一种改造体抗菌肽oNCM及其应用

一种改造体抗菌肽oncm及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种改造体抗菌肽oncm及其应用。


背景技术：

2.近年来传统抗生素的大规模开发和滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。天然生物抗菌肽抗菌谱广，具有热稳定性和较好的水溶性，对高等动物正常细胞几乎无毒害作用，且不易产生耐药性。对不同物种抗菌肽的研究已成为热点，抗菌肽有可能作为新一代的抗菌药物替代传统抗生素。
3.抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫、肿瘤细胞均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过2600多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有良好的应用前景。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种绿海龟(cheloniamydas)抗菌肽cm-cath2的改造体抗菌肽oncm，其含有25个氨基酸残基，分子量2732.49da，是一种n端为α螺旋，c端为无规则结构的抗菌肽。
5.本发明的第一个目的是提供一种改造体抗菌肽oncm，所述改造体抗菌肽oncm的氨基酸序列为：
6.phe1orn2orn3val4orn5orn6gln7leu8gly9orn
10
val
11
leu
12
orn
13
his
14
ser
15
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16
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17
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18
val
19
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20
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21
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22
met
23
orn
24
phe
25
。
7.进一步地，所述改造体抗菌肽oncm的n端为α螺旋结构，c端为无规则结构。
8.进一步地，所述改造体抗菌肽oncm的分子量为2732.49da。
9.进一步地，上述改造体抗菌肽oncm的制备方法包括以下步骤：根据上述改造体抗菌肽oncm的氨基酸序列，采用多肽固相合成法进行化学合成，得到全序列，再利用hplc反相柱层析脱盐，得到该改造体抗菌肽oncm。
10.本发明的第二个目的是提供上述改造体抗菌肽oncm在制备抗菌剂中的应用。
11.进一步地，所述的抗菌剂用于抑制革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
12.进一步地，所述的革兰氏阳性细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌cmcc26003、金黄色葡萄球菌atcc43300、金黄色葡萄球菌31、金黄色葡萄球菌08032706)、粪肠球菌(如atcc29212)、屎肠球菌、产气荚膜梭菌(如atcc13124)和表皮葡萄球菌等。
13.进一步地，所述的革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(如大肠杆菌 atcc 25922、大肠杆菌cmcc 44102)、铜绿假单胞菌(如铜绿假单胞菌 cmcc 10104)、鲍曼不动杆菌(如鲍曼不动杆菌atcc 19606、鲍曼不动杆菌2、鲍曼不动杆菌6、鲍曼不动杆菌16)、福氏志贺氏菌(如 atcc12022)、鼠伤寒沙门氏菌(如atcc14028)、溶藻弧菌和哈维氏弧菌等。
14.本发明的第三个目的是提供上述改造体抗菌肽oncm在制备抗炎剂中的应用。
15.进一步地，所述的抗炎剂用于抑制肿瘤坏死因子(tnf-α)或白细胞介素6(il-6)。
16.本发明的第四个目的是提供上述改造体抗菌肽oncm在制备抗生物膜药物中的应用。
17.本发明上述改造体抗菌肽oncm还可以用于制备防腐剂、饲料添加剂或化妆品添加剂等。
18.本发明的第五个目的是提供一种抗菌药物组合物，该抗菌药物组合物包括上述改造体抗菌肽oncm和抗生素。其中，抗生素可为美罗培南、多粘菌素b、氨苄青霉素和万古霉素等，将改造体抗菌肽oncm和传统抗生素联用，能够大大提高抗菌肽的抗菌效果，在抗炎方面也具有一定的潜力。
19.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
20.本发明通过对绿海龟抗菌肽cm-cath2进行肽链缩短，然后将其中的阳离子氨基酸lys和arg替换成鸟氨酸orn，得到了本发明的改造体抗菌肽 oncm，其含有25个氨基酸残基，分子量2732.49da，改造后的抗菌肽比母本cm-cath2序列短分子量小，所以其合成成本更低、免疫原性更低，具有结构简单、溶血活性低、稳定性高、制备方法简单等有益特点。
21.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
22.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
