一种高稳定性磷酸甘油氧化酶的制备方法

1.本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种高稳定性磷酸甘油氧化酶的制备方法。


背景技术：

2.人体血清中甘油三酯的含量是高血脂诊断中的一个重要指标，正常参考值为0.45～1.69mmol/l，甘油三酯含量升高为心血管疾病的危险因素。磷酸甘油氧化酶法测定血清中甘油三酯含量具有快速准确，操作简单，特异性高的优点，并能在自动生化分析仪上进行大批量标本检测，已普遍应用于血清中甘油三酯的体外检测。磷酸甘油氧化酶(l-α-glycerophosphate oxidase，gpo)是制备甘油三酯测定试剂盒的核心原料之一，目前用于体外诊断试剂的磷酸甘油氧化酶主要来源于链球菌(streptococcus sp.)、肠球菌(enterococcus sp.)、片球菌(pediococcus sp.)、酵母菌(saccharomyces sp.)和大肠杆菌(escherichia coli)等。制备方法主要是通过链球菌、肠球菌和片球菌等野生菌的发酵，另外将不同物种来源的磷酸甘油氧化酶基因在大肠杆菌中进行表达也是获取重组酶的途径之一。
3.目前，我国临床诊断中的磷酸甘油氧化酶基本依赖进口，主要生产企业为日本东洋纺、日本旭化成和罗氏公司。然而，这些公司生产的磷酸甘油氧化酶热稳定性较低，导致甘油三酯检测试剂的长期保存稳定性较差。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种高稳定性磷酸甘油氧化酶的制备方法，制得了聚乙二醇化修饰磷酸甘油氧化酶，其热稳定性和ph稳定性与磷酸甘油氧化酶本体相比明显增强。
5.本发明采用以下技术方案：一种高稳定性磷酸甘油氧化酶，其结构式如下所示：
[0006][0007]
其中：mpeg表示直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯中的单甲氧基聚乙二醇部分，gpo表示重组磷酸甘油氧化酶。
[0008]
如上述的一种高稳定性磷酸甘油氧化酶的制备方法，该制备方法如下：
[0009]
将活化的mpeg-nhs与gpo混匀，在4～37℃、ph6～9条件下进行0.5～12h的共价偶联反应，得到含有mpeg-gpo、gpo、mpeg-nhs水解产物的反应混合液；将反应混合液用凝胶过滤色谱进行脱盐，脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥后得到mpeg-gpo。
[0010]
其中，mpeg-gpo表示聚乙二醇化修饰的重组磷酸甘油氧化酶；gpo表示重组磷酸甘油氧化酶；mpeg-nhs表示直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯；活化的mpeg-nhs的摩尔量为gpo的1～100倍。
[0011]
进一步地，该活化的mpeg-nhs的平均分子量为2～40kda。
[0012]
进一步地，该活化的mpeg-nhs的平均分子量为5～20kda。
[0013]
进一步地，该活化的直链mpeg-nhs的摩尔量是gpo的2～50倍。
[0014]
进一步地，该活化的直链mpeg-nhs的摩尔量是gpo的5～30倍。
[0015]
进一步地，该共价偶联反应是在4～25℃，ph7.0～8.5条件下进行；共价偶联反应的时间为1～4h。
[0016]
本发明的有益效果是：1.通过聚乙二醇修饰的方式对磷酸甘油氧化酶gpo进行化学修饰，获得了热稳定显著增强的聚乙二醇化修饰磷酸甘油氧化酶。2.使用活化的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶gpo进行共价偶联，因反应交联后聚乙二醇覆盖在蛋白质的表面以及空间位阻的影响，使得修饰产物聚乙二醇化修饰磷酸甘油氧化酶的热稳定性和ph稳定性与磷酸甘油氧化酶本体相比明显增强。3.制备方法简单、反应条件温和、产物分离纯化容易，产物纯度高，获得的聚乙二醇化修饰磷酸甘油氧化酶比活性没有明显降低，适合用于制备甘油三酯测定试剂盒的原料。
附图说明
[0017]
图1为磷酸甘油氧化酶gpo纯化结果的sds-page电泳图。
[0018]
图2为修饰试剂mpeg-nhs与gpo蛋白的摩尔比，反应时间影响mpeg-gpo制备结果的sds-page电泳图。
[0019]
图3为mpeg-gpo纯化结果的sds-page电泳图。
[0020]
图4为mpeg-gpo与gpo的热稳定性比较图。
[0021]
图5为mpeg-gpo与gpo的ph耐受性比较图。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0023]
本发明公开了一种高稳定性磷酸甘油氧化酶，其结构式如下所示：
[0024][0025]
