粘附肽可以包含例如氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬 氨酸(rgd)。实例包括氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱 氨酸(rgdc)(seq id no：1)和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨 酸(rgds)(seq id no：2)。在其他实例中，细胞粘附肽包含 赖氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸(kqagdv) (seq id no：3)或缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸(vapg)(seqid no：4)的氨基酸序列。在一些实例中，细胞粘附肽是 cggggrgdsp(seq id no：5)。其他细胞粘附肽可以基于期望 的应用而使用，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
[0365]
在一些情况下，细胞粘附肽通过巯基-烯反应，例如通过巯基
‑ꢀ
烯光化学共价连接至还原的和/或高度氧化的多糖。例如，在多糖交 联以形成水凝胶之前或之后，细胞粘附肽可以与多糖(例如藻酸盐 聚合物)共价连接。巯基-烯反应将细胞粘附肽共价连接至多糖的这 种用途比先前公开的方法(如使用羧基活化剂(例如edc)以将肽 偶联至聚合物的方法)
显著更快和更有效。
[0366]
iv.本发明的水凝胶
[0367]
本文所述的还原的和/或高度氧化的多糖可用于制备用于治疗应 用的水凝胶。与由氧化的多糖例如氧化的藻酸盐制备的水凝胶相比， 由还原的和/或高度氧化的多糖例如还原的和/或高度氧化的藻酸盐 制备的水凝胶是可生物降解的且无毒的。在一些实施方式中，当使 用本发明的还原的和/或高度氧化的多糖制备的水凝胶包封细胞时， 与由氧化的多糖制备的水凝胶相比，观察到更少的细胞毒性。在其 中由本发明的还原的和/或高度氧化的多糖产生的水凝胶用于包封治 疗剂例如蛋白质的其他实施方式中，与由氧化的多糖制备的水凝胶 相比，观察到更少的蛋白质损伤。在其中由本发明的还原的和/或高 度氧化的多糖产生的水凝胶用于包封基于脂质的纳米颗粒例如脂质 体或病毒体的实施方式中，基于脂质的纳米颗粒完整地递送至宿主 内的期望位置。
[0368]
本发明的水凝胶可用于制备包含由本发明的水凝胶包封的治疗 剂或诊断剂的剂型。本发明的水凝胶还可用于制备可包含治疗剂或 诊断剂的可植入装置。本发明的水凝胶还可用于制备药物递送组合 物，所述药物递送组合物包含包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳 米颗粒例如脂质体或病毒体，以及包封该基于脂质的纳米颗粒的本 发明的水凝胶。
[0369]
目前发现，本发明的还原的和/或高度氧化的多糖可用于制备其 中作为平均孔径测量的平均目径在相对宽的范围内变化的水凝胶。 例如，使用本发明的还原的和/或高度氧化的多糖制备的水凝胶所具 有的孔的平均直径范围可为约0.5nm至约500nm，例如约0.5nm至 约1nm，约0.5nm至约5nm，约1nm至约20nm，约10nm至约50nm， 约25nm至约80nm，约50nm至约100nm，约70nm至约150nm，约 100nm至约250nm，约200nm至约350nm，约250nm至约400nm或 约350nm至约500nm。在一些实施方式中，本发明的水凝胶所具有 的孔的平均直径可为约0.5nm，约1nm，约5nm，约10nm，约15nm， 约20nm，约25nm，约30nm，约35nm，约40nm，约45nm，约50nm， 约55nm，约60nm，约65nm，约70nm，约75nm，约80nm，约85nm， 约90nm，约95nm，约100nm，约150nm，约200nm，约250nm， 约300nm，约350nm，约400nm，约450nm或约500nm。所列举值 的中间范围也旨在为本发明的一部分。
[0370]
在一个实例中，本发明的水凝胶具有出乎意料的小平均孔径， 例如约10nm或更小的平均直径。在一些实施方式中，本发明的水凝 胶中孔的直径为约10.00nm或更小，约9.5nm或更小，约9.0nm或 更小，约8.5nm或更小，约8.0nm或更小，约7.5nm或更小，约7.0nm 或更小，约6.5nm或更小，约6.0nm或更小，约5.5nm或更小，约 5.0nm或更小，约4.5nm或更小，约4.0nm或更小，约3.5nm或更小， 约3.0nm或更小，约2.5nm或更小，约2.0nm或更小，约1.5nm或 更小或者约1nm或更小。例如，本发明的水凝胶可以包含平均直径 为约10nm至约1nm、约10nm至约4nm、约7nm至约3nm、约5nm 至约1nm、约4nm至约2nm、或约3nm至约0.5nm的孔。所列举值 的中间范围也旨在为本发明的一部分。
[0371]
因此，本发明的水凝胶可用于包封治疗剂或诊断剂，或者包封 包含小分子量的治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒如脂质体或 病毒体。例如，本发明的水凝胶可以用于包封治疗剂或诊断剂或基 于脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体，所述基于脂质的纳米颗粒包 封治疗剂或诊断剂如多肽，所述多肽的分子量为1000kda或者更小， 例如950kda或更小，900kda或更小，850kda或更小，800kda或更 小，750kda或更小，700kda或更小，650kda或
更小，600kda或更 小，550kda或更小，500kda或更小，450kda或更小，400kda或更 小，350kda或更小，300kda或更小，250kda或更小，200kda或更 小，150kda或更小，100kda或更小，90kda或更小，80kda或更小， 70kda或更小，60kda或更小，50kda或更小，40kda或更小，30kda 或更小，20kda或更小，10kda或更小，8kda或更小，6kda或更小， 4kda或更小，2kda或更小，1kda或更小，0.8kda或更小，0.6kda 或更小，0.4kda或更小，0.2kda或更小，或者0.1kda或更小。
[0372]
在一些实施方式中，可由本发明的水凝胶包封的，或由本发明 的水凝胶包封的基于脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体包封的治疗 剂或诊断剂不会扩散通过水凝胶的孔，因为水凝胶的孔与治疗剂的 尺寸相比足够小。因此，当受试者体内的水凝胶生物降解时，逐渐 发生自水凝胶中释放治疗剂。这提供了治疗剂或诊断剂，或者包封 治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体在受试者 如人中的持续释放。
[0373]
如本文所用，由本发明的水凝胶包封的术语“治疗剂或诊断剂
”ꢀ
包括可用于治疗、预防或诊断有需要的受试者中的病症的任何药剂。 治疗剂或诊断剂可以是细胞，例如哺乳动物细胞如人间充质干细胞 (hmsc)、小分子或生物制剂。生物制剂可以是肽、蛋白质、dna 分子、rna分子、pna分子、抗体或疫苗。示例性的治疗剂包括但 不限于在以下中出现的治疗剂：哈里森内科学原理(harrison’sprinciples of internal medicine)，第13版，t.r.harrison等编， mcgraw-hill n.y.，ny；医师参考手册(physicians'desk reference)， 第50版，1997，oradell new jersey，medical economics co.；治疗 的药理学基础(pharmacological basis of therapeutics)，第8版， goodman和gilman，1990；美国药典(united states pharmacopeia)， 国家处方集(the national formulary)，usp xii nf xvii，1990； goodman和oilman的治疗学的药理学基础的最新版；和默克索引 (merck index)的最新版，所有这些的全部内容通过引用并入本文。
[0374]
在一些实施方式中，由本发明的水凝胶包封的，或由本发明的 水凝胶包封的基于脂质的纳米颗粒例如脂质体或病毒体包封的治疗 剂或诊断剂可包含选自以下的化合物：小有机分子、小无机分子； 糖精；单糖；二糖；三糖；寡糖；多糖；肽；蛋白质；肽类似物； 肽衍生物；拟肽；抗体(多克隆或单克隆)；抗体的抗原结合片段； 核酸，例如寡核苷酸、反义寡核苷酸、sirna、shrna、核酶、适体、 microrna、前microrna、irna、质粒dna(例如缩合质粒dna)、 改性rna、核酸类似物或衍生物；由生物材料如细菌、植物、真菌 或动物细胞制成的提取物；动物组织；天然存在或合成的组合物； 及其任何组合。核酸可以包含一种或多种非天然核苷酸。肽或蛋白 质可以包含一种或多种非天然氨基酸。
[0375]
如本文所用，术语“小分子”可以指“天然产物样”的化合物，然而， 术语“小分子”不限于“天然产物样”化合物。而是，小分子的典型特征 在于其含有若干碳-碳键，并且具有小于5000道尔顿(5kd)、优选 小于3kd、还更优选小于2kd、最优选小于1kd的分子量。在一些 情况下，优选小分子具有等于或小于700道尔顿的分子量。
[0376]
如本文所用，术语“肽”以其最广泛的含义用来指含有氨基酸、 氨基酸等价物或其他非氨基，同时仍保持所需的肽功能活性的化合 物。通过用相关的有机酸(例如paba)、氨基酸等取代一个或多 个氨基酸，或者取代或修饰侧链或官能团，肽等价物可以与常规肽 不同。肽可以是线性或环状的。肽可经修饰以包括以下中的一种或 多种：d-氨基酸、β-氨基酸、化学改性的氨基酸、天然存在的非成 蛋白性氨基酸、稀有氨基酸，和具有本领域已知为
氨基酸特性的性 质的化学合成化合物。
[0377]
如本文所用，术语“核酸”或“寡核苷酸”意指共价连接在一起的至 少两个核苷酸，包括其类似物或衍生物。示例性的寡核苷酸包括但 不限于单链和双链sirna和其他rna干扰试剂(rnai试剂或irna 试剂)、shrna(短发夹rna)、反义寡核苷酸、适体、核酶和microrna (mirna)。核酸可以是单链或双链的。核酸可以是dna、rna或 杂交体，其中核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合， 以及尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的任何组合。rna 分子可以选自mrna、rnai、sirna、shrna、microrna、isrna、 lncrna和反义rna。
[0378]
核酸还可以包含一种或多种非天然核苷酸。例如，核酸可以包 含本领域已知的一种或多种核酸修饰。例如，核酸可包含一种或多 种骨架修饰，例如磷酰胺(beaucage等，tetrahedron 49(10):1925(1993) 及其中的参考文献；letsinger，j.org.chem.35:3800(1970))、硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯、o-甲基亚磷酰胺键(参见eckstein， oligonucleotides and analogues:a practical approach，牛津大学出版 社)或肽核酸键(参见egholm，j.am.chem.soc.114:1895(1992))；meier等，chem.int.ed.engl.31:1008(1992)；和nielsen，nature, 365:566(1993)，所有这些的全部内容通过引用并入本文。核酸还可 以包括对核苷酸的核碱基和/或糖部分的修饰。在糖部分的示例性糖 修饰包括用卤素(例如氟)、o-甲基，o-甲氧基乙基、nh2、sh和 s-甲基取代2
’‑
oh。
[0379]
在一些实施方式中，术语“治疗剂或诊断剂”包含生物材料，例 如细胞外基质材料如纤连蛋白，玻连蛋白和层粘连蛋白；细胞因子； 生长因子；分化因子，核酸；蛋白质；肽；抗体或其片段或其抗原 结合部分，或细胞。
[0380]
