治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治RSV病毒感染的产品中的应用

治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及疾病治疗技术领域，特别是涉及一种治疗性缺陷干扰颗粒及其在制备用于防治rsv病毒感染的产品中的应用。


背景技术：

2.呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是造成婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒，是目前除新型冠状病毒外造成全球范围内医疗、社会负担最重的呼吸道病原体。rsv感染仅引起轻微的呼吸道纤毛上皮细胞损伤，但在2～6个月的婴幼儿感染中，可引起细支气管炎和肺炎等严重呼吸道疾病，其发生机制除病毒感染直接作用外，可能与婴幼儿呼吸道组织学特性、免疫功能发育未完善及免疫病理损伤有关。该病毒不能在鸡胚中生长，但可在多种培养细胞中缓慢增殖，约2～3周出现细胞病变，病变特点是形成细胞融合形成的多核巨细胞，胞质内有嗜酸性包涵体。rsv感染仍缺乏经济有效的特异性治疗手段，也无疫苗可用，多为对症支持治疗，其中包括了病毒唑(ribavirin)、激素类药物的使用，但其副作用严重。synagis帕利珠单抗(palivizumab)是目前唯一用于预防rsv的抗体，但其仅用作预防性治疗，价格昂贵，有严格用药限制并有耐药性问题，医疗救治迫切需要rsv特效抗病毒药物。
3.对于抗病毒药物研究来说，存在两个主要难点。首先，病毒“寄生性”导致的病毒生命过程与机体细胞生命过程难以区分。药物在针对病毒起作用的同时也影响到机体细胞，杀敌一千，自损八百。如何尽可能有效区分两者是成药的关键。其次，病毒特别是rna病毒的高变异特性带来的耐受性，极大增加药物开发难度和成本。病毒高变异特点可能使研究成本高昂的药物/疫苗的效果大打折扣。如何应对病毒特别是rna病毒高突变特点，提高药物适应能力亦为成药的关键。而目前，针对呼吸道合胞病毒的特异性防治药物仍然十分缺乏。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种能够特异性防治呼吸道合胞病毒感染的治疗性缺陷干扰颗粒。
5.一种治疗性缺陷干扰颗粒，从3’末端至5’末端的方向依次包括以下元件：rsv病毒基因组的前导序列和rsv病毒基因组的尾随序列。
6.在其中一个实施例中，所述rsv病毒基因组的前导序列和所述rsv病毒基因组的尾随序列之间，沿3’末端至5’末端的方向还依次包括rsv病毒基因组的转录起始信号、rsv病毒ns1基因的非编码区、报告基因序列、rsv病毒l基因的非编码区和rsv病毒基因组的转录终止信号。
7.在其中一个实施例中，所述报告基因序列为荧光蛋白基因序列。
8.在其中一个实施例中，所述rsv病毒基因组的前导序列、所述rsv病毒基因组的转录起始信号、所述rsv病毒ns1基因的非编码区、所述rsv病毒l基因的非编码区、所述rsv病
毒基因组的转录终止信号以及rsv病毒基因组的尾随序列均来源于rsv-long株。
9.本发明还提供了一种dna片段，所述dna片段编码如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒。
10.本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的dna片段。
11.在其中一个实施例中，所述重组表达载体还含有t7启动子序列、t7终止子序列、锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列中的一种或多种。
12.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中含有如上所述的dna片段或如上所述的重组表达载体。
13.本发明还提供了一种如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒、dna片段、重组表达载体或宿主细胞在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
14.本发明还提供了一种抗呼吸道合包病毒药物，其包括如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒，以及药学上可用的辅料。
15.自然情况下，病毒在感染增殖过程中会产生某些缺陷突变，从而产生缺陷干扰颗粒(defective interfering particle,dip)，这些dip无单独的自我复制能力，但在有正常病毒的细胞中可竞争抑制正常病毒并“盗取”病毒重要蛋白实现自身复制、包装、释放，并可感染新细胞，这就为人工设计dip用于抑制病毒复制提供了重要基础，并且这种抑制作用是特异性的，但是对于不同的病毒而言，具体何种结构的缺陷干扰颗粒能够获得优异的病毒抑制作用则是不同且未知的。本发明通过分析rsv病毒的基因组结构及其复制、转录机制，开发并筛选得到一种人工rsv治疗性缺陷干扰颗粒(artificial therapeutic defective interfering particle,atdip)作为特异性抗病毒药物，并对其抗病毒效果进行了分析，证明该治疗性缺陷干扰颗粒具备感染后的治疗性作用以及感染前的预防性作用，具备持续抗病毒能力，而且对于同种属病毒均有良好的抗病毒作用，能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。
