用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备

1.发明领域本发明涉及微流控装置。具体地，本发明涉及微流控装置及其用途,以及用于分析细胞的方法。2.相关技术描述单细胞代表基本生物单位。然而，大多数生物知识呈现为研究细胞群而非单细胞的结果。难免存在基础和应用问题，如涉及干细胞分化的转录控制、基因表达中的固有噪声和疾病起源的问题，这只能从单细胞水平上来解决。例如，单细胞分析允许直接测量基因表达动力学或清楚地鉴别共调控的基因，甚至存在会使普通群体测量不清楚的非同步性和异质性时也是如此。类似地，单细胞方法在干细胞研究和癌症生物学中至关重要，其中由于受纯化方案限制而分离的原代细胞群为异质的，并且通常只有少数细胞群是最相关的。因此，高通量单细胞测量技术受关注并在临床和研究环境中具有广泛的应用。测量单细胞中转录水平的现有方法包括rt-qpcr(1)、使用数字pcr(2)的单分子计数，或杂交探针(3,4)以及新一代测序(5)。在这些方法中，单细胞rt-qpcr提供了灵敏、特异和动态范围的综合优点，但其受低通量、试剂费用高和难以准确测量低丰度转录本的限制(6)。微流控装置使用活动阀门来定位和分离细胞，允许对单个微生物细胞进行分离和基因组扩增(32)。遗憾的是，由于涉及操作阀门机构的手动操作，该装置不能进行高通量分析。此外，所述装置不能使分离的细胞在处理和分析之前从上清液中洗涤出来。反过来这会产生污染事件，并进一步限制该装置的下游应用。因此，微流体研究的目标是开发出可对单细胞中的转录进行可扩展分析的综合技术。微流控系统提供了用于单细胞分析的众多优点：测量的经济性、平行化和自动化，以及提高来自小量反应的灵敏度和精确度。过去十年中，人们投入了大量精力用于研发在芯片上集成和可扩展的单细胞遗传分析(7,8)。因此，微流控单细胞基因表达分析的许多基本功能已经在分离包括细胞操作和捕获(9,10)、rna纯化和cdna合成(11-13)，以及芯片外细胞分离cdna合成和预扩增后的微流控qpcr(14)中得到展示。具体地，最近已将微流控qpcr装置(biomark动态阵列，fluidigm公司)应用到单细胞研究中(15,16)。尽管这些系统提供了高通量qpcr数据读出，但是它们没有进行前段样品制备，且需要通过facs或微量移液管进行单细胞分离，然后在分析前进行芯片外处理和起始模板的预扩增。将单细胞分析的所有步骤集成于一个能测量大量细胞的强大系统的关键步骤还有待报道。toriello等人描述了直接测量单细胞基因表达的集成装置的单独示范，组合了rna捕获、pcr扩增和使用集成毛细管电泳的扩增子末端检测的所有步骤(17)。尽管该系统的工程复杂，通量被限制于每轮4个细胞，细胞捕获需要细胞代谢标记，且所述分析不是定量的。在许多类型的分析之前，需要分离单细胞或有限数目的细胞，这通常需要使用细胞捕获机构。对于单细胞或少量细胞进行可靠和可扩展分析的目标而言，低捕获通量和低捕获效率成为巨大的挑战。低捕获效率需要成千上万个细胞以使在使用细胞系时少量单细胞测量不成问题，然而，在使用稀少细胞类型如干细胞的原代样品时，这就成为一个大问题。同样，对所捕获细胞和通过所述捕获器的细胞的观察表明，细胞捕获效率取决于细胞大小，其可能潜在地将偏差引入到单细胞测量中。

背景技术：

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明部分基于这样的发现，即相比μl体积的分析，集成微流控装置可用于对每个实验中pl至nl体积(50pl-100nl)的上百(上千)单细胞进行可扩展、高性能、低成本和敏感性分析的高通量分析。所述描述和实例提供了首次实施强大和高通量的单细胞处理和芯片上的核酸扩增，由此取得了微流控生物学分析的主要里程碑。

2、本文提供了能够进行可扩展的定量单细胞遗传分析的微流控技术。具体地，本文的示例为集成微流控装置，其用于对每个实验中上百至上千通量的单细胞mrna和mirna表达进行高通量rt-qpcr分析。本描述显示，相比μl体积的分析，该技术提供了具有改善性能、降低成本和更高灵敏度的可扩展的单细胞基因表达测量的有力工具。

