一种PTH刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法及其应用

一种pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及药物应用技术领域，尤其是涉及一种pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法及其应用。


背景技术：

2.骨关节炎(oa)是最常见的疾病，也是身体残疾的主要原因。由于人口老龄化和肥胖患病率的增加，oa的患病率正在上升。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质成分组成，由于缺乏血管系统和神经元，它们的自我再生能力有限。目前，对oa患者还没有有效的治疗方法。
3.外泌体因其在骨关节炎治疗中的潜在价值而引起了人们极大的兴趣。骨髓间充质干细胞通过旁分泌机制在炎症反应中发挥重要作用，特别是外泌体的作用。来自骨髓间充质干细胞的外泌体(exo
bmsc
)含有大量的活性物质，如dna、rna和蛋白质。与骨髓间充质干细胞治疗相比，exo
bmsc
治疗显示出更多的优势，包括靶向递送、良好的组织穿透性、突出的长期循环性能、更好的归巢能力、稳定的化学性质，以及大量的组织修复和再生能力。
4.目前，骨髓间充质干细胞的外泌体的产生效率和作用效果成为本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法及其应用，采用本发明的提取方法获得的骨髓间充质干细胞外泌体具有更强的抗炎作用，从而实现oa软骨修复作用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.第一目的，本发明提供了一种pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法，使用甲状旁腺激素(1-34)预处理骨髓间充质干细胞，收集骨髓间充质干细胞外泌体。
8.本发明提供一种通过甲状旁腺激素(1-34)作用于骨髓间充质干细胞然后提取外泌体的方法，外泌体提取的效率高，并且在该方法中通过甲状旁腺激素(1-34)刺激骨髓间充质干细胞，使得骨髓间充质干细胞产生更强抗炎作用的外泌体，从而实现oa软骨修复作用。
9.相比较exo
bmsc
，使用甲状旁腺激素(1-34)刺激骨髓间充质干细胞获得的外泌体(exo
pth
)具有更佳抗炎作用，实现oa软骨修复的效果更佳。
10.作为本发明所述提取方法的优选实施方式，所述甲状旁腺激素(1-34)的浓度为5-20nm。
11.采用上述浓度的甲状旁腺激素(1-34)刺激骨髓间充质干细胞获得的exo
pth
抗炎效果更佳，有助于oa软骨的修复。
12.作为本发明所述提取方法的优选实施方式，所述甲状旁腺激素(1-34)的浓度为
10nm。
13.当甲状旁腺激素(1-34)的浓度为10nm时，刺激骨髓间充质干细胞获得的外泌体(exo
pth
)具有最佳的抗炎作用，最佳地实现oa软骨修复的效果。
14.作为本发明所述提取方法的优选实施方式，提取方法的具体步骤包括：
15.(a)将骨髓间充质干细胞接种于培养基中进行培养，然后使用浓度为10nm的甲状旁腺激素(1-34)预处理骨髓间充质干细胞，收集含有预处理后的骨髓间充质干细胞的培养基；
16.(b)将上述步骤(a)收集的培养基进行第一次、第二次离心，获取上清液，然后将上清液进行第三次及第四次离心，获得骨髓间充质干细胞外泌体。
17.作为本发明所述提取方法的优选实施方式，所述培养基包括l-dmem完全培养液。
18.作为本发明所述提取方法的优选实施方式，所述第一次离心的速度为300-500g，离心时间为5-10min；所述第二次离心的速度为2000-3000g，离心时间为5-10min；所述第三次离心的速度为10000g，离心时间为30-40min；所述第四次离心的速度为100000-120000g，离心时间为60-90min。
19.更优选地，所述第一次离心的速度为300g，离心时间为10min；所述第二次离心的速度为2000g，离心时间为10min；所述第三次离心的速度为10000g，离心时间为40min；所述第四次离心的速度为120000g，离心时间为70min。
20.本发明提取方法中采用第一次和第二次离心是为了去除上清液中的细胞碎片；采用第三次和第四次离心是为了去除非外泌体囊泡和任何可能的凋亡小体。
21.优选地，第一次离心至第四次离心均在4℃下进行。
22.第二目的，本发明提供了上述提取方法获得的骨髓间充质干细胞外泌体。
23.第三目的，本发明还提供了上述pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗骨关节炎修复药物中的应用。
24.本发明发明人经过大量研究及试验发现，exo
pth
可以增强il-1β诱导的oa软骨细胞的增殖、迁移和软骨基质形成。此外，exo
pth