附图说明
16.图1为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒rsv-atdip-egfp(a)及其对照rsv-atdip-control(b)的结构示意图；
17.图2为本发明一实施例的利用pbr322构建rsv-atdip核酸载体prsv-atdip-egfp(a)及其对照prsv-atdip-control(b)的结构示意图；
18.图3为本发明一实施例的体外转录rna的电泳检测结果；其中，m为rna marker，atdip为rsv-atdip-egfp条带，ctrl为rsv-atdip-control条带；
19.图4为本发明一实施例的转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control培养48h(48h.p.i.)后观察细胞病变产生的情况的显微照片；其中，rsv(-)control为阴性对照，rsv(+)control为阳性对照，rsv-atdip-control为对照干扰颗粒，rsv-atdip-egfp为本发明实施例的治疗性缺陷干扰颗粒；
20.图5为本发明一实施例的转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control培养48h(48h.p.i.)后分别取培养上清进行rsv qrt-pcr定量检测和利用斑点形成实验进行rsv pfu测定的结果；其中，a为qrt-pcr定量检测的核酸水平浓度，b为斑点形成实验的活病毒粒子显微照片，rsv(-)control为阴性对照，rsv(+)control为阳性对照，rsv-atdip-control
为对照干扰颗粒，rsv-atdip-egfp为本发明实施例的治疗性缺陷干扰颗粒；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值
±
sem，t-test分析显著性，其中***表示p《0.001，ns表示无显著差异；
21.图6为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒rsv-atdip-egfp对感染前的预防性效果分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值
±
sem，t-test分析显著性，其中***表示p《0.001，ns表示无显著差异；
22.图7为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒rsv-atdip-egfp在rsv感染细胞中的持续抗病毒能力分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值
±
sem；
23.图8为呼吸道合胞病毒不同型别主要启动子序列的对比示意图；
24.图9为本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒rsv-atdip-egfp对不同呼吸道合胞病毒株的抗病毒作用分析结果；数据表示为病毒核酸浓度的平均对数值
±
sem，t-test分析显著性，***表示p《0.001。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.本发明一实施例的治疗性缺陷干扰颗粒，如图1所示，从3’末端至5’末端的方向依次包括以下元件：rsv病毒基因组的前导序列(leader，le)以及rsv病毒基因组的尾随序列(trailer，tr)。
28.分析rsv病毒的特点，其属于副粘病毒科(paramyxoviridae)的肺病毒属(pneumovirus)，为有囊膜的非分节段的负链rna病毒[(-)ssrna]。基因组约15.2kb，rsv的基因顺序为3
’‑
leader-ns1-ns2-n-p-m-sh-g-f-m2-l-trailer-5’，整个基因组可转录10个mrna、编码11个蛋白，包括4个与基因组转录与复制密切相关的n、p、l和m2-1，2个粘附蛋白g、f。目前，rsv分为两种抗原亚型a和b，进一步分为11个rsv-a和23个rsv-b基因型，而病毒变异就主要集中位于g、f蛋白。rsv的leader(le)和trailer(tr)分别位于基因组3’和5’末端，长度分别为44nt和155nt，是基因组rna合成的启动子区，也是病毒包装信号所在，其中前11nt是其启动子核心元件，可以直接启动rna依赖的rna聚合酶(rdrp)进行病毒转录和复制两种不同的rna合成过程，且其中3、5、8、9、10和11位是关键核苷酸。转录、复制后最终产生新的病毒粒子所需的蛋白、基因组，从而实现rsv复制增殖。该过程是为病毒的核心生命过程，同样的，该过程如遭到破坏将可直接抑制病毒复制，是重要的抗病毒研究靶点。
[0029]
自然情况下，病毒在感染增殖过程中会产生某些缺陷突变，从而产生缺陷干扰颗粒(defective interfering particle,dip)，这些dip无单独的自我复制能力，但在有正常病毒的细胞中可竞争抑制正常病毒并“盗取”病毒重要蛋白实现自身复制、包装、释放，并可感染新细胞，这就为人工设计dip用于抑制病毒复制提供了重要基础，并且这种抑制作用是
