一种用于扩增成纤维细胞的培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种用于扩增成纤维细胞的培养基及其制备方法。


背景技术：

2.细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种生命科学技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。体外模拟环境主要体现在使用各种不同配方的培养基。合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
3.目前，采用一般培养基对成年人成纤维细胞培养过程中，培养周期较长，而且培养5代以后细胞分裂能力降低，无法满足需求。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于扩增成纤维细胞的培养基及其制备方法，该培养基通过各组分的限定，能够实现成纤维细胞的快速培养，且传代20代的细胞依然具有较强的分裂能力。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.本发明第一方面提供一种用于扩增成纤维细胞的培养基，每升所述培养基中包括如下重量份组分：
7.二水氯化钙280～320mg、九水硝酸铁0.08～0.12mg、氯化钾3200～3700mg、无水硫酸镁95～100mg、氯化钠6200～6800mg、无水磷酸二氢钠105～115mg、丁二酸78～82mg、丁二酸钠95～105mg、重组人胰岛素4～6mg、转铁蛋白6～7mg、复合氨基酸900～1100mg、d-泛酸钙4.8～5.2mg、酒石酸胆碱7～9mg、叶酸4.5～5.5mg、亚硒酸盐4.5～5.5mg、维生素c 8～8.5mg、肌醇8～8.5mg、烟酰胺4.5～5.5mg、核黄素0.5～0.7mg、盐酸硫胺4～4.5mg、盐酸吡哆辛4.5～5.5mg、葡萄糖900～1100mg、丙酮酸钠110～130mg和酚红9～10mg。
8.优选地，所述复合氨基酸由如下重量份的氨基酸组成：
9.l-盐酸精氨酸80～90份、l-盐酸胱氨酸40～45份、甘氨酸28～32份、l-盐酸组氨酸38～40份、l-异亮氨酸105～115份、l-亮氨酸105～110份、l-盐酸赖氨酸145～155份、l-甲硫氨酸38～42份、l-苯丙氨酸47～53份、l-丝氨酸48～52份、l-苏氨酸100～110份、l-色氨酸17～19份、l-酪氨酸67～73份和l-缬氨酸95～105份。
10.优选地，每升所述培养基中包括如下重量份组分：
11.二水氯化钙300mg、九水硝酸铁0.1mg、氯化钾3500mg、无水硫酸镁98mg、氯化钠6500mg、无水磷酸二氢钠110mg、丁二酸80mg、丁二酸钠100mg、重组人胰岛素5mg、转铁蛋白6.5mg、l-盐酸精氨酸85mg、l-盐酸胱氨酸42mg、甘氨酸30mg、l-盐酸组氨酸38mg、l-异亮氨酸110mg、l-亮氨酸108mg、l-盐酸赖氨酸150mg、l-甲硫氨酸40mg、l-苯丙氨酸50mg、l-丝氨
酸50mg、l-苏氨酸105mg、l-色氨酸18mg、l-酪氨酸70mg、l-缬氨酸100mg、d-泛酸钙5mg、酒石酸胆碱8mg、叶酸5mg、亚硒酸盐5mg、维生素c 8.2mg、肌醇8.2mg、烟酰胺5mg、核黄素0.6mg和盐酸硫胺4.2mg。
12.优选地，所述培养基的ph值为7.1～7.8。
13.本发明第二方面提供一种上述培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
14.(a)选择除去热原的反渗透水作为培养基用水；
15.(c)对各组分进行称量后，按照配比将各组分溶解于培养基用水中，得到混合液；
16.(d)调节混合液ph值、定容；
17.(e)将定容后的混合液进行过滤、分装，即得所述培养基。
18.优选地，所述调节ph值至7.1～7.4。
19.优选地，所述过滤采用的滤膜孔径为0.2μm。
20.本发明第三方面提供一种上述培养基在成纤维细胞扩大培养中的应用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
22.本发明上述培养基在基础培养基的基础上添加了亚硒酸盐，转铁蛋白，重组人胰岛素，其中，人重组胰岛素作为一种多肽激素，对哺乳动物细胞具有多效合成作用，促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪生成、单价阳离子和磷酸转运、蛋白质和核酸合成；转铁蛋白作为铁的载体，也有助于降低氧自由基和过氧化氢的毒性水平；亚硒酸盐是谷胱甘肽过氧化物酶和其他蛋白质的辅助因子，在培养基中作为抗氧化剂使用；本发明通过各组分的特定选择，使得制备得到的培养基能够实现成纤维细胞的扩大培养，且传代20代后细胞仍然具有较强的分裂能力。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