在oa治疗中的潜在机制与抑制促炎因子(il-2、tnf-α和il-6)的产生有关，对骨关节炎修复具有重要作用。采用本发明的提取方法获得exo
pth
在抗炎作用上好于exo
bmsc
，进而治疗oa的效果更好。
25.更优选地，骨髓间充质干细胞外泌体干预由原代软骨细胞构成的oa模型，干预时间为24、48或72小时。
26.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述骨髓间充质干细胞外泌体的浓度为5-100μg/ml，更优选地，所述骨髓间充质干细胞外泌体的浓度为10μg/ml。采用上述浓度的骨髓间充质干细胞外泌体可以更好的修复oa。
27.作为本发明所述应用的优选实施方式，骨髓间充质干细胞外泌体通过注射至骨关节中。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.本发明提供了一种pth刺激的骨髓间充质干细胞外泌体的提取方法及其应用，通过甲状旁腺激素(1-34)作用于骨髓间充质干细胞，使得骨髓间充质干细胞产生更强抗炎作用的外泌体(exo
pth
)，从而实现oa软骨修复作用；相比较exo
bmsc
，使用甲状旁腺激素(1-34)刺激骨髓间充质干细胞获得的外泌体具有更佳抗炎作用，实现oa软骨修复的效果更佳。
附图说明
30.图1为实施例3中exo
pth
的提取方法的示意图；
31.图2为exo
bmsc
和exo
pth
的特性分析图；
32.图3为实施例5中采用流式细胞术、划痕迁移试验和cck-8试验检测exo
bmsc
和exo
pth
对oa软骨细胞增殖的影响结果图(数据以mean
±
sd表示，*p《0.05与oa组比较和#p《0.05与exo
bmsc
组比较)；
33.图4为实施例5中采用ki67和pcna免疫荧光染色法检测exo
bmsc
和exo
pth
对oa软骨细胞增殖的影响结果图(数据以mean
±
sd表示，*p《0.05与oa组比较和#p《0.05与exo
bmsc
组比较；bar＝50μm)；
34.图5为甲状旁腺激素(1-34)作用于骨髓间充质干细胞产生的外泌体exo
pth
增强oa软骨细胞修复作用的机理图。
具体实施方式
35.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
36.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.实施例1、软骨细胞的制备方法
38.软骨细胞的获得和培养：
39.(1)取大鼠断颈处死后，75％酒精浸泡10min，移至超净工作台内，仰卧固定大鼠；剪开腿部皮肤，打开膝盖，无菌切取双侧膝软骨，放入含双抗pbs中，将组织切成1mm3小块。
40.(2)pbs清洗组织2遍，加二型胶原酶，37℃恒温箱消化4-6h；加入大鼠软骨细胞完全培养基稀释消化液，吸管轻轻吹打至液体中无大块组织；300g离心5min，弃上清，保留细胞与组织沉淀。
41.(3)用大鼠软骨细胞完全培养基重悬细胞与组织，接种于培养皿中，于37℃，5％co2恒温培养箱中静置培养，3天后首次换液，以后每3天换液一次，细胞长满后待用。
42.实施例2、骨髓间充质干细胞的制备方法
43.(1)sd大鼠麻醉处死，75％酒精浸泡10min，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在加双抗pbs中。
44.(2)将离心管(内含骨头)置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，用含双抗pbs清洗组织3遍，去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用10ml注射器含10％fbs的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶；反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液；细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞。
45.(3)将细胞接种于t25培养瓶中，每瓶含5ml l-dmem完全培养液。在体积分数为5％的co2和37℃条件下静止培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3～4d半量换液1次，10～12d细胞达90％融合时传代。
46.实施例3、exo
pth
的提取方法
47.(1)骨髓间充质干细胞的获得和培养：
48.采用上述实施例2的方法获得骨髓间充质干细胞以及培养骨髓间充质干细胞。
49.(2)甲状旁腺激素(1-34)干预骨髓间充质干细胞：
50.使用浓度为10nm的甲状旁腺激素(1-34)预处理骨髓间充质干细胞6小时，然后再次更换培养基，48小时后收集含有预处理后的骨髓间充质干细胞的培养基。
51.(3)外泌体收集：