3、本文提供的实施例公开了完全集成的微流控装置，其能够进行每轮上百单细胞的基因表达的高精度rt-qpcr测量。而且，所述装置的实施方案能够执行所有的单细胞处理步骤，包括细胞捕获、细胞裂解、逆转录和定量pcr。除了更高的通量和降低成本，本文显示纳升(nanoliter)体积处理减少了测量噪声、增加了灵敏度，并提供了单核苷酸特异性。本描述显示将该技术应用于对3300个单细胞进行下述测量：i)k562细胞中mirna表达,ii)胚胎干细胞中分化期间mirna和其靶转录本之一的共调控，和iii)原代小叶乳腺癌细胞中单核苷酸变体检测。本文中建立的核心功能提供了这样的基础，各种芯片上的单细胞转录分析将以此为基础发展。在阅读了下述本发明的具体实施方案描述及其附图后，对本领域技术人员来说，本发明的其他方面和特征将变得很明显。

4、可选择地，处理和分析的细胞类型可选自以下一种或多种：滚环扩增、多重置换扩增、同温dna和rna扩增、cdna末端快速扩增(race)、简并性寡聚引物pcr、线粒体dna pcr、基因组pcr、数字pcr、rt-pcr、测序、免疫化学、邻位连接pcr、免疫pcr、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析、杂交研究。

5、根据第一实施方案，提供的微流控装置包括：(a)细胞捕获室，其具有至少一个入口和至少一个出口，其中每个入口和出口具有开启和关闭位置，以此当所述入口处于开启位置时流体能够流入细胞捕获室，而当所述出口处于开启位置时流体能够流出细胞捕获室，并且以此当所述入口处于关闭位置时将阻止流体流入所述细胞捕获室，而当所述出口处于关闭位置时将阻止流体流出所述细胞捕获室，其中流经所述细胞捕获室的方向指示了所述细胞捕获室的上游和下游方向；(b)细胞漏斗，其位于细胞捕获室中且可操作地引导细胞通过所述细胞捕获室流向细胞捕获室中的一个或多个期望的位置；和(c)细胞捕获器，其通常位于所述细胞漏斗的下游，以此将所述细胞捕获器定位以接收从所述细胞漏斗向下游流动的细胞。

6、所述微流控装置可进一步包括：(a)与流体注入通道流体连通的第二入口，所述上游入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室；和(b)与一个或多个辅助室流体连通的第二出口，所述下游出口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体流出所述细胞捕获室并进入一个或多个辅助室，而在所述关闭位置阻止流体从所述细胞捕获室进入一个或多个辅助室。

7、所述微流控装置可进一步包括与流体注入通道流体连通的第二入口，所述第二入口具有开启和关闭位置，其中所述开启位置允许流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，而在所述关闭位置阻止流体从所述流体注入通道进入所述细胞捕获室，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。

8、所述细胞捕获室可具有一个入口和一个出口，其中所述入口与流体注入通道流体连通，并且其中所述细胞捕获室的体积是可膨胀的。

9、所述细胞漏斗可施加力以引导细胞流向所述细胞捕获室中一个或多个期望的位置。通过所述细胞漏斗施加于细胞的力可选自以下一种或多种：机械力、重力、电磁力、静电力、磁力、声学力、水力和光学力。而且，一种或多种上述的力可有助于将细胞引导至期望的位置。例如，物理结构可对流体施加机械力，反过来流体产生水力。通过所述细胞漏斗施加于细胞的力可为水力。

10、所述细胞捕获器可选自以下一种或多种：机械力捕获器、水力捕获器、介电泳力捕获器、磁力捕获器、声学力捕获器、亲和力捕获器、光学力捕获器和膜片钳捕获器。所述细胞捕获器可为水力捕获器。

11、所述第二出口可与第一辅助室流体连通。所述第一辅助室可与第二辅助室流体连通，其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第一辅助室流向第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第一辅助室流向第二辅助室。所述第一辅助室可与第二辅助室流体连通，且所述第二辅助室与第三辅助室流体连通；其中在所述第一和第二辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第一辅助室流向第二辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第一辅助室流向第二辅助室；其中在所述第二和第三辅助室之间有阀门，其中所述阀门具有开启位置以允许流体从第二辅助室流向第三辅助室，且具有关闭位置以阻止流体从第二辅助室流向第三辅助室。

12、所述辅助室的体积可为可膨胀的。所述细胞捕获室的体积可为0.1nl-100.0nl。所述可膨胀的细胞捕获室的未膨胀体积可为0.1nl-100.0nl。所述细胞捕获室的体积可为0.6nl。所述未膨胀的细胞捕获室可为0.6nl。通过初始室的膨胀或通过打开阀门以提供流体流入一个或多个辅助室可增加给定室的有效体积。所述第二辅助室和第一辅助室之间的比率可为5:1。所述第二辅助室和第一辅助室之间的比率可为至少5:1。所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间的比率可为5:1，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可为5:1。所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间的比率为至少5:1，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可为至少5:1。所述第二辅助室和第一辅助室之间，或所述膨胀的细胞捕获室和未膨胀的细胞捕获室之间，或所述膨胀的第一辅助室和未膨胀的第一辅助室之间的比率可根据所选的反应混合物、该混合物组分的浓度和待分析物质的浓度而变化。可选择地，所述细胞捕获室可为0.05nl-100.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.05nl-90.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-95.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-90.0nl.可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-85.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-80.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-75.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-70.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-65.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-60.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-55.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-50.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-45.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-40.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-35.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-30.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-25.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-20.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-15.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-10.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-9.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-8.0nl.可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-7.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-6.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-5.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-4.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-3.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-2.0nl。可选择地，所述细胞捕获室可为0.1nl-1.0nl.

