咖啡碱降解菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种咖啡碱降解菌及其应用。


背景技术：

2.中国是茶叶的发源地之一，至今已有四千七百多年的历史。茶叶除了饮用价值，还具有较高的药用价值，可以起到保健、预防疾病的作用，其药理功效包括安神、醒酒、消食、下气、调节血脂、利尿通便、固齿、益气力等。然而，茶叶中含有大量的咖啡碱，很大程度上会干扰睡眠和昼夜节奏，从而加剧睡眠问题。因为咖啡碱兴奋中枢神经系统的作用，给一部分爱喝茶，却对咖啡碱较为敏感的人群带来“饮茶失眠”的困扰。
3.脱除咖啡碱的方法目前主要有水脱除法、吸附分离法、溶剂萃取法、超临界二氧化碳萃取法、酶法和微生物法等。物理方法脱除咖啡碱的过程中，容易导致茶叶中其他风味物质的损失，影响茶叶的生物活性及其饮用口感，使茶叶的香味和味道大打折扣。同时，还要考虑加工过程对环境和产品的安全性。因此迫切需要更多安全、绿色的方法来降低茶叶中咖啡碱的含量。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种咖啡碱降解菌及其应用，具体是一株发光假蜜环菌用于茶叶发酵中降解茶叶中咖啡碱。
5.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
6.咖啡碱降解菌，为发光假蜜环菌(desarmillaria tabescens)，保藏编号为cgmcc no:40115。
7.发光假蜜环菌的its rdna基因具有序列表seq.id.no.1的碱基序列。
8.上述咖啡碱降解菌在降解咖啡碱中的应用。
9.所降解咖啡碱是降解茶叶中的咖啡碱。
10.茶叶为绿茶、黄茶、白茶、青茶、红茶、黑茶、茶梗或代用茶。
11.上述咖啡碱降解菌降解茶叶中咖啡碱的方法，将降解菌接种与茶叶上培养。
12.培养过程温度为20～27℃，时间为100～150天。
13.发明人通过微生物筛选技术，根据发光假蜜环菌的特性，在一定的培养条件下，通过驯化培养，得到了能够在茶叶上自然生长且具有降解咖啡碱功能的菌株。该咖啡碱降解菌以咖啡碱作为其生长所需的碳源和氮源，并可在酶的作用下对咖啡碱进行降解。实验证明，本发明的咖啡碱降解菌能够在茶叶上自然生长，即以茶叶为唯一营养物质的特殊环境中存活且无需额外添加任何营养物质，该菌株相关酶降解咖啡碱的活性高，对茶叶中咖啡碱的降解率达40％以上，且具有成本低，绿色、安全、无毒等优点。据此，发明人还建立了相应降解方法，该法通过微生物的发酵作用，能够高效降解茶叶中的咖啡碱，无需工业方法除咖啡碱，符合现在国家倡导的绿色产品的发展理念。因此，本发明可以用于绿茶、黄茶、白茶、青茶、红茶、黑茶、茶梗及其他含咖啡碱的代用茶中咖啡碱的降解，对于开发低咖啡碱茶
叶具有很好的应用价值。
附图说明
14.图1是本发明咖啡碱降解菌——发光假蜜环菌的单菌落形态图。
15.图2是实施例2中发酵后的绿茶图。
16.图3是实施例2中绿茶发酵前后咖啡碱含量的液相检测图(hplc)。
17.图4是实施例3中发酵后的红茶图。
18.图5是实施例3中红茶发酵前后咖啡碱含量的液相检测图(hplc)。
19.保藏信息说明
20.发光假蜜环菌(desarmillaria tabescens)，保藏编号为cgmcc no:40115，保藏日期：2022年3月21日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
21.保藏条件：长期保藏，超低温冻结。
具体实施方式
22.实施例1咖啡碱降解菌的筛选
23.在无菌环境下，将生长状态良好的菌丝接种到pda培养基的平板上，于23～27℃温度下培养15天，得到纯化培养的发光假蜜环菌，其菌落形态如图1所示。
24.(一)菌株鉴定
25.采用solarbio真菌dna提取试剂盒获得发光假蜜环菌基因组dna，通过pcr方法对菌株its基因进行扩增并送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序分析，用于扩增its基因的引物如下：