其中：mpeg表示直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯中的单甲氧基聚乙二醇部分，gpo表示重组磷酸甘油氧化酶。
[0026]
如上述的一种高稳定性磷酸甘油氧化酶的制备方法，该制备方法如下：
[0027]
将活化的mpeg-nhs与gpo混匀，在4～37℃、ph6～9条件下进行0.5～12h的共价偶联反应，得到含有mpeg-gpo、gpo、mpeg-nhs水解产物的反应混合液；将反应混合液用凝胶过滤色谱进行脱盐，脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥后得到mpeg-gpo。
[0028]
其中，mpeg-gpo表示聚乙二醇化修饰的重组磷酸甘油氧化酶；gpo表示重组磷酸甘油氧化酶；mpeg-nhs表示直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯；活化的mpeg-nhs的摩尔量为gpo的1～100倍。
[0029]
优选地，该活化的mpeg-nhs的平均分子量为2～40kda。
[0030]
优选地，该活化的mpeg-nhs的平均分子量为5～20kda。
[0031]
优选地，该活化的直链mpeg-nhs的摩尔量是gpo的2～50倍。
[0032]
优选地，该活化的直链mpeg-nhs的摩尔量是gpo的5～30倍。
[0033]
优选地，该共价偶联反应是在4～25℃，ph7.0～8.5条件下进行；共价偶联反应的时间为1～4h。
[0034]
具体实施例如下：
[0035]
实施例1
[0036]
磷酸甘油氧化酶gpo的表达纯化：
[0037]
所需细胞和试剂如下：大肠杆菌dh5α和bl21(de3)、大肠杆菌表达质粒pet-28a均为本实验室保存，也可以购买得到；亲和层析柱histrap fast flow预装柱和sephadex g-25凝胶填料购自ge公司；单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mpeg-nhs)购自上海芃硕生物科技有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。
[0038]
首先，以来源于粪肠球菌(enterococcus faecalis)的磷酸甘油氧化酶本体gpo的基因序列(genbank:e38301.1)为模板合成gpo基因，并根据大肠杆菌密码子偏爱性对gpo基因序列进行优化。然后，将合成的gpo基因连接到大肠杆菌表达载体pet-28a的ndeⅰ和notⅰ多克隆位点，构建重组质粒pet-28a-gpo，使表达的重组gpo的氨基端融合有his标签。最后，将测序正确的重组质粒pet-28a-gpo转化大肠杆菌bl21(de3)，得到表达磷酸甘油氧化酶的重组大肠杆菌。
[0039]
将含有pet-28a-gpo质粒的重组大肠杆菌划线于含有50μg/ml卡那霉素的固体lb平板上，37℃培养12-16h后得到单克隆。在平板上挑取重组大肠杆菌单克隆于5ml液体lb培养基中37℃培养过夜。将培养过夜的菌液按照1％接种量接种于液体lb培养基中，30℃培养至生物量od600达到0.8-1.0，然后加入终浓度为0.1mm的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)在30℃下继续培养12-16h，4℃离心收集菌体。
[0040]
将离心收集的菌体加入破碎液(1g湿菌/10ml破碎液)震荡悬浮，在冰浴条件下进行超声破碎(功率400w，超声5s，间隙8s)30min，然后4℃15000rpm离心10min收集上清液。上清液经过0.45μm滤膜过滤后上histrap fast flow亲和层析柱，使用结合缓冲液(pbs，含30mm咪唑)洗脱杂蛋白，然后使用含300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。含有重组甘油磷酸氧化酶的洗脱液经装有sephadex g-25凝胶填料的脱盐柱脱盐后备用。sds-page检测重组蛋白的纯度达到95％，结果如图1所示，图1中m表示蛋白分子量标准；1表示纯化的磷酸甘油氧化酶本体。由图1可知，重组甘油磷酸氧化酶的分子量大小是67.6kda，与理论值一致(
[0041]
实施例2
[0042]
聚乙二醇化修饰磷酸甘油氧化酶gpo的制备：
[0043]