24.图1为本发明实验例中p1代细胞显微镜观察结果；
25.图2为本发明实验例中p2代细胞显微镜观察结果；
26.图3为本发明实验例中p3代细胞显微镜观察结果；
27.图4为本发明实验例中p4代细胞显微镜观察结果；
28.图5为本发明实验例中p5代细胞显微镜观察结果；
29.图6为本发明实验例中p6代细胞显微镜观察结果；
30.图7为本发明实验例中p7代细胞显微镜观察结果；
31.图8为本发明实验例中p8代细胞显微镜观察结果；
32.图9为本发明实验例中p9代细胞显微镜观察结果；
33.图10为本发明实验例中p10代细胞显微镜观察结果。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护
范围。
35.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
36.实施例1
37.一、用于扩增成纤维细胞的培养基
38.每升上述用于扩增成纤维纤细胞的培养基中包括如下重量份组分：
39.二水氯化钙280mg、九水硝酸铁0.12mg、氯化钾3200mg、无水硫酸镁95mg、氯化钠6800mg、无水磷酸二氢钠105mg、丁二酸82mg、丁二酸钠95mg、重组人胰岛素6mg、转铁蛋白6mg、l-盐酸精氨酸90mg、l-盐酸胱氨酸40mg、甘氨酸32mg、l-盐酸组氨酸40mg、l-异亮氨酸115mg、l-亮氨酸105mg、l-盐酸赖氨酸145mg、l-甲硫氨酸38mg、l-苯丙氨酸53mg、l-丝氨酸48mg、l-苏氨酸110mg、l-色氨酸17mg、l-酪氨酸73mg、l-缬氨酸95mg、d-泛酸钙5.2mg、酒石酸胆碱7mg、叶酸5.5mg、亚硒酸盐4.5mg、维生素c 8.5mg、肌醇8mg、烟酰胺5.5mg、核黄素0.7mg、盐酸硫胺4.5mg、盐酸吡哆辛4.5mg、葡萄糖1100mg、丙酮酸钠110mg和酚红10mg。
40.二、制备方法
41.上述用于扩增成纤维纤细胞的培养基的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
42.1、基本仪器设备
43.(1)超净工作间；
44.(2)天平：千分之一：百分之一；
45.(3)ph计；
46.(4)渗透压仪；
47.(5)过滤器：不锈钢滤器或一次性滤器；
48.(6)正压、负压蠕动系或吸引器；
49.(7)200℃烤箱：烘烤玻璃器皿、去除热原；
50.(8)超纯水器：除热原，除有机物；
51.(9)37℃温箱：用于过虑培养基的细菌培养(质控)；
52.(10)旋涡混合器。
53.2、准备工作
54.器皿清洁要做到：物理洁净(不挂水滴)、化学洁净(无有机物，如洗漆剂)、生物洁净(无致热原)；玻璃器皿的清洁操作规程如下：
55.(1)清水清洗，稀酸、稀碱处理；
56.(2)硫酸-重格酸押洗液浸泡过夜；
57.(3)清水冲洗20次；
58.(4)去离子水冲洗20次；
59.(5)200℃干烤6h；
60.(6)湿热高温、高压消毒或干烤消毒。
61.3、配制培养基
62.(1)配制用水：选择最新过滤的反渗透水，在用超纯水器过滤出去热原(toc《10)培养基用水；
63.(2)各培养基组分的粉剂称量：采用天平称量；
64.(3)粉剂溶解：将各组分溶解于培养基用水中，溶解充分，观察有无颗粒，颜色改变，得到混合液；
65.(4)用1n hcl或1n naoh调节ph至7.2(过滤后的ph将增长0.2～0.3左右)；
66.(5)定容，检测湾透压；
67.(6)尽快过滤、分装，封好瓶口，避免漏汽；
68.(7)检查滤膜，有无漏、裂、是否很脏，有未溶解物；
69.(8)过滤前、中、后三段采样用血平板、lb培养板37℃培养72h，进行无菌检测；同时，留取样品室温培养至该培养基用完；
70.(9)完整记录整个过程每一个步骤；
71.(10)细胞试用：制备的培养基是否可用，需经细胞培养试用后，才能确定；只有经过细胞试用后方可大量使用；
72.4、液体培养基保存：
73.液体培养基应于4℃冰箱避光保存，避免-20℃冻存，因为解冻时会有营养成分析出，影响培养效果；实验前0.5h从冰箱取出，放至室温平衡；未加血清液体培养基有效期为2个月；液体培养基中的l一谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解；如果细胞生长不良，可以再添加适量谷氨酰胺。
