一种抗菌肽GK18及其应用的制作方法

一种抗菌肽gk18及其应用
技术领域
1.本发明属于抗菌肽制备技术领域，具体涉及一种抗菌肽gk18及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽作为一种重要的小分子抗菌多肽，在动物，尤其是获得性免疫系统不健全的低等动物抵御外界微生物侵袭的过程中发挥了重要的作用。抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的内源性多肽，广泛分布于自然界各种生物体内。大多数抗菌肽都是组成型表达，也有一些是通过诱导产生，比如绝大多数昆虫抗菌肽都是经过诱导表达。作为先天免疫的重要效应分子，抗菌肽能够在获得性免疫被激活之前迅速对感染做出反应，是动物体抵御微生物感染的第一道防线。
3.随着抗生素被越来越多的使用，耐药菌株的数量也随之增加，临床治疗的药物选择面临困难，因此新型抗菌药物的开发迫在眉睫。利用抗菌肽在先天免疫中的作用治疗细菌感染等疾病是未来药物设计和疾病治疗药物研发的重要方向。抗菌肽具有杀菌速度快、热稳定性好、酸碱稳定性良好且不易产生耐药性的特点，在感染的药物开发方面有着广阔的应用前景。但是，现有抗菌肽虽然生物学活性较好，但是存在溶血、细胞毒性等副作用和体内稳定性差等缺陷，很难实现临床应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗菌肽gk18及其应用，所述抗菌肽在具备较高抗菌活性的基础上，同时具有溶血活性低、无细胞毒性和稳定性高的特性。
5.本发明提供了一种抗菌肽gk18，所述抗菌肽gk18的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.优选的，所述抗菌肽gk18的分子量为2312.67da，等电点为7.38。
7.本发明还提供了包括上述技术方案所述抗菌肽gk18的试剂在制备抑制微生物的产品中的应用。
8.优选的，所述微生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌中的一种或多种。
9.优选的，所述微生物包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中的一种或多种。
10.优选的，其特征在于，所述产品包括具有微生物消杀功能和/或抑制微生物繁殖的产品。
11.本发明还提供了一种抑菌产品，所述抑菌产品包括上述技术方案所述的抗菌肽gk18或包括所述抗菌肽gk18的试剂。
12.优选的，所述抑菌产品还包括辅料和/或其他有效成分。
13.优选的，所述辅料包括填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和表面活性剂中的一种或多种；
14.所述其他有效成分包括抗生素、蛋白、多肽、植物提取物和细胞因子中的一种或多
种。
15.优选的，其特征在于，所述抑菌产品包括药品和护肤品。
16.有益效果：
17.本发明提供了一种抗菌肽gk18，所述抗菌肽具备较高的抑菌活性，同时与现有抗菌肽相比，具有溶血活性低、无细胞毒性和稳定性高的特性，优势显著，应用前景广阔。
18.其次，本发明还提供了所述抗菌肽gk18在制备抑制微生物的产品中的应用，制备得到的产品可以抑制多种微生物，增加了抗菌肽gk18的用途。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
20.图1为实施例2中抗菌肽gk18对鲍曼不动杆菌的杀菌动力学结果；
21.图2为实施例3中抗菌肽gk18的溶血活性测定结果；
22.图3为实施例3中抗菌肽gk18的细胞毒性测定结果；
23.图4为实施例4中抗菌肽gk18的稳定性测定结果。
具体实施方式
24.本发明提供了一种抗菌肽gk18，所述抗菌肽gk18的氨基酸序列如seq id no.1所示。
25.本发明所述抗菌肽gk18优选为直链多肽，所述抗菌肽gk18的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：gkrgwkrfkgakwkrtwh。本发明所述抗菌肽gk18的c末端优选还带有酰胺化修饰，具体序列优选为：gkrgwkrfkgakwkrtwh-nh2。本发明所述抗菌肽gk18的分子量优选为2312.67da，等电点为7.38。
26.本发明对所述抗菌多肽gk18的制备方法并没有特殊限定，优选包括直接合成、原核表达和真核表达，更优选采用固相合成法制备所述抗菌肽gk18，本发明对所述固相合成法的具体步骤没有特殊限定，依据具体步骤得到所述抗菌肽gk18即可。本发明优选采用高效液相色谱纯化所述抗菌肽，本发明对所述高效液相色谱的纯化方法没有特殊限定，采用本领域常规步骤即可。在本发明的实施例中具体给出了制备抗菌肽gk18的一种固相合成和纯化步骤，但是不能仅仅将其认定为本发明的全部保护范围。
27.本发明还提供了包括上述技术方案所述抗菌肽gk18的试剂在制备抑制微生物的产品中的应用。本发明所述产品优选包括具有微生物消杀功能和/或抑制微生物繁殖的产品。本发明所述微生物优选包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌中的一种或多种，进一步优选包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。本发明所述抗菌肽gk18抑制staphylococcus aureusatcc2592(金黄色葡萄球菌)、escherichia coli atcc25922(大肠杆菌)和acinetobacter baumannii，atcc22933(鲍曼不动杆菌)的最小抑菌浓度分别优选为2.24μg/ml、4.48μg/ml和8.96μg/ml。本发明所述抗菌肽gk18具备较高的抑菌活性，同时与现有抗菌肽相比，具有溶血活性低、无细胞毒性和稳定性高的特性，可用于制备抑制微生物的产品。