52.收集200ml上述步骤(2)获得的培养基，分别进行300g和2000g离心，从上清液中去除细胞碎片，每次离心时间为10min；为了去除非外泌体囊泡和任何可能的凋亡小体，然后将上清液在10000g下旋转40min；最后，在120000g下70min下获得exo
pth
；所有离心均在4℃下进行。exo
pth
直接使用或在-80℃下保存；exo
pth
的提取步骤如图1所示(其中bmsc为骨髓间充质干细胞；pth为甲状旁腺激素)。
53.实施例4、检测分析exo
pth
54.为了验证实施例3获得的exo
pth
，本实施例采用一系列检测手段进行验证。具体如下：
55.(1)通过nta(纳米颗粒跟踪分析)检测exo
pth
的粒径：
56.如图2-a所示，exo
pth
主要集中在100nm附近(60～150nm)，浓度为4.5
×
106particles/ml。
57.(2)扫描电镜检测：
58.exo
bmsc
和exo
pth
透射电镜图像(bar＝100nm)结果如图2-b所示，扫描电镜观察结果显示，exo
pth
呈碟状或杯状，为外泌体的典型形态。
59.(3)western blotting检测exo
bmsc
和exo
pth
标记物的蛋白表达情况：
60.结果图2-c所示，exo
pth
表面蛋白cd9和tsg101阳性表达。
61.(4)使用dil标记的exo
pth
观察exo
pth
的分布在软骨细胞的胞质结构域，如图2-d所示，表明软骨细胞对exo
pth
可以有效摄取。
62.实施例5exo
pth
对oa软骨细胞的影响
63.采用流式细胞术、划痕迁移试验和cck-8试验检测exo
bmsc
和exo
pth
对oa软骨细胞增殖的影响，结果如图3所示。
64.(1)采用edu流式细胞术试剂盒检测oa、exo
bmsc
和exo
pth
组的细胞增殖情况，结果如图3-a所示。与exo
bmsc
组和exo
pth
组相比，oa软骨细胞增殖率分别显著降低了27.06％和50.73％。与exo
bmsc
组相比，exo
pth
组显著增加了48.06％。
65.(2)采用对照组、oa组、exo
bmsc
治疗组和exo
pth
治疗组进行划痕迁移试验，结果如图3-b和图3-c所示。oa组软骨细胞的迁移率明显受到抑制，与exo
bmsc
组和exo
pth
组相比，oa软骨细胞的迁移率明显降低(59.52％和70.82％)。此外，exo
pth
治疗比exo
bmsc
治疗更有效。与exo
bmsc
组相比，exo
pth
组显著增加了39.96％。
66.(3)采用cck-8法检测对照组、oa组、exo
bmsc
组和exo
pth
组的细胞增殖能力(数据以mean
±
sd表示，*p《0.05与oa组比较和#p《0.05与exo
bmsc
组比较)，结果如图3-d所示。exo
bmsc
和exo
pth
均能促进oa软骨细胞在24h、48h、72h后的增殖。此外，exo
pth
的增殖效果比exo
bmsc
更有效。
67.(4)采用ki67和pcna免疫荧光染色法检测exo
bmsc
和exo
pth
对oa软骨细胞增殖的影响，结果参考图4；ki67和pcna的免疫荧光染色如图4-a所示。
68.计算ki67指数(ki67阳性细胞百分比/总细胞)的阳性表达率，与对照组、exo
bmsc
组
和exo
pth
组相比，oa组ki67阳性细胞的比例明显降低(分别为70.44％、30.03％和64.51％)。与exo
bmsc
组相比，exo
pth
组中ki67阳性细胞的百分比显著增加了97.17％，结果如图4-b所示。
69.计算pcna指数(pcna阳性细胞百分比/总细胞)的阳性表达率，与对照组、exo
bmsc
组、exo
pth
组相比，oa组的pcna阳性细胞百分比明显降低。与对照组、exo
bmsc
组和exo
pth
组相比，oa组pcna阳性细胞比例明显降低(分别为74.34％、40.46％和68.74％)。exo
bmsc
组的pcna阳性细胞百分比明显低于exo
pth
组(exo
pth
组显著升高47.50％)，结果如图4-c所示。
70.上述结果表明，本发明的exo
pth
能够更好的实现oa软骨细胞的修复，从而达到治疗oa的效果。
71.参考图5为甲状旁腺激素(1-34)作用于骨髓间充质干细胞产生的外泌体(exo
pth
)增强oa软骨细胞修复作用的机理图，研究发现，exo
pth
可以增强il-1β诱导的oa软骨细胞的增殖、迁移和软骨基质形成。此外，exo
pth
在oa治疗中的潜在机制与抑制促炎因子(il-2、tnf-α和il-6)的产生有关。与exo
bmsc
相比，exo
pth
的抗炎作用更优，因此exo
pth
在缓解oa中发挥更重要的作用。综上所述，采用本发明提取方法获得exo
pth
能够更好的实现oa软骨细胞的修复，对oa治疗有效，而关节内注射exo
pth
的研究可以为其临床应用提供新的思路。
72.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。