加入摩尔量为磷酸甘油氧化酶本体10-20倍的mpeg-nhs(分子量为5kda)，在ph7.4的50mm pb缓冲液中4℃分别轻柔震荡反应1-4h，得到mpeg修饰的gpo蛋白以及水解失活的mpeg-nhs。然后将上述反应混合液通过脱盐柱除去未反应的mpeg-nhs以及mpeg-nhs水解后小分子。脱盐柱填料为sephadex g-25(购自美国ge公司)，在凝胶干粉中加入去离子水在室温下充分溶胀24h，凝胶脱气后装柱。使用ph7.4的20mmol/l磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将mpeg-nhs修饰的反应混合物加入到层析柱上，然后使用平衡缓冲液(20mmol/lpb，ph7.4)开始洗脱，通过核酸蛋白检测仪在280nm处监测流出液的紫外吸收。由于聚乙二醇修饰的mpeg-gpo蛋白表观分子量超过100kda，而未参与反应的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯
mpeg-nhs以及水解后失活的mpeg-nhs分子量小于5kda，因此收集从脱盐柱最先流出的聚乙二醇修饰的mpeg-gpo蛋白，测定蛋白浓度并进行sds-page分析，结果如图2所示，图2中m表示蛋白分子量标准；1表示磷酸甘油氧化酶本体；2表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比20:1的条件下反应1h；3表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比10:1的条件下反应1h；4表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比20:1的条件下反应2h；5表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比10:1的条件下反应2h；6表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比20:1的条件下反应4h；7表示mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比10:1的条件下反应4h。由图2可知，随着修饰试剂mpeg-nhs与磷酸甘油氧化酶本体摩尔比例的增加以及反应时间的延长，磷酸甘油氧化酶本体被修饰的程度越来越高，表观分子量越来越大。最终选择加入摩尔量为磷酸甘油氧化酶本体20倍的mpeg-nhs在4℃下反应4h进行后续的蛋白修饰反应。
[0044]
另外，另外，(1)比较不同温度(4℃和25℃)对重组磷酸甘油氧化酶修饰度的影响。根据温度越高，分子热运动越快的原理，推测随着反应温度从4℃提高到25℃，mpeg-nhs的修饰反应速度更快，反应1h后蛋白修饰度就可以达到最高，但是酶比活性略有下降，因此后续选择4℃进行偶联反应。(2)比较不同ph缓冲液(ph6.5和ph8.0)对重组磷酸甘油氧化酶gpo修饰度的影响。因为酶制剂的反应条件较为温和，在强酸强碱下易失去活性，因此在ph6.5(酸性)的溶液中反应时，mpeg-nhs的修饰活性较低，反应4h后对磷酸甘油氧化酶本体的修饰度仍然较低，当在ph8.0(碱性)的溶液中反应时，mpeg-nhs自身的水解失活速度较快，导致对磷酸甘油氧化酶本体的修饰度也较低，因此后续在ph7.4(中性)的缓冲液中对磷酸甘油氧化酶本体进行交联反应。(3)不同分子量的mpeg-nhs(2kda和20kda)对重组蛋白gpo修饰度的影响。mpeg-nhs与蛋白的c端发生结合作用，形成共价键。因此使用分子量为2kda和20kda的mpeg-nhs对重组gpo进行修饰，修饰前后没有显著差异，但是2kda mpeg-nhs进行修饰的重组蛋白gpo热处理后，其酶热稳定性显著低于使用20kda的mpeg-nhs进行的修饰反应。因此，后续使用分子量为5kda的mpeg-nhs对重组gpo进行修饰。
[0045]
加入摩尔量为重组磷酸甘油氧化酶gpo蛋白20倍的mpeg-nhs(分子量为5kda)，在50mm pb缓冲液中(ph7.4)4℃反应4h，得到mpeg修饰的gpo蛋白。然后使用脱盐柱去除反应液中未反应的mpeg-nhs以及水解失活的mpeg-nhs副产物。然后测定经过脱盐的mpeg-gpo蛋白浓度并进行sds-page电泳分析，结果如图3所示，其中m表示蛋白分子量标准；1表示mpeg-nhs与gpo摩尔比20:1的条件下反应4h制备的mpeg-gpo；2表示经过凝胶过滤层析纯化的mpeg-gpo；3表示未修饰的gpo；与未被mpeg-nhs修饰的gpo相比，修饰gpo蛋白的表观分子量大幅度提升，表明重组蛋白gpo被mpeg-nhs有效修饰。经脱盐后的mpeg-gpo加入冻干保护剂蔗糖以及辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(工作浓度0.2mm)抽真空冷冻干燥后得到mpeg-gpo干粉。接下来，测定了未修饰gpo以及mpeg-nhs修饰gpo的比活性和米氏常数(km)。未修饰gpo的比活性为65.4u/mg，km为2.82mm(ph 6.5)；mpeg-nhs修饰后gpo的比活性为61.3u/mg，km为2.66mm(ph 6.5)。结果表明mpeg修饰对gpo的活性和米氏常数没有显著性影响。