23.图1为改造体抗菌肽oncm抗炎活性测定结果；
24.图2为改造体抗菌肽oncm蛋白酶稳定性测定结果；
25.图3为改造体抗菌肽oncm蛋白酶稳定性测试的峰面积变化图；
26.图4为改造体抗菌肽oncm和ncm4对细菌生物膜的去除活性；其中，a为a.baumannii atcc19606，b为s.aureus cmcc26003；*代表p《0.05,** 代表p《0.01,***代表p《0.001；
27.图5为改造体抗菌肽oncm和ncm4对细菌生物膜形成的抑制作用；其中，a为a.baumannii atcc19606，b为s.aureus cmcc26003；*代表 p《0.05,**代表p《0.01,***代表p《0.001。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
29.实施例1
30.绿海龟改造体抗菌肽oncm的化学合成
31.绿海龟抗菌肽cm-cath2是基因编码的一种多肽，含有33个氨基酸残基，分子量4089.9da，等电点12.96。绿海龟抗菌肽cm-cath2全序列为：arg1arg2ser3arg4phe5gly6arg7phe8phe9lys
10
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gly
28
gly
29
arg
30
met
31
arg
32
phe
33
。
32.根据绿海龟抗菌肽cm-cath2的氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了改造体ncm4，其全序列为：phe1lys2lys3val4arg5lys6gln7leu8gly9arg
10
val
11
lys
12
arg
13
his
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ser
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arg
16
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18
val
19
gly
20
gly
21
arg
22
met
23
arg
24
phe
25
)，然后进一步对该改造体ncm4进行氨基酸替换的结构改造，将其中的阳离子氨基酸lys和arg替换成鸟氨酸orn，得到抗菌肽oncm，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成，具体制备方法如下：
[0033]ⅰ、oncm的制备方法：根据上述oncm的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433a,appliedbiosystems)合成其全序列，利用hplc反相柱层析脱盐。
[0034]ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)。
[0035]ⅲ、纯化的oncm用高效液相色谱hplc方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0036]
测定结果为：
[0037]
oncm是绿海龟抗菌肽cm-cath2的一种改造体。oncm是一种直链多肽，其含有25个氨基酸残基，分子量2732.49da。oncm全序列为：phe1orn2orn3val4orn5orn6gln7leu8gly9orn
10
val
11
leu
12
orn
13
his
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ser
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met
23
orn
24
phe
25
。
[0038]
实施例2
[0039]
oncm药理实验：
[0040]
1.oncm抗菌活性测定：
[0041]
(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株均匀涂布于mh固体培养基(北京索莱宝科技有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的抗菌肽oncm、ncm4或cm-cath2样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
[0042]
(2)抗菌肽oncm最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration)测定(2倍稀释法)：
[0043]
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行mic测定实验。试验菌株接种到mh液体培养基(北京索莱宝科技有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜mh液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2
×
105cfu/ml待用。
[0044]
在无菌96孔板各孔中预先加入100μlmh液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用mh液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的抗菌肽oncm、ncm4或cm-cath2样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