可并入本发明水凝胶中的合适的生长因子和细胞因子包括但不 限于干细胞因子(scf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞 巨噬细胞刺激因子(gm-csf)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子、 vegf、tgfβ、血小板衍生生长因子(pdgf)、血管生成素(ang)、 表皮生长因子(egf)、bfgf、hnf、ngf、骨形态发生蛋白(bmp)、 成纤维细胞生长因子(fgf)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子 (igf-1)、白介素(il)-3、il-1α、il-1β、il-6、il-7、il-8、il-11 和il-13、集落刺激因子、血小板生成素，促红细胞生成素、fit3-配 体和肿瘤坏死因子α(tnfα)。其他实例描述于以下中：dijke等，
ꢀ“
growth factors for wound healing”，bio/technology,7:793-798 (1989)；mulder gd，haberer pa，jeter kf编，clinicians'pocket guideto chronic wound repair，第4版，springhouse,pa：springhouse公 司；1998:85；ziegler t.r.，pierce，g.f.和herndon，d.n.，1997， international symposium on growth factors and wound healing:basicscience&potential clinical applications(boston，1995，seronosymposia usa)，出版商：springer verlag。
[0381]
可并入本发明的水凝胶中或并入由本发明的水凝胶包封的基于 脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体中的治疗剂或诊断剂的实例包括 但不限于麻醉性镇痛药；金盐；糖皮质激素；激素；抗疟药物；吲 哚衍生物；用于关节炎治疗的药物；抗生素，包括四环素、青霉素、 链霉素和金霉素；抗蠕虫药和犬瘟热药，应用于家畜和大型牛，例 如吩噻嗪；基于硫的药物，例如亚硫唑；抗肿瘤药物；监督成瘾的 药物，如控制酒精成瘾的药物和控制烟草成瘾的药物；药物成瘾的 拮抗剂，如美沙酮；体重控制药物；甲状腺控制药物；止痛药；控 制受精的药物或避孕激素；安非他明；抗高血压药物；抗炎剂；镇 咳药；镇静药；神经肌肉松弛剂；抗癫痫药物；抗抑郁药；抗心律 失常药物；血管舒张药物；抗高血压利尿剂；抗糖尿病药物；
抗凝 血剂；抗结核药物；抗精神病药物；激素和肽。应当理解的是，以 上清单并不完整，并且简单地表示可能包含在组合物中的治疗剂的 广泛多样化。在一些实施方式中，治疗剂是米托蒽醌、肽、多克隆 抗体、单克隆抗体、抗体的抗原结合片段、蛋白质(例如vegf)或 质粒dna。
[0382]
本领域普通技术人员将认识到可并入本发明的水凝胶中或者并 入由本发明的水凝胶包封的基于脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体 中的许多其他治疗剂或诊断剂。实例包括放射增敏剂、类固醇、黄 嘌呤、β-2-激动剂支气管扩张剂、抗炎剂、镇痛剂、钙拮抗剂、血管 紧张素转换酶抑制剂、β-阻断剂、中枢活性α-激动剂、α-1-拮抗剂、 抗胆碱能/抗痉挛剂、加压素类似物、抗心律不齐药、抗帕金森病药、 抗心绞痛/抗高血压药、抗凝血剂、抗血小板药、镇静剂、溶菌剂、 肽药剂、生物聚合物剂、抗肿瘤剂、轻泻剂、止泻剂、抗微生物剂、 抗真菌剂、疫苗、蛋白质或核酸。在另一个方面中，药物活性剂可 以是香豆素、白蛋白、类固醇如倍他米松、地塞米松、甲基泼尼松 龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、布地奈德、氢化可的松和药学 上可接受的氢化可的松衍生物；黄嘌呤如茶碱和多索茶碱；β-2-激动 剂支气管扩张药，例如沙丁胺醇、酚丙喘宁(fenterol)、克仑特罗、 班布特罗、沙美特罗、非诺特罗；抗炎剂，包括抗哮喘抗炎剂、抗 关节炎抗炎剂和非甾体抗炎剂，其实例包括但不限于硫化物、美沙 拉嗪、布地奈德、沙雷佐平、双氯芬酸、药学上可接受的双氯芬酸 盐、尼美舒利、萘普生、对乙酰氨基酚、布洛芬、酮洛芬和吡罗昔 康；止痛剂如水杨酸盐；钙通道阻滞剂如硝苯地平、氨氯地平和尼 卡地平；血管紧张素转换酶抑制剂如卡托普利、盐酸贝那普利、福 辛普利钠、群多普利、雷米普利、赖诺普利、依那普利、盐酸喹那 普利和盐酸莫昔普利；β-阻断剂(即β-肾上腺素能阻断剂)如盐酸 索他洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸艾司洛尔、卡替洛尔、盐酸普萘 洛尔、盐酸倍他洛尔、硫酸喷托洛尔、酒石酸美托洛尔、琥珀酸美 托洛尔、盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、吲哚洛尔和富马酸比索洛尔； 中枢活性的α-2-激动剂如可乐定；α-1-拮抗剂如多沙唑嗪和哌唑嗪； 抗胆碱能/抗痉挛剂如盐酸双环胺、氢溴酸东莨菪碱、格隆溴铵、克 利溴铵、黄酮哌酯和奥昔布宁；加压素类似物如加压素和去氨加压 素；抗心律失常药，例如奎尼丁、利多卡因、盐酸托克奈德、盐酸 美西律、地高辛、盐酸维拉帕米、盐酸普罗帕酮、乙酸氟卡尼、盐 酸普鲁卡因酰胺、盐酸莫雷西嗪和磷酸丙吡胺；抗帕金森病药，例 如多巴胺、l-多巴/卡比多巴、司来吉兰、二氢麦角隐亭、培高利特、 麦角乙脲、阿扑吗啡和溴隐亭；抗心绞痛药和抗高血压药，例如单 硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、普萘洛尔、阿替洛尔和维拉帕米； 抗凝血剂和抗血小板药如香豆素、华法林、乙酰水杨酸和噻氯匹定； 镇静剂如苯并二氮卓和巴比妥类；解痉剂，如劳拉西泮、溴西泮和 地西泮；肽和生物聚合物剂如降钙素、亮丙瑞林和其他lhrh激动 剂、水蛭素、环孢菌素、胰岛素、生长抑素、普罗瑞林、干扰素、 去氨加压素、生长激素、胸腺五肽、匹多莫德、促红细胞生成素、 白细胞介素、褪黑激素、粒细胞/巨噬细胞-csf和肝素；抗肿瘤药物， 例如依托泊苷、磷酸依托泊苷、环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、 长春新碱、阿霉素、顺铂、羟基脲、亚叶酸钙、他莫昔芬、氟他胺、 天冬酰胺酶、六联胺、米托坦和盐酸丙卡巴肼；轻泻剂如番泻叶浓 缩液、菊蒿醇、比沙可啶和吡硫酸钠；止泻剂，如盐酸菲诺烯 (difenoxine hydrochloride)，盐酸洛哌丁胺、呋喃唑酮、盐酸苯乙 哌啶和微生物；疫苗如细菌和病毒疫苗；抗菌剂如青霉素、头孢菌 素和大环内酯，抗真菌剂如咪唑和三唑衍生物；和核酸如编码生物 蛋白质的dna序列和反义寡核苷酸。
[0383]
抗癌剂包括烷化剂、铂剂、抗代谢剂、拓扑异构酶抑制剂、抗 肿瘤抗生素、抗有丝分裂剂、芳香酶抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、 dna拮抗剂、法尼基转移酶抑制剂、泵抑制剂、组蛋白乙酰转移酶 抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、核糖核苷还原酶抑制剂、tnfα激动剂 /拮抗剂、内皮素a受体拮抗剂、视黄酸受体激动剂、免疫调节剂、 激素和抗激素剂、光动力剂和酪氨酸激酶抑制剂。
[0384]
抗生素包括氨基糖苷类(例如庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、 链霉素、阿米卡星、新霉素)、杆菌肽、碳青霉烯类(例如亚胺培 南/西司他丁)、头孢菌素、粘菌素、乌洛托品、单环胺(例如氨曲 南)、青霉素(例如，青霉素g、青霉素v、甲氧西林、纳他西林、 苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉 素、替卡西林、哌拉西林、美洛西林、阿洛西林)、多粘菌素b、 喹诺酮类和万古霉素；和抑菌剂例如氯霉素、克林霉素、大环内酯 类(例如红霉素，阿奇霉素，克拉霉素)、林可霉素、呋喃妥因、 磺胺类、四环素类(例如四环素、多西环素、米诺环素、去甲环素) 和甲氧苄啶。还包括甲硝哒唑、氟喹诺酮类和利托菌素。
[0385]
酶抑制剂是抑制酶促反应的物质。酶抑制剂的实例包括：氯化 埃坡平、n-甲基膦氯吡啶、溴化新斯的明、毒扁豆碱硫酸盐、他克 林、他克林、1-羟基马来酸盐、碘抗结核菌素、对溴四甲基茴香醚、 盐酸10-(α-二乙氨基丙酰)-吩噻嗪、氯化卡米达佐、密胆碱-3,3,5-二 硝基邻苯二酚、二酰基甘油激酶抑制剂i、二酰基甘油激酶抑制剂ii、 3-苯基炔丙基胺、n
°‑
单甲基-醋酸l精氨酸、卡比多巴、3-羟基苄基 肼、肼苯哒嗪、氯吉兰、司来吉兰、羟胺、异烟酰磷酸酯、6-meo
‑ꢀ
四氢-9h-吡啶并吲哚、尼亚拉胺、帕吉林、奎纳克林、氨基脲、反 苯环丙胺、n,n-二乙基氨基乙基-2,2-二苯基戊酸酯盐酸盐、3-异丁基
ꢀ‑
1-甲基蒽、罂粟碱、吲哚美辛、2-环辛基-2-羟基乙胺盐酸盐、2,3
‑ꢀ
二氯-α-甲基苄胺(dcmb)、8,9-二氯-2,3,4,5-四氢-1h-2-苯并氮杂盐 酸盐、对氨基丁二酰亚胺、对氨基苯乙哌啶酮酒石酸盐、3-碘酪氨酸、 α-甲基酪氨酸、乙酰唑胺、二氯苯酰胺、6-羟基-2-苯并噻唑磺酰胺 和别嘌呤醇。
[0386]
抗组胺剂包括吡拉明、氯苯那敏和四氢唑啉等。
[0387]
抗炎剂包括皮质类固醇、非类固醇抗炎药(例如阿司匹林、保 泰松、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、布洛芬、吡罗昔康和芬那酸酯)、 对乙酰氨基酚、非那西丁、金盐、氯喹、d-青霉胺、甲氨蝶呤、秋 水仙碱、别嘌呤醇、丙磺舒和磺吡酮。
[0388]
肌肉松弛剂包括美芬新、美索巴莫、盐酸环苯扎林、盐酸三己 基苯基醚、左旋多巴/卡比多巴和比哌立登。
[0389]
抗痉挛药物包括阿托品、东莨菪碱、奥昔芬和罂粟碱。
[0390]
镇痛药包括阿司匹林、苯基保泰松、艾杜美辛、苏灵大、托麦 汀、布洛芬、吡罗昔康、芬那酸酯、对乙酰氨基酚、非那西丁、硫 酸吗啡、硫酸可待因、哌替啶、纳洛芬、阿片样物质(例如硫酸可 待因、柠檬酸芬太尼、二酒石酸氢可酮、洛派丁胺、硫酸吗啡、那 可丁、去甲可待因、去甲吗啡、二甲基吗啡、nor-binaltorphimine， 丁丙诺啡、chlomaltrexamine、富纳曲胺(funaltrexamione)、纳布啡、 纳洛芬、纳洛酮、纳洛肼、纳曲酮和纳曲吲哚)、普鲁卡因、利多 卡因、丁卡因和二丁卡因。
[0391]
眼药包括荧光素钠、玫瑰红、乙酰甲胆碱、肾上腺素、可卡因、 阿托品、α-胰凝乳蛋白酶、透明质酸酶、贝沙洛尔、毛果芸香碱、 噻吗洛尔、噻吗洛尔盐及其组合。
[0392]
前列腺素是本领域公认的，并且是具有多种生物学效应的一类 天然存在的化学相关的长链羟基脂肪酸。
[0393]
抗抑郁药是能够预防或缓解抑郁症的物质。抗抑郁药的实例包 括丙咪嗪、阿米替林、去甲替林、普罗替林、地昔帕明、阿莫沙平、 多塞平、马普替林、反苯环丙胺、苯乙肼和异卡波肼。
[0394]
营养因子是持续存在改善细胞活力或寿命的因子。营养因子包 括但不限于血小板衍生生长因子(pdgp)、嗜中性粒细胞活化蛋白、 单核细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎症蛋白、血小板因子、血小板碱性 蛋白和黑素瘤生长刺激活性；表皮生长因子、转化生长因子(α)、 成纤维细胞生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子、胰岛素样生 长因子、神经胶质衍生生长神经营养因子、睫状神经营养因子、神 经生长因子、骨生长/软骨诱导因子(α和β)、骨形态发生蛋白、白 细胞介素(例如白细胞介素抑制剂或白细胞介素受体，包括白介素1 至白介素10)、干扰素(例如干扰素α、β和γ)、造血因子，包括 促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；肿瘤坏死因子和转化生长因子(β)， 包括β-1、β-2、β-3，抑制素和激活素。
[0395]
激素包括雌激素(例如雌二醇、雌酮、雌三醇、乙烯雌酚、炔 雌醇、氯三氮烯、炔雌醇、美雌醇)、抗雌激素(例如克罗米酚、 他莫昔芬)、孕激素(例如甲羟孕酮、炔诺酮、羟孕酮、炔诺孕酮)、 抗孕激素(米非司酮)、雄激素(例如，环戊丙酸睾酮、氟甲睾酮、 达那唑、睾内酯)、抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮、氟他胺)、甲 状腺激素(例如三碘甲状腺素、甲状腺素、丙基硫氧嘧啶、甲巯咪 唑和碘代甲代)和垂体激素(例如促肾上腺皮质激素、生长激素、 催产素和加压素)。激素通常用于激素替代疗法和/或用于控制生育 的目的。类固醇激素，如泼尼松，也用作免疫抑制剂和抗炎剂。
[0396]