特异性的，但是对于不同的病毒而言，具体何种结构的缺陷干扰颗粒能够获得优异的病毒抑制作用则是不同且未知的。本发明通过分析rsv病毒的基因组结构及其复制、转录机制，开发并筛选得到一种人工rsv治疗性缺陷干扰颗粒(artificial therapeutic defective interfering particle,atdip)作为特异性抗病毒药物，并对其抗病毒效果进行了分析，证明该治疗性缺陷干扰颗粒具备感染后的治疗性作用以及感染前的预防性作用，具备持续抗病毒能力，而且对于同种属病毒均有良好的抗病毒作用，能够实现针对突变体的快速、灵活应变，有效解决病毒高突变引起的耐受性问题。
[0030]
在一些具体示例中，rsv病毒基因组的前导序列和rsv病毒基因组的尾随序列之间，沿3’末端至5’末端的方向还依次包括rsv病毒基因组的转录起始信号、rsv病毒ns1基因的非编码区、报告基因序列、rsv病毒l基因的非编码区和rsv病毒基因组的转录终止信号。如此，通过报告基因的表达便于进行实验分析检测，但可以理解其并非抗病毒作用所必需。可选地，报告基因序列为荧光蛋白基因序列，例如绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白序列等，但不限于此。
[0031]
在一些具体示例中，上述rsv病毒基因组的前导序列、rsv病毒基因组的转录起始信号、rsv病毒ns1基因的非编码区、rsv病毒l基因的非编码区、rsv病毒基因组的转录终止信号以及rsv病毒基因组的尾随序列均来源于rsv-long株(genbank accession no.kf713490)，但来源于其他rsv病毒株的上述序列也可。
[0032]
本发明一实施例的dna片段，其编码如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒。
[0033]
本发明一实施例的重组表达载体，该重组表达载体含有如上所述的dna片段，可以利用重组表达载体进行体外转录以获得上述治疗性缺陷干扰颗粒。
[0034]
可以理解，载体类型包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
[0035]
在一个具体示例中，重组表达载体还含有t7启动子序列、t7终止子序列、锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列中的一种或多种。通过锤头状核酶序列和丁型肝炎病毒核酶序列可以辅助切割以提高转录rna的准确性。
[0036]
在一个具体示例中，重组表达载体基于pbr322构建得到。
[0037]
本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞的基因组中含有如上所述的dna片段或重组表达载体。宿主细胞的类型包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞、hek 293细胞等的人细胞，或动物细胞。
[0038]
本发明还提供了如上所述的治疗性缺陷干扰颗粒、dna片段、重组表达载体或宿主细胞在制备用于防治呼吸道合胞病毒感染的产品中的应用。
[0039]
在一个具体示例中，上述产品为试剂、试剂盒、药物或装置等，可以理解，具体类型不限于此。
[0040]
本发明一实施例的用于防治呼吸道合胞病毒感染的药物，其包括如上所述治疗性缺陷干扰颗粒，以及药学上可用的辅料。
tr-ge-ncr(l)-egfp-ncr(ns)-gs-le-hdv ribozyme-t7 teminator-3’，同时如图2b所示，构建缺少le和tr序列的prsv-atdip-control。
[0053]
3、体外转录
[0054]
(1)prsv-atdip-egfp及prsv-atdip-control质粒使用ecorv单酶切；
[0055]
(2)酶切产物分别使用transcriptaid t7 high yield transcription kit进行体外转录；
[0056]
(3)体外转录产物使用dnase i消化30min去除dna；
[0057]
(4)rna回收试剂盒回收rna；
[0058]
(5)1.5％agarose gel电泳检测核酸完整性，如图3所示，并使用nanodrop检测rna浓度和纯度。
[0059]
实施例二：rsv-atdip对感染后的治疗性效果分析
[0060]
1、使用96孔板，接种hep-2 1
×
104cell/well dmem+10％fbs培养基于37℃5％co2培养箱中过夜；
[0061]
2、rsv-long(moi 0.05)接种感染hep-2 2h，后使用pbs洗一次去除未结合病毒，培养于dmem+2％fbs中；
[0062]
3、使用lipo3000转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control；感染后培养48h(48h.p.i.)后观察细胞病变产生的情况，如图4所示。
[0063]
4、为分析不同组别下病毒增殖情况，分别取48h.p.i.后培养上清进行rsv qrt-pcr定量检测和利用斑点形成实验(focus-forming assay,ffa)进行rsv pfu(plaque-forming unit)测定，如图5所示。
[0064]
(1)rsv qrt-pcr定量分析采用本发明申请人过往专利技术进行(zl201610044078.2)。
[0065]