28.本发明还提供了一种抑菌产品，包括上述技术方案所述的抗菌肽gk18或包括所述
抗菌肽gk18的试剂。本发明所述抑菌产品优选包括辅料和/或其他有效成分，即只要所述抑菌产品中包括所述抗菌肽gk18，以所述抗菌肽gk18为唯一有效成分或以所述抗菌肽gk18为有效成分之一的抑菌产品均属于本发明的保护范围。本发明所述辅料优选包括填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和表面活性剂中的一种或多种；所述填充剂优选包括淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇中的一种或多种；所述湿润剂和粘合剂优选包括蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)的水溶液或醇溶液；所述崩解剂优选包括干淀粉、甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠中的一种或多种；所述润滑剂优选包括硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类和月桂醇硫酸镁中的一种或多种；所述表面活性剂优选包括十二烷基硫酸钠。本发明所述其他有效成分优选包括抗生素、蛋白、多肽、植物提取物和细胞因子中的一种或多种。本发明所述抑菌产品优选包括药品和护肤品，所述护肤品优为医美产品和常规护肤品，更优选为医美产品。本发明对所述护肤品的类型没有特殊限定，本发明所述抗菌肽gk18可用于制备本领域任意类型的护肤品。
29.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.抗菌肽gk18的制备方法，由以下步骤组成：
32.1、根据设计的氨基酸序列：
33.gly-lys-arg-gly-trp-lys-arg-phe-lys-gly-ala-lys-trp-lys-arg-thr-trp-his-nh2用固相合成法合成得到粗多肽；
34.2、将粗多肽通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，具体方法为：
35.将0.1mg步骤1中制备得到的粗多肽溶于1ml含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相a为0.1％三氟醋酸-水，流动相b为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μl；色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱(4.6mm
×
300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100a)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长215nm，25℃下测定，直到多肽的纯度不低于95％，得到纯化的多肽，即抗菌肽gk18；
36.3、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof)测定步骤2中得到的抗菌肽gk18，具体方法为：
37.将步骤2中得到的抗菌肽gk18溶于去离子水中，配置成1μmol/ml的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定，得到抗菌肽gk18的分子量为2312.67da；
38.4、通过等电聚焦电泳测定抗菌肽gk18的等电点为7.38，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为gly-lys-arg-gly-trp-lys-arg-phe-lys-gly-ala-lys-trp-lys-arg-thr-trp-his。
39.实施例2
40.抗菌肽gk18的抗菌活性
41.最小抑菌浓度的定义：能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。
42.2.1本实施例采用二倍梯度稀释的方法进行定量抑菌分析，具体操作如下：
43.用灭菌超纯水配制2mg/ml gk18样品备用。分别准备好新鲜的金黄色葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液和鲍曼不动杆菌菌液，使用紫外分光光度计检测菌液的od600，按照1od600＝1
×
109cfu/ml，用新鲜lb液体培养基将上述菌液浓度分别稀释调整至2
×
105cfu/ml。
44.随后预先在无菌的96孔板中加入90μl生理盐水，在第一孔内加入配制好的gk18样品(以青霉素为阳性对照)，依次对待测样品进行二倍梯度稀释，再在每孔内加入100μl浓度为2
×
105cfu/ml的菌液(金黄色葡萄球菌菌液、大肠杆菌菌液和鲍曼不动杆菌菌液均采用此检测方法独立进行，不再赘述)，用移液枪将其吹打混匀，混匀后置于37℃恒温培养箱中过夜培养，最后用酶标仪检测菌液在600nm处的光吸收值，以检测不到细菌生长的孔和相邻孔的样品浓度的平均值作为最小抑菌浓度，即mic值，抗菌肽gk18的抑菌活性见表1。表1抗菌肽gk18对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度