治疗剂或诊断剂可以是成骨蛋白。因此，在一些实施方式中， 治疗剂或诊断剂选自称为转化生长因子β(tgf-β)蛋白质超家族的 蛋白质家族，其包括活化素、抑制素和骨形态发生蛋白质(bmp)。 最优选地，活性剂包括选自通常称为bmp的蛋白质亚类的至少一种 蛋白质，该蛋白质亚类已被公开具有成骨活性以及其他生长和分化 类型的活性。这些bmp包括bmp蛋白bmp-2、bmp-3、bmp-4、 bmp5、bmp-6和bmp-7，例如公开于美国专利号5,108,922； 5,013,649；5,116,738；5,106,748；5,187,076和5,141,905中；bmp-8， 公开于pct公开wo91/18098中；和bmp-9，公开于pct公开 wo93/00432中；bmp-10，公开于pct申请wo94/26893中；bmp-11， 公开于pct申请wo94/26892中，或bmp-12或bmp-13，公开于pct申请wo95/16035中；bmp-14；bmp-15，公开于美国专利号 5,635,372中；或bmp-16，公开于美国专利号5,965,403中。可以使 用的其他tgf-β蛋白包括vgr-2，jones等，mol.endocrinol.611961 (1992)，和任何生长和分化因子(gdf)，包括在pct申请 wo94/15965；wo94/15949；wo95/01801；wo95/01802； wo94/21681；wo94/15966；wo95/10539；wo96/01845；wo96/02559 等中描述的那些。在本发明中也可以使用在wo94/01557中公开的 bip；在jp公开号：7-250688中公开的hp00269；和在pct申请 wo93/16099中公开的bmp-14(也称为mp52、cdmp1和gdf5)。 所有上述申请的公开内容通过引用并入本文。可以使用的bmp的亚 群包括bmp-2、bmp-3、bmp-3b、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、 bmp-8、bmp-9、bmp-10、bmp-11、bmp-12、bmp-13、bmp-14、 bmp-15、bmp-16、bmp-17和bmp18。也可以使用本领域已知的其 他成骨试剂，例如特立帕肽(forteo
tm
)、前列 腺素e2或lim蛋白等。
[0397]
治疗剂或诊断剂例如蛋白质或肽可以重组产生，或从蛋白质组 合物中纯化。活性剂如果是tgf-β如bmp或其他二聚体蛋白，则可 以是同型二聚体，或者可以是与其他bmp的
wiley&sons, inc.,和heath c.a.,trends in biotechnology,2000,18:17-19中描述， 两者的内容通过引用整体并入本文。
[0406]
在一个实施方式中，生物制剂可以是肽，例如分子量为250kda 或更小的肽。在另一个实施方式中，所述肽是血管生成因子，例如 fgf、vegf、vegfr、igf、nrp-1、ang1、ang2、pdgf、pdgfr、 tgf-β、内皮糖蛋白、tgf-β受体、mcp-1、整合素，整合素配体(例 如rgd肽)、ve-钙粘蛋白、cd31、肝配蛋白、纤溶酶原激活物、 纤溶酶原激活物抑制剂-1、enos、cox-2、ac133、id1或id3。在 一个具体实施方式中，由本发明的水凝胶包封的肽是vegf。
[0407]
生物制剂如多核苷酸、多肽或其他试剂(例如抗原)是纯化的 和/或分离的。具体而言，如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分 子、多核苷酸、多肽或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其 他细胞材料或培养基，或当当化学合成时基本上不含化学前体或其 他化学物质。纯化的化合物按重量计为目标化合物的至少60％(干 重)。本文中的制剂按重量计也可以是目标化合物的至少75％，更 优选至少约90％，最优选至少约99％。例如，纯化的化合物是这样 的化合物，其按重量计是所需化合物的至少约90％、约91％、约92 ％、约93％、约94％、约95％、约98％、约99％或约100％(w/w)。 通过任何适当的标准方法，例如通过柱层析、薄层层析或高效液相 色谱(hplc)分析来测量纯度。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸 (rna)或脱氧核糖核酸(dna))不含在其天然发生状态下位于 其侧翼的基因或序列。纯化还限定了对于施用于人受试者而言是安 全的无菌程度，例如没有传染性或毒性试剂。
[0408]
类似地，“基本上纯的”是指核苷酸、多肽或其他化合物已经从 天然伴随其的组分中分离出来。典型地，当核苷酸和多肽按重量计 至少约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或甚至 100％不含与它们天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，它们 是基本上纯的。实例包括合成的化合物、重组化合物(例如，肽、 蛋白质、核酸)或纯化的化合物，例如通过包括色谱法的标准程序 纯化的化合物。
[0409]“分离的核酸”是如下的核酸，其结构与任何天然存在的核酸的 结构不同，或与跨越超过三个单独基因的天然存在的基因组核酸的 任何片段的结构不同。该术语涵盖，例如：(a)如下的dna，其是 天然存在的基因组dna分子的一部分，但未被将天然出现的有机体 基因组中分子的所述部分侧翼化的两种核酸序列侧翼化；(b)如下 的核酸，其并入载体或并入原核生物或真核生物的基因组dna中， 其方式使得所得分子与任何天然存在的载体或基因组dna不同； (c)单独的分子，例如cdna、基因组片段、通过聚合酶链式反应 (pcr)产生的片段、或限制性片段；和(d)作为杂合基因即编码 融合蛋白的基因的一部分的重组核苷酸序列。根据本公开的分离的 核酸分子还包括合成产生的分子，以及任何进行化学改造和/或进行 骨架修饰的核酸。
[0410]
可以包封在本发明的水凝胶中，或包封在本发明的水凝胶中包 封的脂质体中的治疗剂或诊断剂可以是sting佐剂，crispr-cas9 试剂和佐剂负载的源自经破坏癌细胞的亚细胞囊泡。
[0411]
在一个实施方式中，治疗剂或诊断剂也可以是疫苗。
[0412]
水凝胶的聚合物(例如藻酸盐聚合物)可以是约1-90％交联的， 例如至少约1％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、 约60％或约70％交联的。所列举值的中间范围也旨在为本发明的一 部分。例如，水凝胶的聚合物可以是约1％至约10％、约7％至约 15％、
约12％至约20％、约15％至约30％、约20％至约40％、约 30％至约50％、约45％至约65％或者约50％至约90％交联的。
[0413]
与术语“交联密度”可互换使用的术语“％交联”是指每摩尔彼此 反应的藻酸盐单体缀合的点击部分的摩尔数。
[0414]
聚合物(例如藻酸盐)可以是氧化的(例如高度氧化的)、还 原的、或者是其混合物。例如，本发明的水凝胶可以包含多糖聚合 物如藻酸盐聚合物的混合物，所述藻酸盐聚合物包含藻氧醇和藻氧 羧酸盐。在一些情况下，氧化的聚合物或部分氧化的聚合物是可生 物降解的。例如，包含氧化的或部分氧化的藻酸盐的水凝胶是可生 物降解的。
[0415]
治疗剂或诊断剂，或者包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米 颗粒例如脂质体或病毒体以持续释放的方式，例如以恒定的速率， 在给定的小时数例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时；或天数例 如1、2、3、4、5、6、7或8天；或周数例如1、2、3、4、5、6、7 或8周；或月数例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个 月期间自本发明的水凝胶释放。当治疗或诊断剂，或者包封治疗剂 或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒例如脂质体或病毒体以恒定速率自 本发明的水凝胶释放时，在给定的时段内自水凝胶中释放的治疗剂 或诊断剂的量或者基于脂质的纳米颗粒的量与在所述给定时间段即 刻之前或之后的时段期间自水凝胶中释放的治疗剂或诊断剂或者基 于脂质的纳米颗粒的量大约相同，例如在约0％至约20％内。
[0416]
治疗剂或诊断剂，或者包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米 颗粒的释放速率可以通过在制备水凝胶期间改变一个或多个参数来 调节。这样的参数包括但不限于点击取代度；％多糖氧化度；交联 反应(凝胶化)期间点击缀合的多糖的浓度；或周围环境的ph。
[0417]
点击取代度可以通过改变点击缀合反应中的点击试剂与氧化的 和还原的或高度氧化的多糖例如藻氧醇或藻氧羧酸盐的摩尔当量数 来调节。例如，可以通过增加点击缀合反应中点击试剂的摩尔当量 数来增加与本发明的多糖缀合的点击分子的数量。在另一个实例中， 可以通过降低点击缀合反应中点击试剂的摩尔当量数来减少与本发 明的多糖缀合的点击分子的数量。在一个实施方式中，点击缀合反 应可包含约1至约2000摩尔当量的点击试剂，例如约1、约5、约 10、约20、约50、约100、约150、约200、约250、约300、约350、 约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、 约800、约850、约900、约950或约1000摩尔当量的点击试剂。所 列举值的中间范围也旨在为本发明的一部分。例如，点击缀合反应 可以包含约1至约5、约2至约10、约5至约10、约10至约50、 约40至约150、约100至约400、约300至约500、约400至约1000、 约500至约1500或约1500至约2000摩尔当量的点击试剂。
[0418]
在一个实施方式中，多糖例如氧化的和还原的或高度氧化的多 糖，例如包含藻氧醇或藻氧羧酸盐的多糖，可以包含约0.01％至约 90％，例如约0.01、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约5％、 约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、 约45％或约90％的点击取代度。所列举值的中间范围也旨在为本发 明的一部分。例如，多糖可以是约0.01％至约0.05％、约0.01％至 约1％、约0.1％至约5％、约5％至约15％、约10％至约20％、约 15％至约25％、约20％至约35％、约30％至约40％或约35％至约 50％点击取代的。
[0419]
还可以通过调节多糖的％氧化度来调节与本发明的多糖缀合的 点击分子的数
量。例如，多糖在例如用氨硼烷还原之前或者在其进 一步例如用亚氯酸钠氧化之前的更高的％氧化度可以产生额外的醛 部分，所述醛部分在通过还原转化为醇部分或通过进一步氧化转化 为羧酸部分时，可以用作点击试剂缀合的位点。
[0420]
调节本发明多糖的点击取代度可允许调节胶凝时间或点击缀合 的多糖交联和产生水凝胶所花费的时间。例如，更高的点击取代度 可能导致更短的胶凝时间。
[0421]
调节点击取代度还允许调节所得水凝胶中孔的交联密度和平均 直径，即所得水凝胶的目径。例如，更高的点击取代度可能导致水 凝胶的更小的平均孔径或目径，这可导致治疗剂或诊断剂或者包含 治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒例如脂质体或病毒体的释放 速率降低。更高的点击取代度也可导致包含治疗剂或诊断剂的基于 脂质的纳米颗粒在水凝胶中更长的滞留。
[0422]
在又一个实例中，交联反应过程中本发明多糖的浓度可以变化。 例如，在点击缀合反应中，多糖例如点击缀合的多糖的更高浓度可 导致所得水凝胶的更小目径，这继而可以导致治疗剂或诊断剂或者 包含治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒如脂质体或病毒体自本 发明的水凝胶释放的速率降低。更高的点击取代度也可导致包含治 疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒在水凝胶中更长的滞留。在一 些实施方式中，水凝胶形成过程中点击缀合的多糖的浓度，例如在 即刻形成水凝胶之前存在于溶液中的藻酸盐物质的浓度可以为约 0.01％至约50％w/v，例如约0.01％至约10％w/v、约0.1％至约5％ w/v、约1％至约15％w/v、约10％至约30％w/v、约12％至约35％ w/v、约15％至约25％w/v、约20％至约45％w/v或约35％至约50 ％w/v。
[0423]
