深绿木霉T3、由其制备的菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用

深绿木霉t3、由其制备的菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用
技术领域
1.本发明涉及植物病害微生物防治技术领域，具体涉及深绿木霉t3、由其制备的菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用。


背景技术：

2.黄连(coptis chinensis)为毛莨科多年生草本植物，以根茎入药，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降糖之药效，广泛应用于医疗及其保健行业。黄连连年栽培和种植面积的不断扩大，导致根腐病发作加剧，严重影响黄连的产量和品质，且严重降低了农民种黄连的积极性，严重制约黄连产业化发展。
3.黄连根腐病是多种微生物复合侵染所致，病原菌复杂多样，其中镰刀菌属菌株是黄连的强致病病原菌。在生产中，黄连根腐病病原菌在满足其生长条件时侵染黄连根部或黄连茎部，但发病前期不易察觉，发病后期的防治效果不佳，严重时还会造成黄连整株死亡。目前，黄连根腐病的防治仍以化学防治为主，而使用化学制剂对土壤进行消毒不仅会破坏土壤的生态结构还会污染环境。因此，寻找一种更高效、无污染的防治方法迫在眉睫。
4.生物农药因安全有效，环境友好越来越受到人们的青睐，是未来农业发展的重要组成部分。目前，国内外关于黄连根腐病的研究主要集中在病害调查和病原菌的分离鉴定方面，但有关黄连根腐病生物防治的研究尚为空白。


技术实现要素：

5.为填补现有技术的空白，本发明提供了深绿木霉t3、由其制备的菌剂、菌剂制备方法和菌剂的应用。
6.第一个方面，本发明提供深绿木霉(trichoderma atroviride)t3，其保藏编号为cctcc no:m 2022330。
7.第二个方面，本发明提供一种防治黄连根腐病的菌剂，是将所述的深绿木霉t3发酵培养制得的孢子悬浮液。
8.进一步的，所述黄连根腐病的病原菌为腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌和三线镰刀菌。
9.第三个方面，本发明提供所述一种防治黄连根腐病的菌剂的制备方法，步骤如下：
10.取深绿木霉t3菌种，在无菌条件下，挑取少量菌丝，接入已灭菌的pda培养基中，30℃，转速180r/min的条件下暗培养5-6d，吸取清液，稀释制备孢子悬浮液。
11.第四个方面，本发明提供所述的一种防治黄连根腐病的菌剂在防治黄连根腐病中的应用，对黄连病株灌根施用所述孢子悬浮液。
12.进一步的，所述孢子悬浮液的浓度为0.8-1
×
106个/ml。
13.本发明具有如下有益效果：
14.本发明所述的深绿木霉t3能够抑制腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌和三线镰刀菌的生长，降低黄连根腐病的病情指数，防治效果可达86.36％，并且无公害、无污染，具有广阔的应用前景。
附图说明
15.图1为绿木霉t3在不同培养基中的菌落特征，其中，a：pda培养基；b:sna培养基；c：cmd培养基；d：ema培养基。
16.图2为深绿木霉t3的菌丝形态和孢子形态，其中，a为t3的菌丝显微形态，b,c为t3的孢子梗，d为t3的孢子形态。
17.图3为基于its-tef组合序列的系统进化树。
18.图4为平板对峙实验结果，其中，a为hl-01对照，d为hl-01对峙正面，j为hl-01对峙反面；b为hl-05对照，e为hl-05对峙正面，h为hl-05反面；c为hl-15对照，f为hl-15对峙正面，i为hl-15对峙反面。
19.图5为温度对深绿木霉t3产孢量的影响。
20.图6为转速对深绿木霉t3产孢量的影响。
21.图7为接种量对深绿木霉t3产孢量的影响
22.图8为深绿木霉t3发酵液对黄连根腐病尖孢镰刀菌的防效，对照组为只接种病原菌尖孢镰刀菌hl-05。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.实施例1：菌株的分离与鉴定
25.1、方法
26.1.1样品采集
27.2018年2月，在重庆市石柱县黄水镇黄连根腐病常发田间(北纬30
°
10
′
、东经108
°
35
′
)采集健康黄连根际土壤样品3份，每份100g。采用抖根法收集黄连的根际土壤，装入冰盒中保存并立即带回实验室，4℃冰箱保存备用。
