一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

1.本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。


背景技术：

2.5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-methylpyrazine-2-carboxylic acid,mpca)，分子式为c6h6n2o2，相对分子质量138.12，是一种重要的医药中间体，主要用于合成第二代口服降血糖药物格列吡嗪(glipizide)，新一代长效降血脂药阿西莫司(acipimox)和抗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(pae)。同时，5-甲基吡嗪-2-羧酸也可作为催化剂用于合成金属配合物。
3.目前，5-甲基吡嗪-2-羧酸的工业化制备主要采用化学合成法。以2,5-二甲基吡嗪为原料，经高锰酸钾氧化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。然而由于高锰酸钾的氧化性很强，很大一部分原料被高锰酸钾过度氧化生成副产物2,5-吡嗪二羧酸，导致主产物mpca收率较低。而且化学合成法还存在能耗高、反应进程难以控制、产物纯化困难和环境污染严重等缺点。
4.生物催化法合成mpca具有底物转化率高、合成工艺简单、副产物少和环境友好的优点，具有广泛的应用前景。研究表明恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)能选择性氧化2,5-二甲基吡嗪生成mpca。然而存在细胞内源性酶活性低、催化速率慢、产率低和纯化工艺复杂等不足。且由于恶臭假单胞菌中催化合成mpca的多酶体系为诱导表达，需要在培养液中加入甲苯和二甲苯作为诱导剂，因此存在严重的环境污染和人体毒性。另外，恶臭假单胞菌中还存在降解产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的酶系，导致催化产物被消耗。
5.通过基因工程技术将恶臭假单胞菌中催化合成mpca的基因簇在大肠杆菌中进行表达，然后通过重组大肠杆菌催化合成mpca是一条有效途径。专利cn201910833893.0和cn201711325652.2公开了在大肠杆菌中共表达来源于恶臭假单胞菌的二甲苯单加氧酶(xmo)、苯甲醇脱氢酶(badh)和苯甲醛脱氢酶(bzdh)，然后通过重组大肠杆菌游离细胞以2,5-二甲基吡嗪为底物催化合成mpca。但是构建的工程菌活性较低，导致催化反应底物转化率较低，反应时间较长(36-48h)。同时，由于游离细胞机械强度较低，在催化反应中容易破碎裂解，细胞无法重复利用，导致细胞催化剂成本较高，不利于工业化生产。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，给出了能高效可溶性表达二甲苯单加氧酶(xmo)、苯甲醇脱氢酶(badh)和苯甲醛脱氢酶(bzdh)的重组大肠杆菌构建方法以及大肠杆菌细胞固定化方法，该方法可以高效催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
7.本发明采用以下技术方案：一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法制备方法如下：
8.步骤一、利用大肠杆菌bl21(de3)分别发酵培养表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组大肠杆菌细胞，离心获得菌体；
9.步骤二、将所述菌体重悬后与聚乙烯亚胺和戊二醛混合搅拌混匀，制备固定化重组大肠杆菌细胞；
10.步骤三、以2,5-二甲基吡嗪为底物，以所述固定化重组大肠杆菌细胞为催化剂，催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
11.进一步地，该二甲苯单加氧酶以pacycduet-1为基因表达载体，所述苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶以petduet-1为基因表达载体。
12.进一步地，该的重组大肠杆菌细胞表达带有类泛素化修饰蛋白(sumo)标签的二甲苯单加氧酶融合蛋白。