[0046]
实施例3
[0047]
聚乙二醇化修饰的mpeg-gpo蛋白热稳定性比较：
[0048]
使用超纯水溶解经过冷冻干燥的gpo和mpeg-gpo干粉，然后使用脱盐柱除去冻干保护剂和其他小分子，脱盐缓冲液为100mm磷酸盐缓冲液(ph 6.5)，测定脱盐后的蛋白溶液
浓度并调整蛋白浓度为1mg/ml。然后将蛋白溶液在不同的温度下孵育30min，使用酶标仪在500nm下测定吸光度变化，计算不同温度孵育下残余酶活性，。以未进行热处理的gpo和mpeg-gpo的活性分别作为100％，计算不同温度处理后酶的残余活性，分析mpeg-nhs修饰对gpo热稳定性的影响，结果如图4所示，在超过40℃条件下处理蛋白30min，经mpeg-nhs修饰的mpeg-gpo蛋白热稳定性显著提高，40℃处理30min后mpeg-gpo活性残余95％，而未经修饰的gpo蛋白活性残余83％；45℃处理30min后mpeg-gpo活性残余87％，而未经修饰的gpo蛋白活性残余42％；50℃处理30min后mpeg-gpo活性残余63％，而未经修饰的gpo蛋白活性残余14％。以上结果表明经mpeg-nhs修饰的蛋白热稳定性得到显著提升。
[0049]
酶活性测定方法如下：
[0050]
采用分光光度法检测磷酸甘油氧化酶活性。原理如下：磷酸甘油氧化酶催化底物α-磷酸甘油钠(disodiumα-glycerophosphate)生成过氧化氢(h2o2)，生成的h2o2和4-氨基安替比林在辣根过氧化物酶催化下反应生成有色醌亚胺(quinoneimine dye)，可通过检测溶液在500nm处的吸光度来测定有色醌亚胺浓度变化，从而计算gpo酶活性。1u酶活力定义为在37℃下1min催化产生1μmol醌亚胺所需的酶量为1u。在该检测条件下每毫摩尔醌亚胺的消光系数为13.3。
[0051]
具体使用试剂及步骤如下：
[0052]
试剂配制：
[0053]
溶液a l-α-磷酸甘油钠母液0.2m
[0054]
购买的l-α-磷酸甘油钠(tci)纯度为90％，含水量大概30％，配制100ml的溶液a需要称取6.8g。溶解于100ml包含0.13％tritonx-100的磷酸盐缓冲液中(100mm，ph6.5)，4℃可保存2-3周。由于粘度较大，少量的tritonx-100很难准确吸取，可以先配制10％的tritonx-100水溶液10ml，然后取1.3ml加入到上述溶液中。
[0055]
溶液b 4-氨基安替比林溶液 0.1％
[0056]
称取20mg 4-氨基安替比林溶解于20ml纯水中，棕色瓶中4℃保存。
[0057]
溶液c 苯酚溶液 0.1％
[0058]
将20mg苯酚溶解于20ml水中，棕色瓶中4℃保存；如果购买的苯酚为溶液状态，则按照要求用水稀释成0.1％。
[0059]
溶液d 辣根过氧化物酶(hrp)溶液 25u/ml
[0060]
将10mg辣根过氧化物酶溶解于1ml水中，分装成每管50μl，-80℃保存。每次使用时取一管补加5ml纯水，充分溶解混匀，置于冰上待用。
[0061]
溶液e 酶稀释剂 0.2％ 牛血清白蛋白
[0062]
将20mg牛血清白蛋白溶解于10ml纯水中，冰上保存，现用现配。
[0063]
测定步骤：
[0064]
(1)配制反应液。按照以下比例配制反应液2ml。包括：1ml溶液a；0.2ml溶液b；0.4ml溶液c；0.4ml溶液d；使用溶液e将gpo酶稀释成20ug/ml。
[0065]
(2)将反应液加入酶标板中，每孔200μl，37℃孵育5min。
[0066]
(3)在每孔中加10μl的gpo稀释酶液(0.2μg/每孔)，立即开始反应，酶标仪在500nm波长下监测反应10min，根据摩尔消光系数计算酶活性。
[0067]
实施例4
[0068]
聚乙二醇化修饰的mpeg-gpo蛋白ph稳定性比较：
[0069]
使用超纯水溶解经过冷冻干燥的gpo和mpeg-gpo干粉，然后使用脱盐柱除去冻干保护剂和其他小分子，脱盐缓冲液为20mm磷酸盐缓冲液(ph 7.4)，测定脱盐后的蛋白溶液浓度并调整蛋白浓度为10mg/ml。然后配置不同ph的200mm缓冲液，其中ph4-6选择乙酸-乙酸钠缓冲液，ph6.5-7.4选择磷酸盐缓冲液，ph8-10选择tris-hcl缓冲液。使用不同ph的缓冲液将10mg/ml的gpo和mpeg-gpo蛋白稀释成1mg/ml，将不同ph的蛋白溶液在4℃下孵育12h，测定孵育后未修饰gpo和mpeg-gpo的比活性。分别以未修饰gpo和mpeg-gpo最高酶活性为100％，计算不同ph条件下酶残余活性，结果如图5所示，经mpeg-nhs修饰的gpo酶在酸性和碱性缓冲液中稳定性更好，在ph5-8的缓冲液中处理12h后残留酶活性均超过90％，而未经修饰的gpo在ph5.0条件下处理12h后酶活性残留81％，在ph8.0条件下处理12h后酶活性残留82％。