28.1.2生防木霉菌的筛选
29.准确称取土壤样品10g，放入含有90ml生理盐水及玻璃小珠于250ml三角瓶中。制成10-1
的土壤悬液，置于摇床中(28℃，150r/min)培养30min，取上清液1ml，进行梯度稀释，制成10-2
、10-3
、10-4
、10-5
浓度的悬浮液，分别取0.1ml悬浮液均匀地涂于马丁氏-孟加拉红平板上，28℃黑暗培养。待长出菌落后采用打孔接种法转接新平板，再采用单孢纯化法纯化菌种，挑取单胞菌落在pda培养基上，待长满斜面，4℃下保存备用。
30.采用平板对峙法进行生防木霉菌的筛选，将分离纯化的木霉菌与病原菌(供试的黄连病原菌为腐皮镰刀菌(fusarium.solani)hl-01；尖孢镰刀菌(fusarium.oxysporum)hl-05；三线镰刀菌(fusarium.tricinctum)hl-15，(均由长江师范学院现代农业与生物工程学院实验室分离保存)；同时利用6mm无菌打孔器接种在pda培养基中，其中病原菌接种在平板中心部位，木霉菌接种在距平板中心部位25mm处，每皿接2点，行成一字形，以只接种病原菌的pda平板为对照。28℃恒温黑暗培养，待对照平板长满时，测量病原菌的菌落直径来计算抑菌率。
31.抑菌率＝(对照病原菌菌斑直径-处理病原菌菌斑直径)/对照病原菌菌斑直径
×
100％。
32.1.3菌种的鉴定
33.1.3.1形态学鉴定
34.将纯化的生防木霉菌分别接种到pda、sna、cmd和ema平板上，置于28℃黑暗培养7d，观察菌落形态、颜色，并观察pda平板上培养的生防木霉菌的菌丝、分生孢子梗、分生孢子的显微形态特征，根据gams&bissett(1998)分类系统进行生防木霉菌株的形态鉴定。
35.1.3.2生防木霉菌rdna-its，tef1基因序列测定
36.木霉菌基因组dna提取按真菌基因组dna提取试剂盒(solarbio，d2300)说明进行，采用真菌通用引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’，seq id no.1所示)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’，seq id no.2所示)扩增木霉菌rdna its。pcr反应体系：dna模板1μl，5
×
buffer 3μl，d ntp 2μl，引物各3μl，酶0.2μl，加dd h2o 30μl。pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。采用引物ef1-526f(5
’‑
gtcgtygtyatygghcaygt-3’，seq id no.3所示)和ef1-1567r(5
’‑
achgtrccratac caccratctt-3’，seq id no.4所示)扩增木霉菌tef1。pcr反应体系：dna模板1μl，5
×
buffer3μl，d ntp 2μl，引物各3μl，酶0.2μl，加dd h2o 30μl。pcr反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，63℃退火55s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸10min。rdna its和tef1的pcr产物分别进行胶回收(solarbio，d2500-2)，送交上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果登录genbank，进行blast同源序列比对分析。
37.1.3.3双基因联合构建系统进化树
38.将测序获得的t3菌种rdna its和tef1基因序列，以及从genbank中选择的木霉属其它菌株的rdna its和tef1基因序列，用megax进行比对并手工矫正，按its-tef1的顺序将其矫正序列首尾连接。采用megax软件的最大似然法(maximum likelihood，ml)构建包括t3菌种在内共计22株菌株的系统进化树，自展支持值(bootstrap)设为1000，以protocrea farinosa cbs121551和protocrea pallida cbs 299.78作为外群。
39.2、结果
40.2.1菌种的分离及其菌落形态