13.进一步地，在二甲苯单加氧酶xyla亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(sumo)标签，或者在xyla和xylm两个亚基的氨基端均融合了sumo标签。
14.进一步地，该步骤二中，所述聚乙烯亚胺的质量浓度为1-5％，戊二醛质量浓度为0.5-3％，重组大肠杆菌菌体添加量为50-300g/l。
15.进一步地，该步骤三中的反应温度为25-40℃，固定化大肠杆菌细胞用量为50-200g/l，底物2,5-二甲基吡嗪质量浓度为5-20g/l，转化时间8-24h。
16.进一步地，该步骤二中，混合搅拌时间为30-120min。
17.本发明公开了一种固定化大肠杆菌细胞，采用上述的方法制备而成。
18.本发明的有益效果是：1.在重组大肠杆菌构建过程中，在二甲苯单加氧酶xyla亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(sumo)标签，或者在xyla和xylm两个亚基的氨基端均融合了sumo标签。获得了能高效可溶性表达重组二甲苯单加氧酶的工程菌，与未融合sumo标签的重组大肠杆菌相比，二甲苯单加氧酶活性提高了7倍。2.使用聚乙烯亚胺和戊二醛对大肠杆菌细胞进行交联制备固定化细胞；使用固定化细胞以2,5-二甲基吡嗪为原料催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。大肠杆菌细胞经固定化后结构非常稳定，催化反应八批次后依然能保持其初始酶活性的80％以上，通过固定化大肠杆菌细胞的方法，提高了细胞的在催化体系中的催化活性、耐受性和重复利用率。
附图说明
19.图1为苯甲醇脱氢酶(badh)重组表达及纯化电泳图；
20.图2为苯甲醛脱氢酶(bzdh)重组表达及纯化电泳图；
21.图3为二甲苯单加氧酶(xmo)重组表达电泳图；
22.图4为融合sumo标签的二甲苯单加氧酶重组表达电泳图；
23.图5为三种酶xmo(xyla和xylm两个亚基均融合sumo标签)、badh和bzdh共表达电泳图；
24.图6为重组xmo、badh和bzdh三种蛋白可溶性表达电泳图；
25.图7为固定化细胞和游离细胞的操作稳定性比较图；
26.图8为固定化细胞催化2,5-二甲基吡嗪(dmp)合成5-甲基吡嗪-2-羧酸(mpca)的色谱图。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
28.本发明中首先构建了能高效可溶性表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组大肠杆菌细胞；然后将重组大肠杆菌细胞重悬后与聚乙烯亚胺和戊二醛混合搅拌制备固定化细胞；最后使用固定化细胞以2,5-二甲基吡嗪为原料催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
29.二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因序列来源于ncbi公布的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)内源性tol质粒pwwo的xyl操纵子序列(genbank:d63341.1)，其中二甲苯单加氧酶编码基因为xylm和xyla，苯甲醇脱氢酶编码基因为xylb，苯甲醛脱氢酶编码基因为xylc。
30.以pacycduet-1为基因载体构建二甲苯单加氧酶基因xylm和xyla的共表达载体，以petduet-1为基因表达载体构建苯甲醇脱氢酶基因xylb和苯甲醛脱氢酶基因为xylc的共表达载体。其中，为了增加二甲苯单加氧酶的可溶性表达，在xyla亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(sumo)标签，或者在xyla和xylm两个亚基的氨基端均融合了sumo标签。
31.将上述构建的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)，获得能高效可溶性表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组菌。
32.公开了一种利用固定化大肠杆菌细胞制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法制备方法如下：