本发明的水凝胶，例如包含藻酸盐的水凝胶，例如包含藻氧醇 和/或藻氧羧酸盐的水凝胶，不被存在于宿主或受试者例如人中的内 源性酶降解。当暴露于酸性或碱性条件时，本发明的水凝胶可被化 学降解，例如水解。酸性条件包括ph 6.5或更低，而碱性条件包括 ph 8或更高。不希望被理论所束缚，据信本发明的水凝胶的化学降 解速率是ph依赖性的。例如，本发明的水凝胶在ph 2下的化学降 解速率高于在ph 6下的化学降解速率，并且本发明的水凝胶在ph 8 下的化学降解速率高于在ph 12下的化学降解速率。
[0424]
当本发明的水凝胶暴露于酸性或碱性条件时，与其在中性ph例 如7.4的ph下的释放速率相比，包含在水凝胶中的货物例如治疗剂 或诊断剂或者包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗粒例如脂质 体或病毒体以增加的速率自水凝胶释放。例如，因为肿瘤内环境可 以以6.5或更低的酸性ph为特征，因此货物自本发明水凝胶的释放 速率可以在肿瘤内环境中增加，由此允许抗癌剂的持续和靶向递送。
[0425]
v.本发明水凝胶中包封的基于脂质的纳米颗粒
[0426]
本发明还提供了包含包封治疗剂或诊断剂的基于脂质的纳米颗 粒以及包封脂质体的本发明水凝胶的药物递送组合物。如本文所用 的术语“基于脂质的纳米颗粒”是指包含脂质并且可用于将治疗剂 或诊断剂递送至受试者的任何纳米颗粒。在一个实施方式中，基于 脂质的纳米颗粒是脂质体。在另一个实施方式中，基于脂质的纳米 颗粒是病毒体。
[0427]
在脂质体中递送治疗剂或诊断剂可为合乎需要的，因为脂质体 可以提供此种制剂免于全身性酶促降解的保护，或者可以用于模拟 抗原呈递细胞(apc)。然而，存在与脂质体药物递送相关的挑战。 例如，脂质体的组成可能对负载效率、脂质体包封的治疗剂或诊断 剂的功效以及脂质体包封的治疗剂或诊断剂的系统毒性有很大影 响。因此，需要持续
一些实施方式中，可用于本发明背景下的脂质体是治疗性脂质体或 诊断脂质体，例如包含如上所述的治疗剂或诊断剂的脂质体。
[0433]
病毒体是由单层磷脂膜(单层或双层)囊泡组成的药物或疫苗 递送机制，所述囊泡并入了允许病毒体与靶细胞融合的病毒衍生蛋 白。病毒体不能复制，但是是纯的融合活性囊泡。可用于本发明背 景下的病毒体可以是本领域已知的可用于递送任何病毒衍生蛋白的 任何病毒体。在一些实施方式中，病毒体可以包含源自流感病毒的 蛋白质，例如血球凝集素或神经氨酸酶。在一些实施方式中，病毒 体是治疗性或诊断性病毒体，例如包含如上所述的治疗剂或诊断剂 的病毒体。在一些实施方式中，病毒体包含疫苗。
[0434]
vi.本发明的药物组合物
[0435]
为了施用于受试者，本发明的水凝胶可以以药学上可接受的(例 如无菌)组合物提供。因此，本文中描述的另一个方面是包含水凝 胶和药学上可接受的载体的药物组合物。这些药学上可接受的组合 物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一 起配制的水凝胶。如下面详细描述的，本公开的药物组合物可以经 具体配制用于以固体或液体形式施用，包括适用于以下的那些：(1) 口服施用，例如浸剂(水溶液或非水溶液或悬浮液)、锭剂、糖衣 丸、胶囊剂、丸剂、片剂(例如靶向用于口腔、舌下和/或全身吸收 的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂，用于施用至舌；(2)肠 胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内(例如推注或输注)或硬 膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放制剂；(3)局部 施用，例如作为乳膏、软膏或控释贴剂或施用于皮肤的喷雾剂；(4) 阴道内或直肠内，例如作为阴道栓、乳膏或泡沫剂；(5)舌下；(6) 眼睛；(7)透皮；(8)透粘膜；或(9)鼻。另外，可以将化合物 植入患者体内或使用药物递送系统注射。例如参见urquhart等，ann. rev.pharmacol.toxicol.24:199-236(1984)；lewis编，“controlledrelease of pesticides and pharmaceuticals”(plenum press,new york, 1981)；美国专利号3,773,919；和美国专利号353,270,960，所有这 些的内容通过引用并入本文。
[0436]
如本文所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指 在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过 度的毒性、刺激、过敏反应或其他与合理的利益/风险比相称的问题 或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。此外，对于动物 (例如人类)施用，应理解组合物应满足fda生物标准局所要求的 无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
[0437]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在将主体化合物从一 个器官或身体的一部分携带或输送到另一个器官或身体的一部分时 涉及的药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充 剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂，滑石、硬脂酸镁、 钙或锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料。每种载体在与制剂的其他成 分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上 可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖 和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其 衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维 素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7) 润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可 脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄 油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇， 如甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇(peg)；(12)酯，如油 酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和 氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原
水；(17)等渗盐水；(18) 林格氏溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳 酸酯和/或聚酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分， 如血清白蛋白、hdl和ldl；(22)c
2-c
12
醇，如乙醇；和(23) 药物制剂中使用的其他无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、 包衣剂、崩解剂、粘合剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、蛋白酶抑制 剂、增塑剂、乳化剂、稳定剂、增粘剂、成膜剂、增溶剂、表面活 性剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“载 体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。
[0438]
包含治疗剂的本发明水凝胶可被递送至受试者中的体内部位。 示例性的体内部位包括但不限于伤口、创伤或疾病的位点。通过例 如将组合物植入受试者中可以将水凝胶递送至体内部位。要植入的 水凝胶(即可植入装置)可另外包含一种或多种添加剂。添加剂可 以是分解(可生物降解的)聚合物、甘露醇、淀粉糖、纤维糖、山 梨醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、氯化钠、氯化钙、氨基酸、氯化镁、 柠檬酸、乙酸、羟基丁二酸、磷酸、葡糖醛酸、葡糖酸、聚山梨醇、 乙酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸铝、硬脂酸镁、碳 酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基 纤维素、甲基纤维素、淀粉或其混合物。
[0439]
可植入装置实际上可具有任何规则或不规则形状，包括但不限 于球体、立方体、多面体、棱柱体、圆柱体、杆、圆盘或其他几何 形状。因此，在一些实施方式中，植入物是直径为约0.5至约10mm 且长度为约0.5至约10cm的圆柱体形式。优选地，其直径为约1至 约5mm且长度为约1至约5cm。
[0440]
在一些实施方式中，可植入装置是球形的。当可植入装置呈球 形时，其直径可以在约0.5至约50mm的范围内。在一些实施方式中， 球形植入物的直径为约5至约30mm。优选直径为约10至约25mm。
[0441]
在一些实施方式中，本发明的水凝胶可用于制备药物递送装置 或药物贮库。药物递送装置也可以是可生物降解的和可再填充的。 例如，在pct/us2015/024540和美国申请号14/878,578中描述了可 再填充的生物可降解药物递送装置，其各自的全部内容在此通过引 用并入本文。可再填充的生物可降解药物递送装置包含能够与靶相 互作用的缀合至药物再填充物的靶识别部分。
[0442]
在一些实施方式中，用于制备可再填充的生物可降解药物递送 装置的本发明水凝胶可以包含与至少两种属于如上所述的两种不同 点击对的点击试剂缀合的多糖。例如，多糖可以包含第一点击试剂， 所述第一点击试剂通过与其缀合至药物再填充物的点击对进行反应 而用作药物递送装置的靶识别部分。多糖还可以包含第二点击试剂， 所述第二点击试剂起到如上所述的交联剂的作用，或起到将部分(例 如治疗剂)缀合至多糖的作用。在一个实施方式中，第一点击试剂 和第二点击试剂不交叉反应，即彼此不反应，而仅与它们的点击对 反应。
[0443]
在其他实施方式中，本发明的水凝胶可用于制备如上所述的可 再填充的生物可降解药物递送装置的药物再填充物。用于制备药物 再填充物的水凝胶可以包含缀合至如上所述的至少两种点击试剂的 多糖，其中至少一种点击试剂可以通过与其缀合至药物递送装置的 点击对反应而用作靶。
[0444]
vii.使用本发明水凝胶的治疗方法
[0445]
本发明还涉及治疗有此需要的受试者的方法。该方法包括向受 试者施用有效量的本发明的水凝胶、剂型、药物组合物或可植入的 药物递送装置。
[0446]
如本文所用，术语“施用”是指通过一种方法或途径将组合物置 入受试者中，该方法或途径导致组合物在所需部位至少部分定位以 使得产生期望的效果。本文所述的化合物或组合物可以通过本领域 已知的任何适当途径施用，所述途径包括但不限于口服或肠胃外途 径，包括静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、肺部、鼻 部、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。
[0447]
示例性的施用模式包括但不限于注射、输注、滴注、吸入或摄 入。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、 囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关 节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑脊内和胸骨内注射和输注。 在优选的实施方式中，组合物通过静脉内输注或注射而施用。
[0448]
施用也可以通过透粘膜或透皮方式。对于透粘膜或透皮施用， 在制剂中使用适合渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通 常是已知的，并且包括例如透粘膜施用、洗涤剂、胆汁盐和夫西地 酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂来完成。对 于透皮施用，将化合物配制成本领域通常已知的软膏剂、药膏，凝 胶剂或乳膏剂。