26.上游引物序列为：5’tccgtaggtgaacctgcgg 3’，
27.下游引物序列为5’tcctccgcttattgatatgc 3’。
28.pcr反应条件是：95℃预变性4min，95℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸1min，反应32个循环，72℃延伸10min。通过使用ncbi的blast功能，在genebank数据库中进行序列比对发现，本发明发光假蜜环菌的核糖体rna保守序列与desarmillaria tabescens相似度为98.93％，从而确定此菌株为发光假蜜环菌，命名为发光假蜜环菌(desarmillaria tabescens)。
29.本发明咖啡碱降解菌——发光假蜜环菌的its rdna基因序列见序列表seq.id.no.1。
30.(二)菌株驯化
31.茶叶培养基配方：30g茶叶/瓶、0％、0.5％、1％、1.5％、2％的蔗糖溶液。
32.将纯化培养的发光假蜜环菌，接种到含有2％蔗糖的茶叶培养基中，置于20℃～27℃中培养，待发光假蜜环菌长满整个组培瓶。此为f1代的驯化培养。
33.将f1代的驯化培养的发光假蜜环菌，接种到含有1.5％蔗糖的茶叶培养基中，置于20℃～27℃中培养，待发光假蜜环菌长满整个组培瓶。此为f2代的驯化培养。
34.将f2代的驯化培养的发光假蜜环菌，接种到含有1％蔗糖的茶叶培养基中，置于20℃～27℃中培养，待发光假蜜环菌长满整个组培瓶。此为f3代的驯化培养。
35.将f3代的驯化培养的发光假蜜环菌，接种到含有0.5％蔗糖的茶叶培养基中，置于20℃～27℃中培养，待发光假蜜环菌长满整个组培瓶。此为f4代的驯化培养。
36.将f4代的驯化培养的发光假蜜环菌，接种到不含蔗糖的茶叶培养基中，置于20℃～27℃中培养，待发光假蜜环菌长满整个组培瓶。此为f5代的驯化培养。
37.为方便研究和使用，将f5代的菌种保存备用。
38.(三)咖啡碱降解测定
39.采用高效液相色谱法对茶叶中的咖啡碱进行含量测定，色谱条件如下：
40.色谱柱：welchrom xdb-c18柱(4.6
×
250mm，5μm)，
41.流动相：乙腈(a)-水(b)(0～15min，5％～10％a；15～40min，10％～20％a；40～50min，20％～35％a；50～55min，35％～85％a，55～65min，85％～95％a；65～70min，95％a)，流速：1.0ml/min，
42.柱温：35℃，
43.检测波长：280nm，
44.进样量：20μl。
45.供试液的制备：
46.称量5g茶叶加入100ml蒸馏水，100℃浸提60min，中速滤纸过滤，滤液定容至100ml。然后用0.45μm的水系微孔过滤头过滤，利用液相进行检测分析，并计算咖啡碱的降解率。
47.实施例2咖啡碱降解菌降解绿茶中咖啡碱
48.称取绿茶放于组培瓶中，加入适量蒸馏水至茶叶含水量为60％，121℃条件下灭菌30min。选取长势良好的发光假蜜环菌平板，取1.5cm大小的菌块接种在上述茶叶中，在20℃～27℃条件下避光培养100天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时，即得发酵绿茶(如图2所示)。
49.经高效液相法检测咖啡碱含量，绿茶发酵后咖啡碱降解率为40％。(如图3所示)
50.实施例3咖啡碱降解菌降解红茶中咖啡碱
51.称取红茶放于组培瓶中，加入适量蒸馏水至茶叶含水量为60％，121℃条件下灭菌30min。选取长势良好的发光假蜜环菌平板，取1.5cm大小的菌块接种在上述茶叶中，在20℃～27℃条件下避光培养60天，待菌丝完全覆盖茶叶培养基，35℃下烘干12小时，即得发酵红茶(如图4所示)。
52.经高效液相法检测咖啡碱含量，红发酵后咖啡碱降解率为65％。(如图5所示)
53.参考实施例2至3进行其他发酵茶(黄茶、白茶、青茶、黑茶等)样品实验，咖啡碱降解率达40-60％。