33.步骤一、利用大肠杆菌bl21(de3)分别发酵培养表达二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组大肠杆菌细胞，离心获得菌体；
34.步骤二、将所述菌体重悬后与聚乙烯亚胺和戊二醛混合搅拌混匀，制备固定化重组大肠杆菌细胞；
35.步骤三、以2,5-二甲基吡嗪为底物，以所述固定化重组大肠杆菌细胞为催化剂，催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
36.优选地，该二甲苯单加氧酶以pacycduet-1为基因表达载体，所述苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶以petduet-1为基因表达载体。
37.优选地，该的重组大肠杆菌细胞表达带有类泛素化修饰蛋白(sumo)标签的二甲苯单加氧酶融合蛋白。
38.优选地，在二甲苯单加氧酶xyla亚基的氨基端融合了类泛素化修饰蛋白(sumo)标签，或者在xyla和xylm两个亚基的氨基端均融合了sumo标签。
39.优选地，该步骤二中，所述聚乙烯亚胺的质量浓度为1-5％，戊二醛质量浓度为0.5-3％，重组大肠杆菌菌体添加量为50-300g/l。
40.优选地，该步骤三中的反应温度为25-40℃，固定化大肠杆菌细胞用量为50-200g/l，底物2,5-二甲基吡嗪质量浓度为5-20g/l，转化时间8-24h。
41.优选地，该步骤二中，混合搅拌时间为30-120min。
42.本发明公开了一种固定化大肠杆菌细胞，采用上述述的方法制备而成。
43.具体实施例如下：
44.实施例1
45.苯甲醇脱氢酶(badh)、苯甲醛脱氢酶(bzdh)和二甲苯单加氧酶(xmo)的重组表达
及性质鉴定：
46.根据ncbi公布的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)内源性tol质粒pwwo的xyl操纵子序列(genbank:d63341.1)，苯甲醇脱氢酶编码基因为xylb，苯甲醛脱氢酶编码基因为xylc，二甲苯单加氧酶码基因为xylm和xyla。根据ncbi公布的dna序列，分别人工合成xylb、xylc、xylm和xyla基因(南京擎科生物工程有限公司)。其中，通过bglii和kpni双酶切位点将xylb基因连接到载体petduet-1上构建重组质粒petduet-1-xylb；通过bamhi和noti双酶切位点将xylc基因连接到载体petduet-1上构建重组质粒petduet-1-xylc；通过酶切位点ndei，kpni以及bamhi，hindiii分别将二甲苯单加氧酶两个亚基基因xyla和xylm连接到表达载体pacycduet-1上，构建重组质粒pacycduet-xyla-xylm。本发明中大肠杆菌dh5α和bl21(de3)、大肠杆菌表达质粒petduet-1和pacycduet-1均为本实验室保存，也可以购买得到；亲和层析柱histrap fast flow预装柱和sephadex g-25凝胶填料购自ge公司；其余试剂均为分析纯。然后将每个表达载体分别转化至大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，构建分别单独表达苯甲醇脱氢酶(badh)、苯甲醛脱氢酶(bzdh)和二甲苯单加氧酶(xmo)的重组大肠杆菌。
47.将含有以上质粒的重组大肠杆菌划线于含有相应抗生素的固体lb平板上。在平板上挑取单克隆于lb培养基中37℃培养过夜。将培养的菌液按照1％接种量接种于液体lb培养基中，30℃培养至od600达到0.6-0.8，然后加入终浓度为0.1mm的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)在30℃继续培养12-16h，4℃离心收集菌体。
48.将离心收集的菌体加入破碎液(1g湿菌/10ml破碎液)震荡悬浮，在冰浴条件下进行超声破碎(功率400w，超声5s，间隙8s)30min，然后4℃15000rpm离心10min收集上清液。上清液经过0.45μm滤膜过滤后上histrap fast flow亲和层析柱，使用结合缓冲液(pbs，含30mm咪唑)洗脱杂蛋白，然后使用含300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。含有重组蛋白的洗脱液经装有sephadex g-25凝胶填料的脱盐柱脱盐后备用。