[0449]
在一些实施方式中，施用包括将本文描述的组合物例如水凝胶 植入受试者中。
[0450]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中至少一个细 胞亚群中以适用于任何医学治疗的合理利益/风险比产生一些期望治 疗效果的包含本文所述化合物的复合物、材料或组合物的量。因此，
ꢀ“
治疗有效量”是指当向受试者施用以用于治疗疾病时足以实现该 疾病的此种治疗的量。
[0451]
有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力范围内。通常， 实际有效量可随具体化合物、使用或应用技术、所需效果、作用持 续时间和副作用、受试者的病史、年龄、状况、性别以及受试者中 医学病症的严重性和类型、以及其他药学活性剂的施用而变化。因 此，本文所述化合物的有效剂量是足以在受试者中产生至少一些所 需治疗效果的量。
[0452]
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的 剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括ed
50
而毒性很小或没有毒 性的循环浓度范围内。剂量可根据所使用的剂型和利用的使用或施 用途径而在该范围内变化。
[0453]
有效剂量可以由细胞培养实验来初步评估。可以在动物模型中 制定剂量以达到包括如在细胞培养中测定的ic
50
(即实现症状的半 数最大抑制的治疗剂的浓度)的循环血浆浓度范围。例如，可以通 过高效液相色谱测量血浆中的水平。任何特定剂量的效果可以通过 合适的生物测定来监测。
[0454]
通常，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”被定义 为向患者施加或施用治疗剂，或向自患者分离的组织或细胞系施加 或施用治疗剂，所述患者具有疾病、疾病症状或患病倾向，其目的 是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善或影响该疾 病、疾病症状或患病倾向。因此，治疗可以包括制止、抑制、预防、 治疗或其组合。治疗尤其指增加持续进展的时间、加快缓解、诱导 缓解、增加缓解、加速恢复、增加替代疗法的效力或减少对替代疗 法的抗性或其组合。“制止”或“抑制”尤其是指延缓症状的发作、 防止疾病复发、降低复发发作的的数量或频率、增加症状发作之间 的潜伏期、降低症状的严重程度、降低急性发作的严重程度、减少 症状的数量、减少疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改 善症状、减少继发性症状、减少继发性感染、延长患者存活或其组 合。在一个实施方式中，症状是原发的，而在另一个实施方式中， 症状是继发的。“原发”是指为病症如糖尿病的
直接结果的症状， 而继发是指由原发原因产生或引起的症状。症状可以是疾病或病理 状况的任何表现。
[0455]
因此，如本文所用，术语“治疗”包括本文所述化合物的任何 施用，并且包括：(i)预防疾病在可能易患疾病但尚未经历或显示 疾病的病理或症状的受试者中发生；(ii)抑制正在经历或显示病变 的病理或症状的受试者中的疾病(即阻止病理和/或症状的进一步发 展)；或(iii)改善正在经历或显示患病病理或症状的受试者中的 疾病(即逆转病理和/或症状)。
[0456]
疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或预防 此类疾病或病症的发作，逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止与 这种疾病或病症相关的状况的发展、恶化或劣化或严重程度。在一 个实施方式中，疾病或病症的症状减轻了至少5％、至少10％、至 少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
[0457]
与任何已知的用于诊断病症的方法联合来确定治疗的功效。减 轻病症的一种或多种症状表明该化合物赋予临床益处。以上描述的 任何治疗方法可以应用于任何合适的受试者，包括例如哺乳动物， 例如狗、猫、牛、马、兔、猴，最优选人。
[0458]
如本文所用，术语“受试者”包括可受益于施用本发明的水凝 胶或可植入药物递送装置的任何受试者。术语“受试者”包括动物， 例如脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物、非人动物，包括人和灵 长类动物，例如黑猩猩、猴子等。在本发明的一个实施方式中，受 试者是人。
[0459]
术语“受试者”还包括农业生产性牲畜，例如牛、绵羊、山羊、 马、猪、驴、骆驼、水牛、兔、鸡、火鸡、鸭、鹅和蜜蜂；和家养 宠物，例如狗、猫、笼养鸟和水族鱼，以及所谓的测试动物，例如 仓鼠、豚鼠、大鼠和小鼠。
[0460]
在一个实施方式中，本发明提供了用于治疗耳相关病症的方法。 该方法包括向有需要的受试者施用用于治疗耳相关病症如耳炎的水 凝胶或剂型。将这样的剂型施用于需要其的受试者的外耳道中。剂 型可以包含多种治疗剂，例如至少一种抗生素。例如在 us2014/0107423中描述了用于将治疗剂递送入耳中的药物递送装 置，其全部内容在此通过引用并入本文。
[0461]
在另一个实施方式中，本发明还提供了用于治疗眼睛相关病症 的水凝胶或剂型。该方法包括向有需要的受试者的眼中施用本发明 的水凝胶或剂型。本发明的水凝胶或剂型可以包含至少一种治疗剂。 可用于眼科剂型的治疗剂的非限制性实例包括例如药学有效浓度的 抗生素、皮质激素、局部麻醉剂、减充血剂、非甾体消炎剂、病毒 生长抑制剂、防腐剂、可的松、抗过敏活性物质、前列腺素类似物、 来自抗组胺剂和皮质类固醇活性物质类的活性物质、抗过敏活性物 质、泛酸衍生物、非甾体抗炎药、血管收缩剂和/或抗青光眼活性物 质。例如在us20150139973中描述了用于眼内施用的合适剂型，其 全部内容在此通过引用并入本文。
[0462]
本发明还提供了用于治疗有需要的受试者中的慢性局部缺血的 方法。该方法包括向受试者施用有效量的本发明的水凝胶、剂型或 可植入装置。在一个实施方式中，本发明的水凝胶、剂型或可植入 装置包含vegf。
[0463]
先前已经发现将vegf局部递送至局部缺血位点可以增加受试 者体内vegf的半衰期并减少治疗相关的副作用。因此，在一个实 施方式中，将水凝胶、剂型或可植入装置局部
施用至局部缺血位点。 在一些实施方式中，在移植之前和/或之后将水凝胶、剂型或可植入 装置施用至待移植的组织。
[0464]
本发明还提供了用于再生有需要的受试者中的组织的方法。该 方法包括向受试者施用有效量的还包含细胞的本发明的水凝胶、剂 型或可植入装置。例如，细胞可以是哺乳动物细胞，组织可以是哺 乳动物组织。在一些实施方式中，哺乳动物细胞与待再生的组织类 型相同。在其他实施方式中，哺乳动物细胞是干细胞。本文提供的 方法的实施方式包括使哺乳动物组织与还包含细胞的本发明的水凝 胶、剂型或可植入装置接触。
[0465]
在另一个实例中，用于再生受试者中的组织的方法包括提供本 文所述的水凝胶、剂型或可植入装置，其中水凝胶包含固定在水凝 胶内的细胞(即，细胞长时间保留在水凝胶内而不离开水凝胶)。 该方法包括使组织与水凝胶接触，其中细胞被固定在水凝胶内。在 一些实施方式中，细胞是后代细胞。在一些实施方式中，水凝胶保 持稳定并且不允许宿主细胞浸润。
[0466]
在一个实施方式中，本文所述的水凝胶可用作免疫保护屏障， 例如用于胰岛移植。在一些情况下，胰岛移植是用于糖尿病如i型糖 尿病的治疗。诸如胰岛的移植细胞可以通过免疫反应而被破坏，而 本发明的水凝胶能够在水凝胶的植入/注射之前包封诸如胰岛细胞的 细胞。这样，水凝胶充当受试者中的免疫保护屏障并使移植的细胞 和组织的免疫排斥最小化。
[0467]
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为 限制性的。本技术通篇引用的所有参考文献的全部内容在此明确地 通过引用并入本文。
[0468]
实施例
[0469]
实施例1:存在于藻酸盐中的醛可以与货物蛋白和点击试剂反 应的。
[0470]
高分子量和低分子量的藻酸盐通过与高碘酸钠反应而被氧化。 为此，将mw为～265kda(mvg或protanol lf 20/40，fmctechnologies；i-1g或i-8，kimica公司)和mw为～32kda(vlvg， fmc technologies)的藻酸盐以1％w/v的浓度溶解于ddh2o中。将 高碘酸钠(sigma-aldrich)以基于相对于藻酸盐单体摩尔数的摩尔 百分比的量加入到溶液中。然后使溶液在室温下避光反应过夜。向 溶液中加入氯化钠至浓度为0.3m，氧化产物通过切向流过滤(tff) 进行纯化或使用12-14kda mwco透析管(spectrum lab)透析过夜， 在dih2o中对抗从150mm至0mm nacl的下降盐梯度具有大量水 交换。
[0471]
将含有0％-50％醛的氧化藻酸盐与vegf一起孵育。孵育5天 后通过elisa(r&d systems目录号dve00)测量可溶性未变性 vegf(2％w/v藻酸盐，4mcg/ml vegf)的百分比变化。如图2a 中所示，醛％的增加与vegf的％变化直接相关，其中含有50％醛 的藻酸盐导致vegf的50％变化。数据表明，与氧化的藻酸盐孵育 的醛可以与vegf反应。
[0472]
含有20％-50％醛的氧化藻酸盐还与点击试剂四嗪(tz)和降冰 片烯(nb)缀合。在室温下再悬后，氧化的藻酸盐显示出显著的颜 色变化，指示醛浓度对降解的依赖性。图2b中示出的是再悬后含有 与tz和nb缀合的氧化藻酸盐的小瓶的图。从左到右显示的是：
[0473]-与tz缀合的具有20％醛的藻酸盐；
[0474]-与nb缀合的具有20％醛的藻酸盐；
[0475]-与tz缀合的具有30％醛的藻酸盐；
[0476]-与nb缀合的具有30％醛的藻酸盐；
[0477]-与tz缀合的具有40％醛的藻酸盐；
[0478]-与nb缀合的具有40％醛的藻酸盐；
[0479]-与tz缀合的具有50％醛的藻酸盐；
[0480]-与nb缀合的具有50％醛的藻酸盐。
[0481]
数据表明，醛也能以取决于醛浓度的方式与点击试剂反应以形 成有色产物和亚胺。这些颜色变化代表了点击部分的不期望的变化。 在酸性条件下，亚胺可以水解回醛。
[0482]
实施例2.藻酸盐醛的还原
[0483]
本实验的目的是测定已与硼氢化钠(nabh4)、氨硼烷(bh3nh3) 和亚氯酸钠(naclo2)反应的氧化藻酸盐中残留醛的含量。如图3a 中所示，硼氢化钠和氨硼烷二者与存在于藻酸盐中的醛反应以形成 醇，而亚氯酸钠与醛反应以形成羧酸。
[0484]
用高碘酸钠氧化藻酸盐，使其含有5-50％的残余醛。然后使氧 化的藻酸盐与硼氢化钠、氨硼烷和亚氯酸钠反应，并且在每次反应 后使用qnmr定量残余醛的％。
[0485]
使用如实施例1中所述的程序进行藻酸盐的高碘酸钠氧化。
[0486]
为了用硼氢化钠还原氧化的藻酸盐，将藻酸盐溶液用硼氢化钠 (sb，sigma-aldrich)以》1.5:1的sb对藻酸盐氧化单体的摩尔比进 行处理。使反应在室温下进行过夜。向溶液中加入氯化钠以达到0.3m 的浓度，且sb处理的产物通过切向流过滤(tff)纯化或使用 12-14kda mwco透析管(spectrum labs)透析过夜，在dih2o中对 抗从150mm至0mm nacl的下降盐梯度具有大量水交换。然后将 含有还原的藻酸盐的溶液冷冻并冻干至干燥。
[0487]
为了用氨硼烷还原氧化的藻酸盐，将藻酸盐溶液用氨硼烷(ab) 复合物(sigma-aldrich)以》1.5:1的ab对藻酸盐醛的摩尔比进行处 理。使反应在室温下进行过夜。向溶液中加入氯化钠以达到0.3m的 浓度，且ab处理的产物通过切向流过滤(tff)纯化或使用12-14kdamwco透析管(spectrum labs)透析过夜，在dih2o中对抗从150mm 至0mm nacl的下降盐梯度具有大量水交换。然后将含有还原的藻 酸盐的溶液冷冻并冻干至干燥。
[0488]
为了进一步氧化氧化的藻酸盐，将藻酸盐溶液用亚氯酸钠(sc) 以》1.5:1的sc对藻酸盐醛的摩尔比进行处理。在加入亚氯酸钠之前， 将二甲亚砜(dmso；sigma-aldrich)以5:1的dmso对亚氯酸钠的 摩尔比加入溶液中并混合直至溶液变均质。使反应在室温下进行过 夜。然后向该溶液中加入氯化钠以达到0.3m的浓度，且sc处理的 产物通过切向流过滤(tff)纯化或者使用12-14kda mwco透析管 (spectrum labs)透析过夜，在dih2o中对抗从150mm至0mm nacl 的下降盐梯度具有大量水交换。然后将含有高度氧化的藻酸盐的溶 液冷冻并冻干至干燥。