41.从黄连根际土壤中分离得到2株真菌，根据菌落形态，分别编号为t2和t3，并对分离菌种进行单孢纯化后保存备用(拮抗实验结果显示，t2菌种无拮抗作用，为此只展示t3数据)。如图1所示，在pda、ema中生长最快，7d菌丝长满平板，cmd中11d菌丝长满平板，在sna中15d菌丝长满平板。在pda中气生菌丝茂密且旺盛，菌丝呈绒毛状，不断向远处扩散，孢子簇呈环纹状，逐渐由最初的白色变为浅绿再变为深绿，中间层孢子簇较为密集，孢子簇内环较宽且密集，外环较稀疏，呈不均匀分布。在sna中菌丝很少，贴着培养基表面生长，很稀疏，不旺盛也不茂密，未看见气生菌丝，孢子簇呈环状但分布不均匀，最外层孢子簇较为稀疏，但都呈深绿色。cmd中菌丝生长不旺盛，也不茂密，呈毛绒状，孢子簇呈环纹状，内层呈深绿色，外层呈浅绿或稍微偏黄。ema中菌丝呈毛绒状向外扩散，菌丝稀疏，孢子簇呈环纹状分布，外层呈深绿色，内层绿色，较外层略浅。
42.2.2菌种的显微形态
43.菌丝简单分隔，树状分枝，菌丝直径3.1～5.2μm；分生孢子梗为瓶状，分生孢子梗上又长出互生和对生的分枝，顶端为分生孢子；分生孢子浅绿色，单细胞、卵圆形或圆形，大
小为长(4.0～5.0)μm
×
宽(3.0～4.0)μm(图2)。
44.2.3菌种分子鉴定及系统发育分析
45.菌种t3的its序列长度为566bp，tef1序列长为1273bp；基因序列已上传到genbank数据库，登录号分别为om570594和on149861。分别用its和tef1基因序列进行blast比对，t3与trichoderma属菌株相似，其中its与trichoderma atroviride cbs 142.95的相似度最高，为99.46％；tef1与trichoderma atroviride imi 206040的相似度最高，为99.61％。选择trichoderma属的标准菌种，以protocrea属的2株菌种为外属，基于its和tef1基因序列组合构建系统构建树，t3聚类到trichoderma atroviride分支。基于形态学和系统进化分析，t3鉴定为trichoderma atroviride(图3)，分类命名为深绿木霉(trichoderma atroviride)，于2022年03月28日，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏号为cctcc no:m2022330。
46.2.4深绿木霉t3对黄连根腐病的拮抗作用
47.如图4和表1所示，对峙实验接种后，观察到木霉菌的生长速度明显超过病原菌hl-01，hl-05，hl-15，其中hl-01，hl-05菌落略有生长，而hl-15生长最慢，并分别在5d，8d和7d后与病原菌接触，接触之后，病原菌停止向前生长。在hl-01，hl-05的对峙交界处，形成了抑菌带，产生黄褐色素，平板背面黄褐色素更明显；而hl-15正、反面对峙交界处无色素产生。木霉菌对三线镰刀菌hl-15的抑菌率最高，抑菌率高达85.98％，其次是尖孢镰刀菌hl-05，抑菌率为77.71％；再者是腐皮镰刀菌hl-01，抑菌率为74.71％(图4)。
48.表1对峙实验情况统计
[0049][0050]
实施例2：深绿木霉t3发酵条件的优化
[0051]
1、方法
[0052]
1.1培养温度对深绿木霉t3的影响
[0053]
在250ml三角瓶中分装50ml pda培养基，以5％接种量接种深绿木霉t3孢子悬浮液(1
×
106个/ml)，分别在22℃、24℃、26℃、28℃、30℃摇床中，180r/min培养5d。吸取0.5ml清液稀释制备孢子悬浮液，用血球计数板测定产孢量，计算公式：孢子数/ml＝平均每小格的孢子数
×4×
106×
稀释倍数。
[0054]
1.2转速对深绿木霉t3的影响
[0055]
在250ml三角瓶中分装50ml pda培养基，以5％接种量接种木霉菌t3孢子悬浮液(1
×
106个/ml)，分别以120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min转速，28℃培养5d，测定产孢量。。
[0056]
1.3接种量对深绿木霉t3的影响
[0057]
在250ml三角瓶中分装50ml pda培养基，分别按照5％、10％、15％、20％、25％接种量接种深绿木霉t3孢子悬浮液(1
×
106个/ml)，在28℃，180r/min摇床培养5d。测定产孢量。上述每组试验均设三个重复。
[0058]
1.4正交实验
[0059]