[0045][0046]
由表1可以得出，抗菌肽gk18对金黄色葡萄球菌标准菌株(staphylococcus aureusatcc2592)、大肠杆菌标准菌株(escherichia coliatcc25922)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii，atcc22933)的最小抑菌浓度均为分别是2.24μg/ml、4.48μg/ml和8.96μg/ml。
[0047]
2.2准备好新鲜的鲍曼不动杆菌菌液并将浓度稀释调整至1
×
106cfu/ml。将实施例1中制备的抗菌肽gk18样品加入上述菌液，阳性对照为多粘菌素e，阴性对照为生理盐水，其中多粘菌素e(colistine)和gk18的终浓度分别在1
×
mic、5
×
mic和10
×
mic进行三组抑菌试验，多粘菌素e的mic值为1.17μg/ml，gk18的mic值为8.96μg/ml。将加入样品后的菌液迅速放入37℃恒温培养箱中，160rpm振荡培养，在0min、1min、10min、30min、1h和3h六个时间点，每个点取10μl菌液用无菌生理盐水稀释100倍，再取100μl菌液涂布于lb固体培养基，将涂布后的lb固体培养基放入37℃恒温培养箱中倒置培养16h，随后进行菌落计数。结果如图1所示：
[0048]
由图1可以看出：抗菌肽gk18杀菌迅速，在1
×
mic(8.96μg/ml)时，10min内就可表现出明显的杀菌作用，在5
×
mic和10
×
mic浓度时，gk18作用1min后鲍曼不动杆菌就几乎无生长，同时gk18对细菌的作用是致命的，在3h之内细菌的数量不会再持续的增多。相比而言，多粘菌素e在1
×
mic(1.17μg/ml)浓度时，在10min时仍有鲍曼不动杆菌生长，在5
×
mic浓度时，作用1min时仍有细菌生长。
[0049]
实施例3
[0050]
抗菌肽gk18的溶血活性和细胞毒性测定，具体步骤为：
[0051]
3.1用生理盐水把洗涤好的红细胞的稀释调整为10
7-108个/ml，同时将待测样品配制成1.76μg/ml、3.52μg/ml、7.03μg/ml、14.06μg/ml、28.13μg/ml、56.25μg/ml、112.5μg/ml
和225μg/ml八个不同的梯度浓度，将二者放置于37℃恒温中共孵育30min，随后1000rpm离心5min，用酶标仪检测上清液540nm的光吸收值。该实验中生理盐水作为阴性对照(nc)，相同体积的tritonx-100(10％)作为阳性对照，溶血活性则与540nm处的光吸收值成正比，溶血活性见图2；
[0052]
由图2可以看出：本发明抗菌肽gk18在八个不同浓度下的540nm处的光吸收值均显著低于阳性对照tritonx-100，而与阴性对照非常接近，由此可以得出，抗菌肽gk18在不同浓度下的溶血活性均较低。
[0053]
3.2使用人胚肾细胞株hek293t测定抗菌肽gk18的细胞毒性，待细胞生长状态良好且密度长至瓶底的80％时，弃去培养基，用无菌的pbs洗涤3次，随后用胰酶对贴壁细胞进行消化，终止后加入新鲜的含10％fbs的dmem培养基吹吸混匀，并将细胞悬液浓度调整至5
×
105个/ml，实验采用无菌96孔板，在各孔内加入上述细胞悬液200μl，放入细胞培养箱中过夜培养。次日，加入不同浓度的抗菌肽gk18样品，浓度梯度设置为7.03μg/ml、14.06μg/ml、28.12μg/ml、56.25μg/ml、112.5μg/ml、225μg/ml，每个浓度3个重复，对照组使用相同体积的无菌pbs(nc)，随后放入37℃、5％co2的恒温培养箱中继续培养24小时。在每个孔内加入5mg/ml的mtt溶液10μl，在避光条件下放入培养箱中继续培养4小时。最后，小心吸取并弃去孔中液体，加入dmso(dimethyl sulfoxide)100μl，将96孔板放在摇床上缓慢摇晃10分钟待结晶溶解，用酶标仪检测各孔在490nm处的光吸收值，结果如如图3所示。
[0054]
由图3可以看出，与对照组nc相比，不同浓度下的抗菌肽gk18均没有细胞毒性，本发明所述抗菌肽gk18的安全性较高。
[0055]
实施例4
[0056]
抗菌肽gk18的稳定性
[0057]
用无菌注射器获取10ml人体血液储存于抗凝管中，在4℃、3500rpm的条件下离心30min，小心吸取黄色上清，即为所需血浆。用无菌生理盐水将上述血浆稀释一倍，加入抗菌肽gk18，控制gk18的终浓度为10mg/ml。随后，把溶有抗菌肽gk18的血浆放入37℃的恒温培养箱中进行孵育，分别在0、1、2、4、6、8和10小时7个时间点各取10μl，用抑菌圈法检测抗菌肽gk18与血浆共孵育后对鲍曼不动杆菌的抗菌活性，每个时间点设置两个重复，结果如图4所示。
[0058]
由图4可以看出：在将抗菌肽gk18与血清孵育10小时，仍然可以检测到抗菌活性，由此可以证明所述抗菌肽gk18的稳定性较高。
[0059]
由以上实施例可以得出，本发明提供的抗菌肽gk18可直接杀灭病原菌，功能显著，作用快速，且gk18溶血活性低、无细胞毒性，稳定性较高，可以运用于抗细菌感染药物或者护肤品尤其是医美产品的制备。
[0060]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。