49.(1)苯甲醇脱氢酶(badh)的重组表达及性质鉴定：
50.重组大肠杆菌表达badh的表达量为6.9mg/l培养基，纯化后蛋白纯度达到95％。sds-page电泳结果如图1所示，m：蛋白marker；1：诱导前样品；2：诱导后样品；3：菌体破碎后沉淀；4：菌体破碎液上清；5：亲和层析穿透液；7：亲和层析洗脱液；8：脱盐后蛋白。得苯甲醇脱氢酶的分子量大小与理论值一致(41kda)。对纯化的苯甲醇脱氢酶进行活性测定：以苯甲醇为底物在反应过程中伴随着nadh的产生并在340nm处检测其吸光度，通过计算可得苯甲醇脱氢酶的比活性为216.9
±
11.47nmol
·
min-1
mg-1
。说明该酶具有一定的活性，活性较好。(重组苯甲醇脱氢酶的最适ph为8.5。在不同底物浓度下(0.01～5mm)测定酶活性，计算得到苯甲醇脱氢酶的km为0.52
±
0.04mm，表明该酶的对底物苯甲醇的亲和力较好。
51.(2)苯甲醛脱氢酶(bzdh)的重组表达及性质鉴定：
52.重组大肠杆菌表达bzdh的表达量为4.8mg/l培养基，纯化后蛋白纯度达到95％。sds-page电泳结果如图2所示，m：蛋白marker；1：诱导前样品；2：诱导后样品；3：菌体破碎后沉淀；4：菌体破碎液上清；5：亲和层析穿透液；7：亲和层析洗脱液；8：脱盐后蛋白。苯甲醛脱氢酶的分子量大小与理论值一致(54kda)。对纯化的苯甲醛脱氢酶进行活性测定：以苯甲醛为底物在反应过程中伴随着nadh的产生并在340nm处检测其吸光度，通过计算可得苯甲醛脱氢酶的比活性为283.8
±
11.21nmol
·
min-1
mg-1
，说明该酶具有一定的活性，活性较好。重
组苯甲醛脱氢酶的最适ph为9.5。在不同底物浓度下(0.01～5mm)测定酶活性，计算得到苯甲醛脱氢酶的km为0.33
±
0.07mm，表明该酶的对底物苯甲醛的亲和力较好。
53.(3)二甲苯单加氧酶(xmo)的重组表达及性质鉴定：
54.xmo作为5-甲基吡嗪-2-羧酸生物催化途径中的关键限速酶，直接影响底物的转化效率，为了研究xmo对生物催化过程的影响，在重组大肠杆菌中对xmo进行诱导表达，蛋白表达结果如图3所示，m：蛋白marker；1：诱导前样品(30℃)；2：诱导后样品(30℃)；3：破碎后沉淀(30℃)；4：破碎液上清(30℃)；5：诱导前样品(25℃)；6：诱导后样品(25℃)；7：破碎后沉淀(25℃)；8：破碎液上清(25℃)。二甲苯单加氧酶xyla亚基和xylm亚基的理论分子量分别为39kda、41kda。但是由电泳图可知重组表达的xmo几乎全部以包涵体形式存在，亲和层析无法纯化得到重组蛋白。xmo可以将nadh的h传递给细胞色素c形成还原型细胞色素c，还原型细胞色素c在550nm具有特征吸收，以每分钟催化生成1nmol细胞色素c的酶量为一个酶活单位，因此，可以通过酶标仪检测还原型细胞色素c的生成量来计算二甲苯单加氧酶的活性。利用重组大肠杆菌破碎后上清液测定酶活为13.1
±
0.32nmol
·
min-1
mg-1
，表明该酶具有一定的生物活性，可以用于后续实验。
55.实施例2
56.融合类泛素化修饰蛋白(sumo)标签提高二甲苯单加氧酶(xmo)可溶性表达。
57.二甲苯单加氧酶(xmo)包含xyla和xylm两个亚基，为了提高xmo在大肠杆菌中的可溶性表达，我们在xmo的xyla亚基的氨基酸融合了sumo标签。根据商业化载体pet-28a-sumo中sumo的基因序列，使用引物
[0058]5′‑
cgcatatgatgtcggactcagaagtc-3
′
和
[0059]5′‑
ctttttgaagaactcgtttccaccaatctgttctct-3
′
以pet-28a-sumo质粒为模板进行pcr扩增获得sumo序列；以pacycduet-xyla-xylm质粒为模板使用引物5
′‑
agagaacagattggtggaaacgagttcttcaaaaag-3
′
和5
′‑
ccgtcgagttaacacggtgggcggtt-3
′
进行pcr扩增获得xyla亚基序列。然后再通过搭桥pcr扩增获得融合有sumo标签的xyla基因sumo-xyla。通过ndei和kpni双酶切将pacycduet-xyla-xylm质粒中xyla基因删除，并将融合有sumo标签的sumo-xyla插入质粒，构建了重组质粒pacycduet-sumo-xyla-xylm。另外，利用相同的思路也在xmo的xylm亚基氨基端融合了sumo标签氨基端融合了sumo标签，构建了重组质粒pacycduet-sumo-xyla-sumo-xylm，将上述质粒转化至bl21(de3)获得重组大肠杆菌，然后对重组蛋白进行表达纯化。