以培养温度(因素a)、转速(因素b)和接种量(因素c)为主要发酵影响因素，深绿木霉的产孢量为指标，进行l9(34)正交试验，每项试验重复3次。各因素的实验水平见表2。正交实验结果分析采用spss软件。
[0060]
表2正交试验因素水平表
[0061][0062]
2、结果
[0063]
2.1温度对深绿木霉t3的影响
[0064]
不同培养温度对深绿木霉t3产孢量试验结果表明(图5)，随着温度增加，深绿木霉t3的产孢量先增加后降低，28℃时深绿木霉t3产孢量达到最高，为1.201
×
107个/ml,。因此，深绿木霉t3的最佳产孢温度为28℃。
[0065]
2.2转速对深绿木霉t3的影响
[0066]
不同转速对深绿木霉t3产孢量的试验表明(图6)，在120r/min-160r/min之间，产孢量呈现递增趋势，转速为180r/min时产孢量最高，为2.783
×
107个/ml，随后下降。因此，深绿木霉t3最佳产孢转速为180r/min。
[0067]
2.3接种量对深绿木霉t3的影响
[0068]
不同接种量对深绿木霉t3产孢量试验表明(图7)，随着接种量增加，深绿木霉t3的产孢量出现先增后减的趋势，其中接种量为10％时深绿木霉t3产孢量最高，为1.977
×
107个/ml。因此，深绿木霉t3最佳产孢接种量为10％。
[0069]
2.4正交试验优化深绿木霉t3液体发酵条件
[0070]
极差分析结果表明，3个因素对发酵产孢量影响的主次顺序为：温度(a)》转速(b)＞接种量(c)，其中发酵温度为30℃，转速180r/min，接种量10％时，深绿木霉t3产孢量最高，即最佳组合为a1b1c1(表3)。方差分析结果表明，各因素对深绿木霉t3液体发酵产孢量的影响为发酵温度影响极显著(p《0.01)，转速和接种量影响不显著(p》0.05)(表4)。
[0071]
表3(l9(3)4)正交试验设计及极差分析
[0072]
[0073][0074]
表4 l9(34)正交试验方差分析
[0075][0076]
实施例3：深绿木霉t3发酵液对黄连根腐病的盆栽防效测定
[0077]
1、方法
[0078]
选取高度、长势一致的健康黄连植株经质量百分比浓度为5％的次氯酸钠溶液浸泡处理3min，用无菌水清洗3次之后，将黄连栽种于花盆无菌营养基质(高温灭菌)中，每盆1株，共20盆。以实施例2正交实验筛选的最佳发酵条件培养深绿木霉t3，制备浓度为1
×
106个/ml的孢子悬浮液，同时也制备黄连根腐病尖孢镰刀菌hl-05的孢子悬液(1
×
106个/ml)。用黄连根腐病尖孢镰刀菌hl-05的孢子悬液5ml灌根处理黄连。24h后再用灌根法施用深绿木霉t3孢子悬浮液，每株5ml，共10盆。以施用5ml无菌水的10盆为对照。20d后观察并计算发病率、病情指数和防效。
[0079]
黄连根腐病发病程度按5级分级标准，统计发病情况。
[0080]
0级：植株叶片完整健康，根系健康，无发病。
[0081]
1级：植株有1-3片叶表现为失绿病症，根系未发病。
[0082]
2级：植株有4片以上叶片变黄，出现病斑，根系变黑。
[0083]
3级：植株大部分叶子变黄或枯萎倒垂，根系变黑软腐，茎基部软腐严重。
[0084]
4级：植株死亡，叶片干枯，根系腐烂。
[0085]
计算方法：
[0086]
发病率(％)＝发病株数/总株数
×
100；
[0087]
病情指数＝∑(各级病株数
×
该病级值)/(最高级值
×
调查总株数)
×
100；
[0088]
相对防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数
×
100。
[0089]
2、结果
[0090]
健康黄连植株经过黄连根腐病尖孢镰刀菌病原菌灌根处理，10d后叶子开始出现黄褐色，20天时，对照组发病率为100％，深绿木霉t3对黄连根腐病防治效果显著，发病率控制在30％(如表5所示)。对照组中c1植株和g1植株病情指数为4级；a1植株和f1植株病情指数为3级；b1植株和d1植株病情指数为2级；e1植株、h1植株、i1植株和j1植株病情指数为1级(如图8所示)。即利用深绿木霉t3进行根腐病防治，病情指数从55降低到了7.5。防效高达86.36％。
[0091]
表5深绿木霉t3发酵液对黄连根腐病的盆栽防治效果
[0092][0093]
注：ck为只接种尖孢镰刀菌病原菌。
[0094]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0095]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。