[0045]
表1稀释方法
[0046][0047]
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2 所示。
[0048]
表2改造体抗菌肽oncm抗菌活性
[0049][0050][0051]
mic：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。
[0052]
由表2可见，抗菌肽oncm对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括部分临床分离致病菌，mic值处于4.69-75 μg/ml的范围。
[0053]
2.oncm溶血活性测定：
[0054]
将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10
7-10
8 cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的oncm、 ncm4或cm-cath2样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用tritonx-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比h％＝a
样品-a
阴性对照
/a阳性对照
×
100％。
[0055]
结果表明样品浓度为100μg/ml，oncm的溶血百分比为2.33％，ncm4 的溶血百分比为1.51％，而cm-cath2的溶血百分比为4.1％。说明oncm 具有较低的溶血活性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解。尤其抗菌活性范围内，安全性高。
[0056]
3.oncm抗炎活性测定：
[0057]
提取6-8周龄c57小鼠腹腔巨噬细胞，用含10％血清的1640培养基培养过夜，次日换成含2％血清的1640培养基，然后用终浓度为100ng/ml的大肠杆菌lps(sigma,美国)刺激细胞，同时给多肽oncm或ncm4，终浓度为20μg/ml，设不给多肽和lps的空白对照组与仅给lps的阳性对照组，共孵育16h，取上清，用elisa试剂盒((r&d,美国)检测上清液中促炎因子il-6和tnf-α的含量。每个做三个平行。
[0058]
结果如图1所示，oncm能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞中lps诱导的促炎因子il-6和tnf-α表达，表明oncm具有极强的抗炎活性，且其抗炎活性与ncm4相当。
[0059]
4.改造体抗菌肽oncm稳定性实验研究：
[0060]
(1)酶稳定性测试：将细胞消化用的0.25％胰酶与多肽样品，按照摩尔比1:200的比例混合，37℃下孵育，分别在0、6、12、24h时取样50μl，然后用多肽溶剂将所取样品稀释1倍，用0.22μm的滤膜过滤，取20μl用反向高效液相色谱测定多肽样品的残留量。其中a相用含0.1％三氟乙酸 (tfa)的纯水，b相用含0.1％tfa的乙腈，进行梯度洗脱，得到多肽样品 oncm与胰酶混合后不同时间点的洗脱峰和积分面积，然后用软件 origin2018作图。
[0061]
结果如图2和3所示，抗菌肽oncm具有很强的酶稳定性，与酶作用 24h后oncm的峰高和峰面积仍然变化不大，而抗菌肽ncm4和cm-cath2 6h就显著降解，说明oncm的稳定性显著优于ncm4和cm-cath2。
[0062]
(2)盐耐受性、热耐受性和热稳定性测试
[0063]
盐耐受性：大肠杆菌atcc25922用mh液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)于37℃培养12小时，然后分别用含0、50、100、150、200 和400mm氯化钠的新鲜mh液体培养基稀释到106cfu/ml。用含相应氯化钠浓度的mh液体培养基制备不同浓度梯度的oncm、ncm4和cm-cath2 样品。利用2倍稀释法测定oncm、ncm4和cm-cath2对大肠杆菌 atcc25922的mic值，以此确定氯化钠对oncm、ncm4和cm-cath2 抗菌活性的影响。
[0064]
热耐受性：oncm、ncm4或cm-cath2溶解于灭菌的去离子水中(2 mg/ml)，在4、20、37、50、70和90℃孵育1小时，然后利用2倍稀释法测定样品对大肠杆菌atcc25922的mic值，以此确定不同温度加热对样品抗菌活性的影响。
[0065]
热稳定性：oncm、ncm4或cm-cath2溶解于灭菌的去离子水中(2 mg/ml)，在37℃孵育0-96小时。于0、6、12、24、48、72和96小时分别取样品检测对大肠杆菌atcc25922的mic值，以此确定样品的热稳定性。
[0066]
如表3所示，oncm、ncm4和cm-cath2具有很强的盐耐受性。在低于或等于人体生理盐浓度下(≤150mm nacl)，oncm、ncm4和 cm-cath2的抗菌活性保持不变。在盐浓度高于人体生理盐浓度后，oncm、 ncm4和cm-cath2的抗菌活性也只是随着盐浓度的升高而略有降低。
[0067]
表3改造体抗菌肽oncm盐耐受性
[0068][0069]
如表4所示，oncm具有很强的热耐受性。oncm溶液在90℃放置1小时之后，其抗菌活性不会改变。与之相比，ncm4和cm-cath2的热耐受性略差，在高温下加热1h后，其mic值均有升高。
[0070]