[0489]
图3b是显示已用氨硼烷或硼氢化钠进一步还原或者已用亚氯酸 钠进一步氧化的氧化藻酸盐中的％残余氧化度的柱状图。数据表明， 氨硼烷在其还原醛的能力上优于硼氢化钠，并产生含有最低水平残 余醛的藻酸盐。这种效果对于具有较高氧化水平的藻酸盐尤其明显。 该数据还表明，在“最初的dmso反应条件”(1:1的水:dmso) 下，醛的亚氯酸钠氧化未达到完成。如图6k中所示，可以通过将反 应条件改变为33:1的水:dmso来消除残余的醛。
[0490]
实施例3.氧化的藻酸盐的还原处理降低了醛对货物蛋白的影 响。
[0491]
本实验的目的是评估氧化的藻酸盐中存在的醛对vegf的生物 学活性的影响。为此，藻酸盐通过与高碘酸钠反应而被氧化，以产 生含有0％-50％醛的氧化的藻酸盐。然后使氧化的藻酸盐与硼氢化 钠(nabh4)、氨硼烷(bh3nh3)和亚氯酸钠(naclo2)反应。将 不同
的藻酸盐与vegf以20mg/ml的藻酸盐浓度和4μg/ml的 vegf浓度在含有1％bsa的pbs中37℃下孵育。在ebm细胞培养 基或含有1％bsa的溶液中孵育5天后，通过elisa(r&d system 目录号dve00)测量可溶性未变性vegf(2％w/v藻酸盐，4mcg/mlvegf)的百分比变化。
[0492]
数据显示在图4a和4b中。图4a显示了在ebm中孵育5天后 测量的vegf的％变化。该数据表明，对于未进一步处理的氧化的 藻酸盐，vegf的％变化与藻酸盐中所含醛的百分比直接相关(参见 左起前7个条，标记为“0”、“1”、“5”、“10”、“15”、
ꢀ“
25”和“50”)。对于含有25％和50％醛的藻酸盐，vegf的％ 变化达到100％。数据还表明，对于已经与氨硼烷反应的氧化的藻酸 盐(参见标记为“ab5”、“ab10”、“ab15”、“ab25”和“ab50
”ꢀ
的条)，vegf的％变化显著降低，对于含有15％醛的藻酸盐，观 察到vegf的约60％的最高％变化。采用硼氢化钠还原在保护vegf 方面没有如此有效，对于每个研究的藻酸盐材料(参见标记为“sb5”、
ꢀ“
sb10”、“sb15”、“sb25”和“sb50”的条)观察到vegf 的较高％变化。对于所有研究样品(参见标记为“sc5”、“sc10”、
ꢀ“
sc15”、“sc25”和“sc50”的条)，用亚氯酸钠氧化导致所测 得的显著％变化，这是因为当时(最初的dmso反应条件)由反应 低效所保持的残余醛所导致的。
[0493]
图4b显示了在1％bsa溶液中孵育5天后测量的vegf的％变 化。数据表明，对于未进一步处理的氧化的藻酸盐材料，vegf的％ 变化可以达到超过30％(参见左起前7个条，标记为“0％ox”、
ꢀ“
1％ox”、“5％ox”、“10％ox”、“15％ox”、“25％ox
”ꢀ
和“50％ox”)。采用氨硼烷(参见标记为“ab5”、“ab10”、
ꢀ“
ab15”、“ab25”和“ab50”的条)或硼氢化钠(参见标记为
ꢀ“
sc5”、“sc10”、“sc15”、“sc25”和“sc50”的条)的还 原性处理降低了vegf的％变化，硼氢化钠比氨硼烷更为有效。与 对照相比，采用亚氯酸钠的氧化性处理(初始dmso反应条件)导 致vegf的％变化增加(参见标记为“sc5”、“sc10”、“sc15”、
ꢀ“
sc25”和“sc50”的条)。
[0494]
图4a和4b中显示的数据表明，各种经处理的藻酸盐的保护蛋 白质货物的能力存在差异。
[0495]
实施例4.与亚氯酸钠反应后，氧化的藻酸盐的点击试剂取代度 增加。
[0496]
本实验的目的是确定氧化的藻酸盐与亚氯酸钠反应后，与点击 试剂的点击试剂缀合度是否会增加。如图1a中所示，点击试剂通常 可以经由藻酸盐中的葡糖醛酸中存在的羧酸酯部分与藻酸盐缀合， 从而导致每个藻酸盐单体有一个点击分子。用高碘酸钠氧化藻酸盐 后，每个藻酸盐单体产生两个醛试剂，其也可以经由亚胺键与点击 试剂缀合(图1b)。点击试剂与氧化的藻酸盐的这种缀合是次优的， 因为缀合后保留在藻酸盐中的残余醛可能对货物造成毒性和损害， 以及点击试剂的降解(参见实施例1和3)。此外，醛和点击试剂之 间的亚胺键易于水解，导致点击试剂自藻酸盐的损失。然而，如图 1c中所示，存在于氧化的藻酸盐中的醛的进一步氧化将这些醛转化 成羧酸，为点击缀合提供了两个额外位点。
[0497]
为了确定氧化的藻酸盐的进一步氧化是否可以增加点击缀合， 将仅与高碘酸钠反应的藻酸盐、或用高碘酸钠氧化(highox藻酸盐) 并用亚氯酸钠进一步氧化的藻酸盐(含有藻氧羧酸盐的藻酸盐)与 点击试剂四嗪(tz)和降冰片烯(nb)缀合，并对缀合的四嗪和降 冰片烯的相对量进行比较。为此，使用实施例1和2中描述的程序， 使用高碘酸钠和sc氧化藻酸盐。然后用1-二环[2.2.1]庚-5-烯-2-基甲 胺(降冰片烯甲胺；tci)或3-(对苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪对这些产物 进行修饰。首先，将经sc处理的藻酸盐溶于含有0.1m mes、0.3mnacl、ph6.5的浓度为0.5％w/v的搅拌缓冲液中。接下来，以存在 于藻酸盐上的羧酸基团的5倍摩尔过量加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs；sigma-aldrich)和1-乙基-3-(3-二甲基
氨基丙基)-碳化二亚 胺盐酸盐(edc；sigma-aldrich)。然后将降冰片烯(nb)或四嗪 (tz)以nb或tz对藻酸盐单体的限定摩尔比加入以分别得到alg-n 或alg-t。在室温下搅拌偶联反应过夜，产物通过切向流过滤(tff) 纯化或使用12-14kda mwco透析管(spectrum lab)透析过夜，在 dih2o中对抗从150mm至0mm nacl的下降盐梯度具有大量水交 换。然后将纯化的alg-n和alg-t聚合物用活性炭处理，无菌过滤 (0.22mm)，并冷冻干燥。这导致具有藻酸盐可用羧酸基的不同取 代度的纯化的alg-n或alg-t聚合物。
[0498]
图5a显示了在第0天含有与tz和nb缀合的highox藻酸盐(上 图)和在第0天含有与tz和nb缀合的highox sc藻酸盐(下图) 的小瓶的图。tz-和nz-缀合材料名义上分别是粉红色/红色和略微不 清澈的。图5b显示了通过nmr测量的存在于highox和highox sc 藻酸盐中的tz的相对量。数据表明，对于含有20-50％氧化度的藻 酸盐，tz分子缀合至highox sc藻酸盐比缀合至highox藻酸盐多 1.4至2.3倍，表明含有藻氧羧酸盐的藻酸盐具有扩展的缀合潜力。
[0499]
实施例5.点击物缀合的氧化的藻酸盐的表征。
[0500]
本实验的目的是表征点击物缀合的highox sc藻酸盐材料的性 质，并将其与点击物缀合的highox藻酸盐材料的性质进行比较。通 过紫外-可见光谱分析研究两种藻酸盐材料的稳定性。tz缀合材料的 数据示于图6a和6b中。图6a示出了在第28天具有20-50％氧化度 的tz-缀合的highox藻酸盐材料的紫外-可见光谱(上图)和在第 14天具有20％和30％缀合的tz-缀合的highox sc材料的紫外-可 见光谱。图6b还显示了含有这些tz-缀合的highox和highox sc 藻酸盐材料的小瓶的图片。数据表明，四嗪缀合的highox藻酸盐材 料在28天时在515nm处丧失了特征性tz峰，而在含有20％和30 ％氧化度的highox sc藻酸盐材料中，该峰在第14天仍然存在。这 些数据表明，经亚氯酸钠处理的四嗪缀合的材料在溶液中表现出更 高的稳定性。
[0501]
在第15天的tz-缀合和nb-缀合的highox(20％和50％醛)氨 硼烷(ab)、硼氢化钠(sb)和亚氯酸钠(sc)藻酸盐材料(在室 温下储存的4％w/v溶液)的紫外-可见光谱示于图6j中。光谱表明， 15天后，tz-缀合的highox材料在515nm处的峰得到保留，且nb
‑ꢀ
缀合的highox材料在300nm处无吸收。该数据表明藻酸盐醛的还 原或进一步氧化赋予了溶液中点击物缀合部分更高的稳定性。
[0502]
还通过定量nmr研究tz-缀合和nb-缀合的highox和highoxsc材料以确定它们的醛含量。在varian 400mhz上通过将》～5.1ppm 处的由高碘酸钠产生的质子峰与内标二甲基丙二酸(dmma； 6h1.3pmm；sigma-aldrich)进行比较来进行醛含量的定量。样品在 15mg/ml藻酸盐和2.5mg/ml dmma的氧化氘(d 2o； sigma-aldrich)中制备。在氧化氘(d2o；sigma-aldrich)中以15mg/ml 的藻酸盐和2.5mg/ml的dmma制备样品。
[0503]
结果示于图6e、6f、6g和6h中。具体而言，图6e和6f分别显 示与nb和tz缀合的具有50％氧化度的highox藻酸盐材料的nmr 谱。图6g和6h分别显示与nb和tz缀合的具有50％醛的highox sc 藻酸盐材料的nmr谱。数据表明，在highox醛藻酸盐材料中具有 明显的峰展宽，表明这种材料更具动态性。highox藻酸盐材料的 nmr谱也含有指示残余醛的存在的峰。相反，highox sc藻酸盐材 料的nmr谱显示出尖锐的峰，表明highox sc材料具有更高的清 晰度，并且几乎不存在残余醛。highox sc藻酸盐材料中不存在残 余醛也可通过ftir分析来确认，ftir光谱示于图6i中。总体而言， 数据表明点击物缀合的highox sc藻酸盐材料的
动态性更小，化学 上稳定，并且仅含有少量的残余醛。
[0504]
评估氧化的藻酸盐与亚氯酸钠的反应条件。用于产生图3b中所 示数据的初始反应条件使用水:dmso的1:1混合物作为溶剂，其中 dmso用作副产物次氯酸(hocl)的清除剂。通过将混合物中的 dmso含量改变为33:1的水:dmso，驱使反应进一步完成。在图6k 中显示了在最佳条件下生产的highox sc藻酸盐材料的nmr谱， 表明在这些条件下用亚氯酸钠进一步处理醛后，在具有20％和50％ 氧化度的材料中没有任何显著的残余醛。
[0505]
实施例6.点击物缀合的氧化的藻酸盐的胶凝。
[0506]
对具有20-50％氧化度的点击物缀合highox和highox sc材料 形成水凝胶的能力进行研究。以10％(w/v)制备互补氧化度的制剂 (例如20％醛-tz和20％醛-nb)、混合并使其凝胶化20分钟。图 7a和7b证明了高碘酸盐氧化、还原(ab，sb)和进一步氧化(sc) 的材料在溶液中随时间(例如透析驻留时间)降解，这限制了水凝胶 的形成。因此，为了增强胶凝作用，该方法已被改造为用切向流过滤 (tff)代替透析以使溶液驻留时间最小化。
[0507]
图7c表明，highox和highox sc材料的溶解度随％氧化度的变 化而增加，并且对于highox sc材料而言最高。
[0508]
实施例7.氧化的和还原的藻酸盐的体外降解和溶解度。
[0509]
本实验的目的是在进一步还原处理(即，与硼氢化钠或氨硼烷 反应)或氧化处理(即，用亚氯酸钠还原)之后，研究具有或不具 有点击物缀合的氧化的藻酸盐的降解和溶解度。
[0510]
通过使藻酸盐与高碘酸钠反应，然后用四氢呋喃(thf)沉淀来 制备点击物缀合的藻酸盐材料(mvg藻酸盐，280kda)。然后将沉 淀材料通过与硼氢化钠或氨硼烷反应而还原，或通过与亚氯酸钠反 应而进一步氧化，并且另外透析1天。然后将其与tz或nb缀合， 并再次透析1天。
[0511]
通过使藻酸盐与高碘酸钠反应，然后进行3天透析来制备未与 点击物缀合的对照藻酸盐材料(vlvg藻酸盐，30kda)。然后将透 析后的材料通过与硼氢化钠或氨硼烷反应而还原，或通过与亚氯酸 钠反应而进一步氧化，并且另外透析3天。
[0512]
然后将mvg和vlvg藻酸盐材料在37℃下孵育长达29天，并 通过凝胶渗透色谱法(gpc)分析以确定藻酸盐材料的平均分子量。 为此，以2mg/ml的藻酸盐材料浓度在pbs中制备样品。然后使用 配有g4000pwxl和g5000pwxl串联柱的agilent 1260hplc分析样 品。使用100μl注射进样(流速为0.5ml/min)，0.1m硝酸钠 (sigma-aldrich)流动相进行分析，柱温和检测器温度均为35℃。 使用三重检测将样品与校准的peo标准品(34kda；agilenttechnologies)进行比较。
[0513]
结果示于图7a和7b中。具体而言，图7a显示了具有20％氧化 度(左图)和50％氧化度(右图)的tz-缀合和nb-缀合的mvg藻 酸盐的降解。数据表明，还原处理的mvg藻酸盐(ab，sb)和进 一步氧化(sc)的材料均表现出可降解性。
[0514]
对于未处理的藻酸盐(左上图)、用氨硼烷还原处理的藻酸盐 (右上图)、用硼氢化钠还原处理的藻酸盐(左下图)和用亚氯酸 钠处理的藻酸盐(右下图)，图7b显示了含有0％-50％氧化度的 vlvg藻酸盐在37℃下的降解。数据表明，还原的和进一步氧化的 材料表现出与高碘酸盐氧化的材料对照相似的降解曲线。