(2)rsv pfu测定使用特异性抗体测得细胞感染病毒后的f蛋白，并通过显色反应显示出来。
[0066]
1)接毒前12h铺hep-2细胞至96孔板；
[0067]
2)待细胞密度达到90％～95％；
[0068]
3)d2(dmem含2％fbs,hepes,l-g,p/s,neaa)10倍梯度稀释病毒并接种细胞，每个稀释度接4～6个复孔；
[0069]
4)放入35℃5％co2培养箱，每隔15min摇板；
[0070]
5)感染1h后吸弃培养基，加入200μl dmem-agarose mulch(2％seaplaque gtg-agarose mixed 1:1with 2
×
dmem medium containing 4％fbs)；
[0071]
6)48h后去除琼脂；
[0072]
7)冰冻无水乙醇固定细胞20min；
[0073]
8)使用rsv f抗体、hrp二抗孵育；
[0074]
9)使用trueblue显色。
[0075]
图5.rsv-atdip可显著抑制rsv感染后细胞病毒增殖
[0076]
结果显示与对照组相比，转染rsv-atdip-egfp的细胞的病变明显少于rsv感染对照组和rsv-atdip-control组，与感染阴性组基本一致(图4)。且rsv-atdip-egfp组比对照组病毒量从病毒核酸(图5a)到具感染性的病毒粒子(图5b)均显著降低，达到2log差异，可
见rsv-atdip具备感染后的治疗作用。
[0077]
实施例三：rsv-atdip对感染前的预防性效果分析
[0078]
1、使用96孔板，接种hep-2 1
×
104cell/well dmem+10％fbs培养基于37℃5％co2培养箱中过夜；
[0079]
2、使用lipo3000转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control；4h后去除培养上清；
[0080]
3、rsv-long(moi 0.05)接种感染hep-2 2h，后使用pbs洗一次去除未结合病毒，培养于dmem+2％fbs中；
[0081]
4、感染后培养48h(48h.p.i.)后，取培养上清进行rsv qrt-pcr定量检测，如图6所示。
[0082]
结果显示在rsv-atdip-egfp存在下，细胞感染rsv后，其病毒复制能力有显著下降，rsv核酸下降》2log，表明rsv-atdip具备感染前的预防作用。
[0083]
实施例四：rsv-atdip的持续抗病毒能力分析
[0084]
1、使用96孔板，接种hep-2 1
×
104cell/well dmem+10％fbs培养基于37℃5％co2培养箱中过夜；
[0085]
2、rsv-long(moi 0.05)接种感染hep-2 2h，后使用pbs洗一次去除未结合病毒，培养于dmem+2％fbs中；
[0086]
3、使用lipo3000转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control；
[0087]
4、48h.p.i.后，
[0088]
(1)取细胞培养上清接种新鲜培养的hep-2细胞；之后每48h.p.i.后都取上清接种新鲜hep-2细胞，总计连续接种10代；
[0089]
(2)取细胞培养上清进行rsv qrt-pcr定量检测，后续接种代数同样进行定量分析。
[0090]
结果显示在rsv-atdip存在下，病毒增殖受到持续的抑制，表明rsv-atdip具备持续抗病毒作用。
[0091]
实施例五：rsv启动子核心区分析及同种属病毒抗病毒效果
[0092]
1、rsv启动子核心区关键核苷酸序列分析
[0093]
目前，rsv可分为两种抗原亚型a和b，进一步分为11个rsv-a和23个rsv-b基因型，病毒变异主要集中位于g、f蛋白。rsv基因组3
’‑
le(44nt)为其启动子区，其中前11nt为其核心区，可直接启动后续rna合成，且3、5、8、9、10和11位核苷酸为关键核苷酸。分析rsv不同型别主要启动子序列，关键核苷酸在各型别中都高度保守，如图8所示。
[0094]
2、不同rsv病毒株抗病毒分析
[0095]
使用启动子核心区第4位核苷酸(4c/4g，但非关键核苷酸)与rsv-long存在差异的rsv-a2病毒株及启动子非核心区存在差异的rsv-b(201804037)株病毒(实验室分离保存)对本发明所设计rsv-atdip进行抗病毒分析。
[0096]
(1)使用96孔板，接种hep-2 1
×
104cell/well dmem+10％fbs培养基于37℃5％co2培养箱中过夜；
[0097]
(2)rsv-a2和rsv-b(201804037)(moi 0.05)接种感染hep-2 2h，后使用pbs洗一次去除未结合病毒，培养于dmem+2％fbs中；
[0098]
(3)使用lipo3000转染rsv-atdip-egfp和rsv-atdip-control；
[0099]
(4)分别取48h.p.i.后培养上清进行rsv qrt-pcr定量检测。
[0100]
结果显示启动子非关键核苷酸的差异不影响atdip的抗病毒作用，如图9所示。综合图8和图9的实验结果表明rsv-atdip具备同种属病毒的抗病毒能力。
[0101]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0102]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。