[0060]
将含有以上质粒的重组大肠杆菌划线于含有50μg/ml氯霉素的固体lb平板上。在平板上挑取单克隆于lb培养基中37℃培养过夜。按照1％接种量接种于液体lb培养基中，30℃培养至生物量od
600
达到0.6-0.8，然后加入终浓度为0.1mm的iptg在30℃下继续培养12-16h，4℃离心收集菌体。将离心收集的菌体加入破碎液震荡悬浮，在冰浴条件下超声破碎30min，然后4℃15000rpm离心10min收集上清液。sds-page电泳结果如图4所示m：蛋白marker；1：未融合sumo标签菌体破碎后上清液；2：未融合sumo标签菌体破碎后沉淀；3：在xyla亚基上融合sumo标签菌体破碎后上清液；4：在xyla亚基上融合sumo标签菌体破碎后沉淀；5：在xyla和xylm两个亚基均融合sumo标签菌体破碎后上清液；6：在xyla和xylm两个亚基均融合sumo标签菌体破碎后沉淀。(写一下图中的数据)。图4所示，泳道1方框中条带灰度值较小，泳道5方框中条带灰度值较大，说明xmo融合蛋白的可溶性表达明显增高，二甲苯单
加氧酶未加sumo标签优化前粗酶比活为13.1
±
0.32nmol
·
min-1mg-1，优化后的粗酶比活为92.8
±
6.84nmol
·
min-1mg-1，比优化前的酶活增加了约7倍。
[0061]
实施例3
[0062]
重组二甲苯单加氧酶(xmo)、苯甲醇脱氢酶(badh)和苯甲醛脱氢酶(bzdh)的共表达：
[0063]
分别将质粒pacycduet-sumo-xyla-sumo-xylm和petduet-xylb-xylc在大肠杆菌中共表达，同时将质粒pacycduet-xyla-xylm和petduet-xylb-xylc在大肠杆菌中共表达作为对照。
[0064]
重组菌在30℃培养至生物量od
600
达到0.6-0.8，然后加入终浓度为0.1mm的iptg在30℃下继续培养12-16h，4℃离心收集菌体。重组蛋白表达的sds-page电泳如图5所示。二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶均能有效表达；第4泳道表示融合sumo标签的二甲苯单加氧酶的大小为46kda，与苯甲醛脱氢酶的条带重合，与第2泳道未融合sumo标签的二甲苯单加氧酶表达水平相比，第4泳道中未融合sumo标签的重组xmo(约40kda)表达量减少，表明xmo表达主要以融合sumo标签的形式存在。然后分析了重组蛋白可溶性表达水平。重组表达xmo、badh和bzdh的大肠杆菌细胞破碎后上清液电泳结果如图6所示。结果表明三种重组酶的可溶性表达水平均大幅度提高，为全细胞催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸提供了优良的细胞催化剂。
[0065]
实施例4
[0066]
固定化大肠杆菌细胞的制备：
[0067]
将上述包含pacycduet-sumo-xyla-sumo-xylm和petduet-xylb-xylc质粒的重组菌在30℃培养至生物量od600达到0.6-0.8，然后加入终浓度为0.1mm的iptg在30℃下继续培养12-16h，4℃离心收集菌体。将10g湿菌体加到100ml磷酸盐缓冲液中(pbs)中(0.2mol/l,ph7.4)制备得到菌悬液，并置于搅拌器上混匀。然后将50％的聚乙烯亚胺(pei)稀释10倍后加入菌悬液中交联30-120min，然后再加入不同浓度的戊二醛(0.5％-3％)交联60min。溶液抽滤后得到固定化细胞，再用pbs缓冲液洗涤三次备用。
[0068]
固定化细胞活力测定采用高效液相色谱(hplc)法，测定固定化细胞催化2,5-二甲基吡嗪(dmp)转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸(mpca)的活力，以反应产物mpca的量表征细胞的催化活力。反应液组成如下：在50ml锥形瓶中加入10ml磷酸盐(pbs)缓冲液(0.2mol/l,ph7.4)，10g/l的底物2,5-二甲基吡嗪(dmp)，在30℃震荡反应30min，取反应液稀释后进行液相色谱分析。液相色谱分析条件：kromasil c18色谱柱(5μm，4.63250mm)；流动相为甲醇(色谱级)和纯水，比例为8:2；流速0.7ml/min；紫外检测器(274nm)；柱温35℃；进样量10μl。使用dmp和mpca标准品制作不同浓度dmp和mpca与色谱峰面积的标准曲线，计算反应液中底物和产物的量。