表4改造体抗菌肽oncm热耐受性
[0071][0072]
许多传统的抗生素，如头孢类抗生素的溶液极不稳定，几个小时内就会失去活性，这大大限制了它们的使用。与之不同，oncm溶液具有很好的热稳定性。oncm溶液在37℃放置96小时后，其抗菌活性不会改变(如表5)。与之相比，ncm4和cm-cath2的热稳定性略差，在37℃放置96小时后，其mic值均有升高。
[0073]
表5改造体抗菌肽oncm热稳定性
[0074][0075]
实施例3
[0076]
改造体抗菌肽oncm和ncm4的生物膜清除和抑制活性测
[0077]
1.生物膜清除活性测定
[0078]
从-80℃冰箱中取出保存的菌株，37℃水浴快速融化，用接种环蘸取少许液体，在lb固体培养基上呈z字形分四个区域划线，每次划线从上次末端开始，37℃恒温培养至长出单菌落；挑取单菌落于无菌液体mhb培养基中，37℃、180rpm振荡培养至对数生长期；检测菌
液浓度，稀释成2
×
10
7 cfu/ml。向无菌96孔板中加入上述菌液200μl，37℃培养48h使生物膜形成。吸出每孔的菌液，并用pbs洗涤三次。每孔加入200μl稀释后的多肽样品使多肽样品终浓度为0.5
×
mic、1
×
mic、2
×
mic、4
×
mic和8
×
mic， 37℃恒温培养24h。每孔加入结晶紫染液(0.1％)，染色30min后吸出染液，无菌pbs洗涤三次，超净台中风干。每孔加入100μl无水乙醇，静置 20min，溶解结晶紫。在紫外波长560nm下检测od值，实验设置三个平行。用以下公式计算生物膜形成的百分比(biofilm retention％，br％)： br(％)＝100％-[100％
×
(f
0-f
peptide
)/f0]该实验中选择pbs作为阴性对照，其测定值视为最大生物膜残留量。biofilm retention％，br％为生物膜残存百分比，f0为pbs处理组的吸光值，f
peptide
为多肽处理组吸光值。
[0079]
2.生物膜抑制活性测定
[0080]
从-80℃冰箱中取出保存的菌株，37℃水浴快速融化，蘸取少许液体在 lb固体培养基上呈z字形划线，在37℃恒温培养至长出单菌落；挑取单菌落于无菌液体mhb培养基中，37℃,180rpm振荡培养至对数生长期；检测菌液浓度，稀释成2
×
107cfu/ml。向无菌96孔板中加入上述菌液190μl，每孔加入稀释后的多肽样品，每个浓度设置3个平行。使得多肽样品终浓度为0.5
×
mic、1
×
mic、2
×
mic、4
×
mic和8
×
mic，37℃恒温培养48h。吸出每孔的菌液，并用pbs洗涤三次，把板置于超净台通风吹干。每孔加入结晶紫染液(0.1％)，染色30min后吸出染液，无菌pbs洗涤三次，超净台中风干。每孔加入100μl无水乙醇，静置20min，溶解结晶紫。在紫外波长560nm下检测od值。用以下公式计算生物膜形成的百分比(biofilmformation％，bf％)：bf(％)＝100％-[100％
×
(f
0-f
peptide
)/f0]其中 pbs(f0)为阴性对照，其测定值视为最大生物膜形成量。biofilm formation％， bf％为生物膜形成百分比，f
peptide
为多肽处理组吸光值。
[0081]
如图4和5所示，改造体多肽oncm和ncm4能浓度依赖性的清除鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌产生的生物膜，随着多肽浓度的升高，清除率升高。且oncm比ncm4较显著的清除鲍曼不动杆菌产生的生物膜。改造体多肽oncm和ncm4能浓度依赖性的抑制鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌产生生物膜，两者没有显著差异。
[0082]
实施例4
[0083]
改造体抗菌肽oncm和ncm4与抗生素协同抗菌作用测定
[0084]
将多肽用无菌水配成20
×
8mic的浓度，依次再倍比稀释直到 20
×
1/64mic，加上溶剂共11个浓度备用。称取抗生素(美罗培南、多粘菌素b、氨苄青霉素和万古霉素)药品，用无菌水溶成2mg/ml的溶液，依次倍比稀释得到4mic-1/16mic的浓度，加上溶剂共8个浓度备用。稀释菌液至5
×
105cfu/ml，备用。棋盘法测:在96孔板中加入90μl稀释好的菌液；将多肽加到菌中，每孔5μl，每一列一个浓度，共11列：将抗生素加到菌中，每孔5μl，每一行一个浓度，共8行；找到mica,micb,a,b计算fic， fic＝fmica+fmicb＝a/mica+b/micb(a,b代表两药联用的最佳集合点处的浓度，mica,micb代表两药单用时的mic)fic＜0.5时有协同作用，fic ＞4时有拮抗作用，0.5＜fic＜4时两药有相加作用。加药方式如下表所示。
[0085][0086]
选用鲍曼不动杆菌(a.baumanniiatcc19606)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(s.aureus atcc43300)作为供试菌，检测了几种抗生素与改造体抗菌肽oncm的协同抗菌作用。其中美罗培南和多粘菌素b均能与之协同发挥抗鲍曼不动杆菌的作用，fici指分别为0.375和0.375。而氨苄青霉素和万古霉素能与改抗造体抗菌肽oncm协同抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用，fici指数分别为0.25和0.375。
[0087]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。