13、所述装置可包括1-10个细胞捕获器和对应的细胞漏斗。可选择地，漏斗可与多于一个的专用捕获器结合使用。所述细胞捕获器也可设计为每一个容纳多于一个细胞，且每一个可由一个或多个细胞漏斗来提供细胞。此外，如果待检测的是混合细胞群，细胞捕获器的大小可使其选择特定的细胞类型。而且，所述细胞捕获器和漏斗可设计为排除某些细胞类型或选择某些细胞类型。

14、所述细胞漏斗可包括各自具有近端和远端的一对细胞导流板，其中所述近端位于所述捕获室的对侧，且其中所述细胞导流板的每个远端相对于近端在下游方向对角线上成角度，以此所述细胞导流板的远端提供开口，其大小允许在所述细胞导流板的远端之间通过细胞。所述细胞捕获器可大体为杯形或“u”形，或者具有大体为杯形或“u”形的区域，从而细胞可从一侧进入所述“u”形内部而不能通过。所述细胞捕获器可提供流经所述细胞捕获器的流体。可在细胞被捕获于所述捕获器之前、期间和之后流经所述捕获器。该流经可辅助捕获细胞和辅助洗涤所捕获的细胞。而且，所述细胞漏斗或细胞捕获器可具有如任一图1a-x、2a-e、12b-i和24所示的结构。

15、根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括：(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；(e)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(f)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。

16、根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括：(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；(e)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所述捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(f)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。

17、所述方法还可包括处理和分析洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种：滚环扩增、多重置换扩增、同温dna和rna扩增、cdna末端快速扩增(race)、简并性寡聚引物pcr、线粒体dna pcr、基因组pcr、数字pcr、rt-pcr、测序、免疫化学、邻位连接pcr、免疫pcr、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析和杂交研究等。

18、所述方法还可包括：(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(c)扩增。

19、所述方法还可包括：(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(c)定量扩增。

20、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；和(d)分离所述室中预定数目的细胞。

21、所述方法还可包括分析所述洗涤后的捕获细胞，其中分析选自以下一种或多种：滚环扩增、多重置换扩增、同温dna和rna扩增、cdna末端快速扩增(race)、简并性寡聚引物pcr、线粒体dna pcr、基因组pcr、数字pcr、rt-pcr、测序、免疫化学、邻位连接pcr、免疫pcr、代谢物分析、酶法分析、报告基因表达分析和杂交研究等。

22、所述方法还可包括：(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(c)扩增。

23、所述方法还可包括：(a)细胞裂解；(b)逆转录；和(c)定量扩增。

24、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；(d)分离所述室中预定数目的细胞；(e)裂解所述室中的细胞；(f)逆转录通过所述细胞裂解释放的rna；和(g)通过聚合酶链式反应(pcr)扩增步骤(f)中所转录的cdna。

25、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)通过使洗涤液流经所述室来洗涤所捕获的细胞，其中所述洗涤液流将污染物从所述室中去除；(d)分离所述室中预定数目的细胞；(e)裂解所述室中的细胞；(f)逆转录通过所述细胞裂解释放的rna；和(g)通过定量聚合酶链式反应(pcr)扩增步骤(f)中所转录的cdna。

26、根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括：(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；和(e)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。

27、根据又一个实施方案，提供了细胞捕获和制备方法，所述方法包括：(a)使细胞在流体中流经室；(b)使细胞在流体中通过漏斗流向细胞捕获器；(c)在所述室中捕获预定数目的细胞；(d)中断流体中的细胞流；和(e)将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。

28、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；和(c)分离所述室中预定数目的细胞。

29、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)分离所述室中预定数目的细胞；(d)裂解所述室中的细胞；(e)逆转录通过所述细胞裂解释放的rna；和(f)通过聚合酶链式反应(pcr)扩增步骤(f)中所转录的cdna。

30、根据又一个实施方案，提供了细胞分析方法，所述方法包括：(a)将细胞引导至细胞捕获室，其中所述室的体积为0.1nl-100nl；(b)在所述室中捕获预定数目的细胞；(c)分离所述室中预定数目的细胞；(d)裂解所述室中的细胞；(e)逆转录通过所述细胞裂解释放的rna；和(f)通过定量聚合酶链式反应(pcr)扩增步骤(f)中所转录的cdna。

31、所述方法还可包括将所述细胞引导至细胞捕获室之前的细胞分选步骤。所述方法还可包括在洗涤之前固定所捕获的细胞。固定还可促进对捕获室中细胞的洗涤。