[0069]
分别研究聚乙烯亚胺(pei)浓度(1-5％)及交联时间(30-120min)对固定化细胞活力的影响，固定反应体系中戊二醛浓度(1％)和细胞包埋量(100g/l)等实验因素，发现固定化细胞活力随着pei浓度的升高而增加，当pei浓度达到2.5％时，固定化细胞酶活力达到最高。考察不同交联时间对细胞活力的影响，结果表明当pei交联反应时间为60min时，细胞酶活力达到最高。接下来考察了戊二醛浓度对固定化细胞酶活力的影响，结果表明戊二醛交联时间固定为60min，戊二醛浓度为1％时固定化细胞活力最高。接下来，考察了细胞添加量
(50-300g/l)对固定化细胞活力的影响，结果表明固定化细胞活力随着细胞添加量的增加而增加，当细胞添加量为200g/l时固定化细胞酶活力达到最高，继续增加细胞添加量固定化细胞活力增加不明显，并且固定化细胞强度有所降低，综合考虑确定细胞添加量为200g/l。通过以上研究确定重组大肠杆菌细胞固定化条件：大肠杆菌细胞包埋量200g/l、聚乙烯亚胺含量2.5％(交联时间60min)、戊二醛浓度为1％(交联时间为60min)，固定化细胞酶活力最高。
[0070]
研究了不同温度和ph对固定化细胞酶活力的影响，进行如下检验：(1)不同温度对固定化细胞酶活力的影响：选取反应温度为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，反应体系为：1g/l的2,5-二甲基吡嗪，0.2m的磷酸盐缓冲液(ph8.5)，在摇床(25℃、200r/min)中转化24h；离心(6000rpm、10min、4℃)后收集上清留存样品进行高效液相检测，如实施例4所述条件。(2)不同ph对固定化细胞酶活力的影响：选取ph 5、ph 6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，ph 6、ph 7、ph 8的磷酸盐缓冲液，ph 8、ph 8.5、ph 9的tris-hcl缓冲液，其他条件一致。反应体系为：1g/l的2,5-二甲基吡嗪，0.2m的磷酸盐缓冲液(ph8.5)，在摇床(25℃、200r/min)中转化24h；离心(6000rpm、10min、4℃)后收集上清留存样品进行高效液相检测，如实施例4所述条件。，结果表明固定化细胞最适反应温度为40℃，最适反应ph为8.5，与游离细胞一致。且固定化细胞的温度稳定性优于游离细胞，固定化细胞在45℃保温2h酶活性还保留86％，而游离细胞酶活性仅残余45％；固定化细胞在50℃保温2h酶活性还保留63％，而游离细胞酶活性仅残余15％。
[0071]
固定化细胞的操作稳定性和重复使用次数对商业化应用的生物催化剂至关重要。本发明考察了固定化细胞和游离细胞的操作稳定性，结果如图7所示。固定化细胞重复使用5批次后酶活力还保持在90％以上，重复使用8批次后，酶活力仍然保持在83％。而游离细胞重复使用3批次后酶活力仅残留40％。以上结果表明聚乙烯亚胺和戊二醛联合固定化的大肠杆菌细胞具有优良的操作稳定性和重复使用能力。
[0072]
实施例5
[0073]
固定化细胞催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸：
[0074]
在100ml磷酸盐(pbs)缓冲液(0.2mol/l,ph7.4)中加入1g底物2,5-二甲基吡嗪，固定化细胞10g，在30℃下震荡反应12h。hplc检测反应液中产物含量。反应液的hplc色谱图如图8所示。结果表明当底物2,5-二甲基吡嗪浓度为10g/l时，反应产物5-甲基吡嗪-2-羧酸生成量为10.6g/l，摩尔转化率为83％。将反应时间从12h增加至18h，反应产物没有明显增加。接下来考察了15g/l的底物在上述催化反应体系下催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的量，结果表明反应12h后mpca产量达到了13.6g/l，底物摩尔转化率为71％。以上结果表明固定化重组大肠杆菌细胞具有优良的操作稳定性和催化性能，能用于5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物合成中。