[0515]
图7c是含有用氨硼烷或亚氯酸钠处理的具有20％氧化度的mvg (280kda)材料的
50％w/v溶液的小瓶的图片。提供50％(w/v)的 未氧化的vlvg(30kda)作为对照。未氧化的mvg仅可溶至～5％w/v， 而未氧化的vlvg可溶至～10％w/v。令人惊奇的是，该照片显示氨硼 烷和亚氯酸钠处理的材料(具有类似于vlvg的分子量，参见图7a) 均易于以50％w/v溶解。数据表明，用亚氯酸钠进一步氧化的tz-缀 合和nb-缀合的mvg材料最为可溶。
[0516]
实施例8.四嗪和降冰片烯点击物缀合的上限。
[0517]
本实验的目的是确定如实施例7中所述制备的vlvg材料的点 击物缀合的上限。同样如实施例7中所述制备的mvg材料在缀合反 应中使用250摩尔当量的点击材料以获得约5％取代度(ds)，所 述取代度定义为每单体单元的点击部分的数量，其中对于tz的上限 为约7.5％，而对于nb的上限为20％。在本实验中，未氧化的vlvg 材料与不同当量的tz或nb反应，并且通过qnmr测量％ds。数据 显示在下表中。在较高摩尔当量下，降冰片烯nmr峰显著扩宽，因 此假定对于降冰片烯的值是超出报道的(or)。
[0518]
点击试剂的当量通过qnmr确定的％ds600当量四嗪12.0600当量降冰片烯37.1(or)900当量四嗪12.9900当量降冰片烯72.9(or)1200当量四嗪21.81200当量降冰片烯97.0(or)
[0519]
如图8中所示，还使用紫外-可见光谱测量四嗪缀合。数据表明， 四嗪的取代度对于具有600-1200四嗪当量的反应是线性的。这些数 据表明，使用较低分子量的藻酸盐可以获得更大的取代度，并且尚 未达到上限。将本实验扩展至还原的和进一步氧化的材料以确定它 们的潜力潜能的上限，并由此确定交联密度。
[0520]
实施例9.存在于氧化的藻酸盐中的醛对细胞活力的影响。
[0521]
本实验的目标是确定在存在于氧化的藻酸盐中的醛的存在下的 相对细胞活力。为此，用高碘酸钠氧化藻酸盐以生成具有0-50％氧 化度的含醛藻酸盐材料。随后，将10mg该材料与5
×
105的小鼠白血 病细胞(atcc ccl-219，n＝1)在具有10％马血清的dmem中直 接孵育2天。使用muse细胞计数和活力测定试剂盒对活细胞数进 行定量。归一化至0％氧化度的数据显示在下表中，并且也在图9 中以图形方式显示。
[0522][0523]
数据表明，细胞活力不受高达15％氧化度的醛的影响，并且在 25％和50％氧化度
下开始快速下降。
[0524]
实施例10.氧化的藻酸盐的溶解度
[0525]
本实验的目的是将具有点击物缀合的氧化的藻酸盐的溶解度与 未氧化的藻酸盐的溶解度进行比较。图10是显示以下藻酸盐的溶解 度(％w/v)的条形图：分子量为250kda的未氧化的藻酸盐(mvg)； 分子量为30kda的未氧化的藻酸盐(vlvg)；和分子量为30kda 的藻酸盐(mvg)(vlvg)，其被氧化至20％，然后通过使用亚 氯酸钠进一步氧化并与点击物(tz或nb)缀合以产生分子量为约 30kda的最终产物。在本实验中使用的vlvg材料显示在图7c的小 瓶5中。在本实验中使用的点击物缀合和钠处理的藻酸盐材料显示 在图7c的小瓶3和4中。
[0526]
图10中呈现的数据表明未氧化的mvg仅可溶至～5％w/v，未氧 化的vlvg可溶至～10％w/v；点击物缀合的亚氯酸钠处理的藻酸盐 可溶至～50％。数据表明，含有藻氧羧酸盐的藻酸盐，以及在略微较 小程度上的含有algoxalol的藻酸盐，其特征在于与未氧化的藻酸盐 相比溶解度显著增加。
[0527]
实施例11.藻酸盐的溶解度对交联潜能的影响
[0528]
本实验的目的是确定分子量为250kda(mvg)和30kda(vlvg) 的未氧化的藻酸盐的tz缀合的上限。由于其较高的分子量，mvg 材料比vlvg材料更粘稠且溶解性更低。使用如实施例8中所述的 实验程序进行本实验。
[0529]
图11a是显示mvg和vlvg材料所实现的tz缀合的上限的柱 状图。图11a中的数据表明可溶性较小的mvg材料可以与最大～500 摩尔当量的tz缀合，而可溶性较大的vlvg材料可以与最大～2500 摩尔当量的tz缀合。因此，vlvg材料增加的溶解度(由于较低的 分子量)允许更大的点击取代度。由于其甚至更低的粘度，通过使 用含algoxanol和/或藻氧羧酸盐的藻酸盐，可以进一步扩展该缀合潜 能。
[0530]
图11b是显示vlvg材料的取代度随tz的摩尔当量变化的图。 所研究的材料是与500、1000、1500、2000和2500摩尔当量的tz 反应的vlvg。它证明vlvg材料的tz缀合的上限是在～2500当量 的tz下实现的。
[0531]
实施例12.藻酸盐浓度和点击取代度对点击物缀合的藻酸盐材 料的凝胶化动力学的影响
[0532]
本实验的目的是使用流变学测定来研究点击物缀合的藻酸盐材 料的随藻酸盐浓度、氧化程度和点击取代度变化的凝胶化动力学。 本实验使用非氧化的vlvg材料，所述材料使用含有500、1500和 2500摩尔当量的nb或tz的缀合反应而与nb和tz缀合。本实验还 使用mvg材料，所述材料使用高碘酸钠氧化至10％或20％的氧化 度，用氨硼烷还原处理，然后在缀合反应中使用250摩尔当量的nb 和tz与nb和tz缀合。在本实验中还使用lf 20/40藻酸盐材料， 所述材料使用高碘酸钠氧化至20％的氧化度，用氨硼烷还原处理， 然后在缀合反应中使用1000摩尔当量的nb和tz与nb或tz缀合。
[0533]
通过使用流变学测定测量弹性模量g’的值来确定点击物缀合的 藻酸盐材料的胶凝。为此，将所需最终浓度(pbs中5％、10％、15 ％或20％w/v)的alg-n和alg-t溶液以1:1的比例混合并直接移液 到ta instrument arg2流变仪的底板上，所述流变仪配有20mm的 平坦上平板几何结构和400微米的几何间隙。使用珀尔帖冷却器来 控制温度依赖性实验的温度，并且将贮水器盖放置在凝胶上以防止 水凝胶在测试期间干燥。在1hz下使水凝胶样品
经受1％应变，并 监测储存和损耗模量(g’和g”)1小时。
[0534]
图12a是显示不同的经研究vlvg材料的弹性模量g'随时间增 加的图。该数据有效地证明了不同材料凝胶化所花费的时间，平稳 表明凝胶样状态已经实现。数据表明增加点击取代度导致更快的凝 胶化。
[0535]
图12b是显示不同的经研究vlvg材料的弹性模量g'的值的条 形图。左侧黑色并标记为“2％1:3 mvg:vlvg”的条形图对应于对 照材料，其为钙交联的mvg:vlvg的1:3混合物的2％w溶液。
[0536]
图12c是显示不同的经研究vlvg材料的目径值的条形图。左 侧黑色并标记为“2％1:3 mvg:vlvg”的条形图对应于对照材料， 其为钙交联的mvg:vlvg的1:3混合物的2％w溶液。
[0537]
图12b和12c中显示的数据表明，增加点击取代度导致材料的 不同流变性质，如弹性模量g'增加和孔径减小所表现的。
[0538]
图12d是显示mvg材料的弹性模量g'相对于时间增加的图， 所述mvg材料被氧化至10％氧化度，用氨硼烷还原，然后使用250 摩尔当量的nb和tz与nb或tz缀合。以5％w/v、10％w/v或15 ％w/v的点击物缀合的还原的藻酸盐的浓度产生水凝胶。图12e是显 示mvg材料的弹性模量g'相对于时间增加的图，所述mvg材料被 氧化至20％氧化度，用氨硼烷还原，然后用250摩尔当量的nb和 tz与nb或tz缀合。在5％w/v、10％w/v、15％w/v或20％w/v的 点击物缀合的还原的藻酸盐的浓度下产生水凝胶。图12f是显示lf 20/40材料的弹性模量g'相对于时间增加的图，所述lf 20/40材料 被氧化至20％氧化度，用氨硼烷还原，然后使用1000摩尔当量的 nb和tz与nb或tz缀合。在5％w/v、10％w/v、15％w/v或20％ w/v的点击物缀合的还原的藻酸盐的浓度下产生水凝胶。
[0539]
图12d、图12e和图12f中的数据表明，增加还原的藻酸盐的浓 度减少了点击物缀合的藻酸盐的凝胶化时间。结果表明，可以通过 改变点击缀合反应中藻酸盐氧化的程度、点击试剂的相对量和藻酸 盐的浓度来调节点击物缀合的藻酸盐的凝胶化过程。
[0540]
实施例13.点击取代度对蛋白质释放速率的影响
[0541]
本实验的目的是研究点击取代度对点击藻酸盐水凝胶中包封的 各种蛋白质的释放速率的影响。本实验利用如实施例11中所述产生 的与nb或tz缀合的未氧化的vlvg和mvg材料。具体地，未氧 化的vlvg材料与nb或tz在250、500、1000、1500、2000和2500 摩尔当量的nb或tz下缀合以产生nb和tz缀合的藻酸盐(alg-n 和alg-t)。未氧化的mvg材料与nb或tz在250摩尔当量的nb 或tz下缀合。本实验还利用了具有不同分子量的蛋白质，例如胰岛 素(～3.5kda的mw)。牛血清白蛋白(bsa，mw～67kda)和igg (mw～150kda)。
[0542]
通过将萤光素标记的胰岛素(sigma-aldrich)、牛血清白蛋白 (bsa；sigma-aldrich)和人免疫球蛋白g(igg；sigma-aldrich) 包封在点击物缀合的藻酸盐中来评估蛋白质释放曲线。通过首先将 各种取代度的冷冻干燥的alg-n和alg-t聚合物分别溶解于pbs中 至最终所需浓度(4％和5％w/v)来制备样品。加入目标蛋白质并与 alg-n溶液以1:10(alg-n+alg-t，v/v)的蛋白质:藻酸盐的比率混 合。然后将该溶液与alg-t溶液彻底混合，使混合物凝胶化至少30 分钟。通过向各个凝胶添加1ml pbs并在37℃孵育来创建样品。在 各个时间点收集样品，并在每个时间点替换上清液。使用平板读数 器相对于标准曲线对上清液中的蛋白质含量进行定量，所述平板读 数器具有492nm处的荧光激发和518nm处的发
射。
[0543]
图13a是显示荧光素缀合的胰岛素从使用具有不同点击缀合度 的点击物缀合的vlvg材料产生的水凝胶累积释放(以微克计)的 图。图13b是显示图13a中曲线的对应于水凝胶形成期间2500摩尔 当量的nb或tz和5％浓度的alg-n和alg-t(2500eq 5％vlvg) 的非平台区和线性拟合的图。图13c是显示荧光素缀合的bsa从使 用具有不同点击缀合度的点击物缀合的vlvg材料产生的水凝胶累 积释放(以微克计)的图。图13d是显示图13c中曲线的对应于水 凝胶形成期间2500摩尔当量的nb或tz以及5％浓度的alg-n和 alg-t(2500eq 5％vlvg)的非平台区和线性拟合的图。图13e是 显示荧光素缀合的igg从使用具有不同点击缀合度的点击物缀合的 vlvg材料产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。图13f是显示 图13e中曲线的对应于水凝胶形成期间2500摩尔当量的nb或tz和 5％浓度的alg-n和alg-t(2500eq 5％vlvg)的非平台区和线性 拟合的图。图13g是显示荧光素缀合的胰岛素、bsa和igg从通过 c
a2+
介导交联产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0544]
图13a-13g中显示的数据表明，蛋白质自藻酸盐水凝胶的释放曲 线可能受到藻酸盐的点击取代度的影响。具体而言，数据显示较高 的点击取代度降低了蛋白质从水凝胶的“初始爆发”。使用具有较 高点击取代度的藻酸盐允许产生具有较小“目径”的水凝胶，其继 而允许实现较长的蛋白质释放时间。例如，如图13b、13d和13f所 示，具有最高点击取代度(2500当量)的藻酸盐产生在数天内提供 线性蛋白质释放速率的水凝胶。相比之下，自其他材料制备的水凝 胶提供数小时而非数天内的非线性的“爆发式”蛋白释放。其他材 料的势力描述于例如ks anseth等，biomed.mater.res.a,2009,90: 720-729；pp kundu等，carbohydrate polymers,2014,112:627-637； t.bal等，j.biomed.mater.res.part a,2014.102a:487-495；c.e. schmidt等，biomaterials,2005,26:125-135；y.m.lee等，macromol. research,2006.14:87-93；c.p.covas等，mat.sci.app.2011.2: 509-520；w.f.mieler等，trans.am.ophtalmol.soc.,2008.106: 206-214；w.m.tian等，controlled release,2005.102:13-22中。
[0545]
实施例14.藻酸盐氧化程度和藻酸盐浓度对蛋白质释放速率的 影响