74.实施例2
75.本实施例为一种用于扩增成纤维细胞的培养基，每升上述用于扩增成纤维纤细胞的培养基中包括如下重量份组分：
76.二水氯化钙320mg、九水硝酸铁0.08mg、氯化钾3700mg、无水硫酸镁100mg、氯化钠6200mg、无水磷酸二氢钠115mg、丁二酸78mg、丁二酸钠105mg、重组人胰岛素4mg、转铁蛋白7mg、l-盐酸精氨酸80mg、l-盐酸胱氨酸45mg、甘氨酸28mg、l-盐酸组氨酸38mg、l-异亮氨酸105mg、l-亮氨酸110mg、l-盐酸赖氨酸155mg、l-甲硫氨酸42mg、l-苯丙氨酸47mg、l-丝氨酸52mg、l-苏氨酸100mg、l-色氨酸19mg、l-酪氨酸67mg、l-缬氨酸105mg、d-泛酸钙4.8mg、酒石酸胆碱9mg、叶酸4.5mg、亚硒酸盐5.5mg、维生素c 8mg、肌醇8.5mg、烟酰胺4.5mg、核黄素0.5mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛5.5mg、葡萄糖900mg、丙酮酸钠130mg和酚红9mg。
77.上述用于扩增成纤维细胞的培养基的制备方法同实施例1中的制备方法。
78.实施例3
79.本实施例为一种用于扩增成纤维细胞的培养基，每升上述用于扩增成纤维纤细胞的培养基中包括如下重量份组分：
80.二水氯化钙300mg、九水硝酸铁0.1mg、氯化钾3500mg、无水硫酸镁98mg、氯化钠6500mg、无水磷酸二氢钠110mg、丁二酸80mg、丁二酸钠100mg、重组人胰岛素5mg、转铁蛋白6.5mg、l-盐酸精氨酸85mg、l-盐酸胱氨酸42mg、甘氨酸30mg、l-盐酸组氨酸38mg、l-异亮氨酸110mg、l-亮氨酸108mg、l-盐酸赖氨酸150mg、l-甲硫氨酸40mg、l-苯丙氨酸50mg、l-丝氨酸50mg、l-苏氨酸105mg、l-色氨酸18mg、l-酪氨酸70mg、l-缬氨酸100mg、d-泛酸钙5mg、酒石酸胆碱8mg、叶酸5mg、亚硒酸盐5mg、维生素c 8.2mg、肌醇8.2mg、烟酰胺5mg、核黄素0.6mg和盐酸硫胺4.2mg。
81.上述用于扩增成纤维细胞的培养基的制备方法同实施例1中的制备方法。
82.对比例1
83.本对比例为一种用于扩增成纤维细胞的培养基，该培养基与实施例3中的培养基基本相同，区别仅在于将肌醇、烟酰胺、核黄素均替换为等量的复合氨基酸。
84.实验例
85.本实验例为采用实施例3的培养基对成纤维细胞的连续传代培养的实验研究，培养方法如下：
86.1、p0传p1
87.1.1胰酶消化：细胞铺满培养瓶底部约90％面积时，进行胰酶消化传代；
88.1.1.1将培养液用移液管吸出弃掉；
89.1.1.2用生理盐水轻轻冲洗细胞后，加入生理盐水和0.25％胰蛋白酶各1ml，平放培养瓶并轻轻摇动，使胰蛋白酶平铺于培养瓶底部；
90.1.1.3在倒置显微镜下观察，同时轻轻拍打瓶壁，待大部分细胞开始脱壁时用完全培养液中止消化；
91.1.1.4消化后细胞悬液移入50ml离心管内，用少量生理盐水洗涤培养瓶后一并移入离心管内；
92.1.2接种：
93.1.2.1离心后弃去上清，加入少量培养液，将细胞混匀；
94.1.2.2按1:3的比例进行传代接种，每瓶加入10ml培养基记为p1，并标明传代时间和条形码；
95.1.2.3细胞扩增至3t75；
96.2、p1传p2；
97.2.1将旧培养基收集于50ml离心管内；
98.2.2胰酶消化收集细胞，1000rpm离心6min；
99.2.3将上清收集20ml于50ml离心管内，用于留样做无菌检测；
100.2.4弃剩余上清，5ml培养基重悬细胞，接种至3个t175，补充培养基至25ml/瓶。
101.按照上述传代方法继续传代至p10，其中p1～p10代细胞观察结果如图1～10所示。
102.统计细胞传代数据如表1所示；
103.表1
[0104][0105][0106]
由表1可知：
[0107]
本发明通过各组分的特定选择，使得制备得到的培养基能够实现成纤维细胞的扩大培养，且传代20代后细胞仍然具有较强的分裂能力。
[0108]
按照上述实验方法，采用对比例1中的培养基进行成纤维细胞的传代培养海实验，统计细胞传代数据如表2所示：
[0109]
表2
[0110][0111]
由表2可知：
[0112]
本技术对比例1中的培养基能够实现成纤维细胞的扩大培养，但相比于实施例3中的培养基，其扩大培养效果较差。
[0113]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。