[0546]
本实验的目的是研究凝胶化过程中藻酸盐氧化程度和藻酸盐浓 度对点击藻酸盐水凝胶中包封的各种蛋白质的释放速率的影响。本 实验利用如实施例1中所述最初被高碘酸钠氧化至5％或10％氧化 度的lf 20/40藻酸盐材料。随后，使用实施例2中描述的程序，将 氧化的lf 20/40藻酸盐用氨硼烷(ab)还原处理或用亚氯酸钠(sc) 进一步氧化。然后使用2000摩尔当量的nb或tz一级实施例4中描 述的程序使该材料与nb或tz缀合。随后，将该材料用于制备水凝 胶和以5％或10％w/v藻酸盐浓度包封胰岛素或igg。如实施例13 所述监测蛋白质释放曲线。
[0547]
图14a是显示荧光素缀合的胰岛素从使用被氧化至5％或10％且 然后用ab还原处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸 盐产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0548]
图14b是显示荧光素缀合的胰岛素从使用被氧化至5％或10％且 然后用sc氧化处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸 盐产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0549]
图14c是显示荧光素缀合的igg从使用被氧化至5％或10％且然 后用ab还原处理
的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸盐 产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0550]
图14d是显示荧光素缀合的igg从使用被氧化至5％或10％且然 后用sc氧化处理的浓度为5％w/v的点击物缀合的lf 20/40藻酸盐 产生的水凝胶累积释放(以微克计)的图。
[0551]
图14a-14d中的数据表明，通过在凝胶化过程期间改变用于经 ab和sc处理材料的藻酸盐氧化程度和藻酸盐材料的浓度，可以实 现对蛋白质释放曲线的调节。
[0552]
实施例15.存在于氧化的藻酸盐中的醛对点击部分的影响。
[0553]
本实验的目标是确定缀合至藻酸盐的点击部分在醛存在下的稳 定性。为此，将未氧化的mvg材料在使用250当量点击材料的缀合 反应中与nb或tz缀合，并随后暴露于2.3％的戊二醛。观察小瓶的 颜色变化长达69小时。图15a是在0分钟、40分钟、21.5小时和 67.5小时之后拍摄的在2.3％戊二醛存在下含有与nb(左小瓶)和 tz(右小瓶)缀合的4％mvg材料的玻璃小瓶的一系列图片。图15b 是在0分钟、40分钟、20小时和69小时后拍摄的含有作为对照的 水(左小瓶)或与dbco(中间小瓶)或叠氮化物(右小瓶)缀合 的2％mvg材料的玻璃小瓶的一系列图片。图15a中的数据表明在 暴露于醛40分钟后观察到nb和tz的降解。dbco和叠氮化物的降 解需要更长的时间，但可以在20小时后观察到，如图15b中的数据 所证明。因为醛是在藻酸盐氧化时产生的，所以该实验表明，与藻 酸盐缀合的点击部分预期将会在藻酸盐氧化时降解。因此，为了保 持点击部分的稳定性，醛必须例如用氨硼烷还原来还原消除，或者 例如用亚氯酸钠进一步氧化来氧化消除。
[0554]
实施例16.藻酸盐水凝胶包封和保留脂质体
[0555]
本实验的目的是研究由点击物缀合的藻酸盐产生的水凝胶包封 脂质体并提供完整脂质体在体内持续和局部递送的能力。本实验使 用由1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)和胆固醇(chol) 以55:45的dopc/chol比制备，且总脂质浓度为50mm的市售脂 质体。脂质体还含有浓度为0.5mm(0.47mg/ml)的荧光染料1,1'
‑ꢀ
二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(dil)，并具有 133nm的平均直径。通过在caso4和脂质体存在下以2％或5％w/v 的藻酸盐浓度交联，将脂质体包封在由未氧化的mvg材料制备的水 凝胶中。还将脂质体包封在由未氧化的mvg材料制备的水凝胶中并 使其在脂质体存在下以5％w/v的藻酸盐浓度凝胶化，所述mvg材 料使用250摩尔当量的nb或tz而与nb或tz缀合。最后，还将脂 质体包封在由如例如koshy等，advanced healthcare materials 2016, 第5卷,第5期,第541-547页中所述制备的点击物缀合的明胶制备 的水凝胶中。通过测量上清液中dil荧光的增加来体外监测自水凝胶 的脂质体释放。使用平板读数器相对于标准曲线对上清液蛋白质含 量进行定量，所述平板读数器在550nm处具有荧光激发且在580nm 处发射。
[0556]
图16a是显示在50天期间内脂质体从ca
2+
交联藻酸盐和从非氧 化的点击物缀合的藻酸盐累积释放(％负载)的图。图16b是显示 脂质体从ca
2+
交联藻酸盐水凝胶、非氧化的点击物缀合的藻酸盐水 凝胶和点击明胶水凝胶累积释放(％负载)的图。这些结果表明， 在30天后观察到脂质体从点击明胶水凝胶的定量释放。相反，藻酸 盐水凝胶在保留脂质体方面更有效。具体而言，未氧化的点击物缀 合的的藻酸盐水凝胶在50天后保留了至少约95％的脂质体负载，而 ca
2+
交联的藻酸盐水凝胶在40天后保留了约85％的脂质体负载。该 数据表明，在所研究的水凝胶中，未氧化的点击物缀合的藻酸盐水 凝胶在40天或更多天内保留
％、5％或10％的总氧化度，然后使用如实施例1和2所述的程序采 用ab还原处理。将实施例16中所述的脂质体包封在水凝胶中，并 通过在75天期间内测量上清液中dil荧光的增加来体外监测它们的 释放。
[0571]
图18是显示在75天内脂质体从在点击物缀合之前被氧化至0 ％、5％和10％总氧化度并用ab还原处理的点击物缀合的藻酸盐水 凝胶累积释放(％负载)的图。图18中的结果表明，在点击物缀合 之前将藻酸盐氧化至5％或10％并随后将藻酸盐还原允许脂质体在 75天期间内保留，具有可检测的脂质体释放，而未氧化的藻酸盐在 75天内释放约3％的脂质体。因此，藻酸盐的氧化改善了藻酸盐水 凝胶对脂质体的保留。
[0572]
实施例19.ph对藻酸盐水凝胶稳定性的影响
[0573]
本实验的目的是研究脂质体货物从藻酸盐水凝胶的释放随ph 的变化。因为藻酸盐生物降解是酸或碱介导的，所以在14天内在ph 5(在0.1m柠檬酸钠缓冲液中)和ph 9(在0.1m硼酸钠缓冲液中) 下监测脂质体货物从藻酸盐水凝胶中的释放。通过首先将mvg藻酸 盐氧化至20％氧化度并随后使用氨硼烷将材料还原来制备样品。7 天后，ph 9样品大部分被降解，14天后，发现ph 5样品也降解。
[0574]
图19a是含有具有包封的脂质体的水凝胶、水凝胶和上清液的 管在第0天的图片，所述水凝胶包含用氨硼烷还原的20％氧化mvg。 图19b是含有具有包封的脂质体的水凝胶和上清液的管在第1天的 图片，所述水凝胶使用已经用氨硼烷还原的20％氧化mvg来制备。 图19c是含有具有包封的脂质体的水凝胶和上清液的管在第7天的 图片，所述水凝胶使用已经用氨硼烷还原的20％氧化mvg来制备。 图19d是含有具有包封的脂质体的水凝胶和上清液的管在第14天的 图片，所述水凝胶使用已经用氨硼烷还原的20％氧化mvg来制备。 图19e是显示中性脂质体(dopc：胆固醇)从通过将藻酸盐氧化至 20％并随后将其用氨硼烷还原而产生的藻酸盐水凝胶的基于降解的 释放的图。样品在ph6.5的mes缓冲液中释放以模拟瘤周微环境。
[0575]
图19a-19d中的结果表明藻酸盐被降解，并且脂质体在酸性ph (ph 5)或碱性ph(ph 9)下扩散到上清液中，但未在中性ph(7) 下扩散到上清液中。因此，自点击藻酸盐水凝胶的脂质体释放是ph 敏感的，并且允许脂质体货物的降解介导的释放。
[0576]
实施例20.藻酸盐水凝胶包封和保留阳离子脂质体
[0577]
先前的实验(例如，实施例16中所述的实验)利用了中性的 dopc/chol脂质体。本实验的目的是研究藻酸盐水凝胶包封和保留 带电脂质体如阳离子脂质体的能力。本实验利用平均直径为133nm 的含有n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基甲基硫酸铵 (dotap)和氢化大豆磷脂酰胆碱(hydro soy pc)的阳离子脂质 体。脂质体还含有荧光染料1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰 花青高氯酸盐(dil)。将这些脂质体包封在钙交联的藻酸盐材料中 以及未氧化的点击物缀合的藻酸盐中，所述未氧化的点击物缀合的 藻酸盐在缀合反应中使用250摩尔当量的点击试剂。如实施例16所 述监测阳离子脂质体从水凝胶中的释放。
[0578]
图20a是挤出之前的dotap：hydro soy pc脂质体的dls迹线， 而图20b是挤出之后的同一脂质体的dls迹线。图20a和20b证明 可以使用挤出制备尺寸均匀的阳离子脂质体。
[0579]
图20c是显示17天期间阳离子脂质体从ca
2+
交联藻酸盐和未氧 化的点击物缀合的藻酸盐水凝胶累积释放(％负载)的图。图20c 中的结果表明，点击物缀合的藻酸盐水凝胶
可以在17天的时间内包 封并有效保留阳离子脂质体。相反，阳离子脂质体从钙交联的藻酸 盐水凝胶中的释放仅在2天后即为明显的。
[0580]
实施例21.藻氧醇和藻氧羧酸盐复合点击水凝胶的蛋白质释放 曲线
[0581]
本实验的目标是评估不同的蛋白质从使用已经点击物缀合的不 同氧化的和还原的藻酸盐材料制备的水凝胶释放的曲线。用于制备 藻酸盐水凝胶的组合物包括：a)等份的以下mvg：已被氧化至50 ％且随后用亚氯酸钠氧化并与2000当量的tz缀合的10％w/v mvg， 和已被氧化至10％且随后用氨硼烷还原并与2000当量的nb缀合的 10％w/v mvg；b)等份的以下mvg：已被氧化至50％且随后用氨 硼烷还原并与250当量的tz缀合的10％w/v mvg，和已被氧化至 10％且随后用氨硼烷还原并与250当量的nb缀合的10％w/v mvg； c)7份已被氧化至10％且随后用氨硼烷还原并与2000当量的nb缀 合的10％w/v mvg，和3份已被氧化至50％且随后用氨硼烷还原并 与2000当量的tz缀合的10％w/v mvg；和d)3份mvg和1份已 与硫酸钙交联的mvg。
[0582]
通过将人igf和人vegf(r&d systems)包封在各种点击水凝 胶中来评估蛋白质释放曲线。通过首先将各种取代度的冷冻干燥的 alg-n和alg-t聚合物分别溶解于pbs中至最终所需浓度(w/v)来 制备样品。加入蛋白质并与alg-n溶液混合以达到2μg/凝胶(100 μl)最终浓度。将蛋白-alg-n溶液与alg-t溶液彻底混合并使其凝 胶化至少30分钟。通过向各凝胶添加1ml具有1％bsa的pbs并 在37℃孵育来产生样品。在各个时间点收集样品，并在每个时间点 替换上清液。使用可比样品基质(分别为pbs w/1％bsa和pbs w/5％ tween 20)的标准曲线，用人vegf和igf quantikine elisa试剂 盒(r&d systems)对具有vegf和igf的上清液蛋白含量进行定 量。
[0583]
图21a是显示igf-1从使用各种藻酸盐组合物制备的点击物缀 合的藻酸盐水凝胶释放的图。图21b是显示vegf
165
从使用各种藻 酸盐组合物制备的点击藻酸盐水凝胶释放的图。
[0584]
图21a和21b中的数据显示出使用点击凝胶调节igf-1和 vegf
165
的爆发释放的能力，所述点击凝胶使用不同的藻酸盐组合物 制备。相反，钙交联的藻酸盐水凝胶不能调节扩散。该实施例表明， 可能通过含有藻氧醇和藻氧羧酸盐的藻酸盐、藻酸盐取代度，藻酸 盐浓度、以及nb对tz的比率的各种组合来调节蛋白质释放。
[0585]
实施例22.藻酸盐溶液的粘度
[0586]
本实验的目标是研究随藻酸盐氧化和/或还原变化的点击物缀合 的藻酸盐溶液的粘度。为此，通过首先分别将冻干的alg-n和alg-t 聚合物溶解在ddh2o中至最终所需浓度(w/v)来评估点击藻酸盐溶 液的相对粘度。将溶液直接移液到ta instruments arg2流变仪的底 板上，所述流变仪配有20mm的平坦上平板几何结构和400微米的 几何间隙。使用珀尔帖冷却器来控制温度(20℃)。藻酸盐样品经 受0.1和1hz之间的应变。
[0587]
图22是显示在不同藻酸盐浓度(％w/v)、氧化程度和用亚氯 酸钠或氨硼烷处理下各种藻酸盐溶液的相对粘度的条形图。这些数 据表明，与未经氧化的mvg的点击缀合不会导致粘度的显著差异， 而在点击缀合至含有藻氧醇或藻氧羧酸盐的藻酸盐的情况下，粘度 大幅度降低，并且与水的粘度相当(0.890cpa，25℃)。