一种促血管化和抗钙化且可3D打印心脏瓣膜的水凝胶

一种促血管化和抗钙化且可3d打印心脏瓣膜的水凝胶
技术领域
1.本发明属于生物医用高分子材料和医疗器械领域，具体涉及一种促血管化和抗钙化且可3d打印心脏瓣膜的水凝胶。


背景技术：

2.心脏瓣膜疾病是目前仅次于冠心病和高血压的心血管疾病之一，严重威胁人类身体健康。心脏瓣膜置换术作为临床治疗心脏瓣膜疾病最有效的治疗手段已被广泛应用。现有的植入式瓣膜大多以机械类和生物类瓣膜为主，但前者易引发血栓，植入后需终身抗凝，严重的甚至会引起继发性出血，后者虽然因其优异的血液动力性、无需终身抗凝以及术后不易引发感染等诸多优势使其在人工心脏瓣膜市场占有率持续升高，但长期接触血液会导致心脏瓣膜钙化疾病且临床耐用性较差，严重威胁患者的生命安全。因此，临床亟需深入研究心脏瓣膜疾病的发病机制，研发新型心脏瓣膜支架以克服上述人工心脏瓣膜的不足，提高心脏瓣膜支架的组织适配性，延长人工心脏瓣膜支架的临床服役寿命。
3.天然瓣膜组织具有层状结构和区域异质特性，从仿生瓣膜组织细胞外基质结构的角度构建组织工程瓣膜，可望在生理环境下更好地实现受损瓣膜的修复与重建。天然瓣膜组织是由细胞外基质组成天然瓣膜组织的层状结构，层与层之间的组成、性能以及微观形貌都大不相同，瓣膜的三层结构由细胞外基质组合为一个整体，每一层的细胞外基质成分各有特点。因此，在3d打印精准化制造和组织工程技术高速发展的双重背景下，以解决心脏主动脉瓣支架结构精度控制不足、力学强度弱、抗凝血/钙化不足及难内皮化等技术难题为目标，提出从仿生瓣膜组织复杂结构的角度，以3d打印技术精准制备多层各向异性瓣膜支架，用于模拟天然瓣膜组织特有的分层结构和区域异质特征，促进心脏组织部位的再生与修复具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供一种促血管化和抗钙化且可3d打印心脏瓣膜的水凝胶。旨在通过席夫碱交联技术制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶，然后利用挤压式3d打印策略打印心脏瓣膜，最后用紫外光引发自由基聚合策略强化心脏瓣膜的交联密度，为其提供良好的机械性能。精氨酸可在体内一氧化氮酶的作用下释放内源性no气体赋予水凝胶优异的促血管化性能，此外水凝胶还具有抗氧化抗凝血和抗钙化性能，可以有效促进瓣膜组织的再生与重建、延长生物瓣膜支架的使用时间，可广泛用于心血管、心脏瓣膜及组织工程领域。
5.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
6.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入含氨基的天然高分子材料进行酰胺化偶联反应，待反应结束后将反应液置于透析液中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的天然高分子衍生聚合物；
7.(2)在暗室中向透明质酸钠溶液中滴加高碘酸钠溶液并进行反应，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
8.(3)将所述的l-精氨酸改性的天然高分子衍生聚合物、氧化透明质酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯及导电化学物在光引发剂溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
9.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率和挤出压力，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化，即得3d打印心脏瓣膜。
10.优选的，步骤(1)所述含氨基的天然高分子材料溶液的浓度为1-30mg/ml；l-精氨酸盐酸盐的羧基与含氨基的天然高分子材料溶液的氨基摩尔比为3∶1-1∶2；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为2∶1-1∶3；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为3∶1-1∶1；反应温度为4-60℃，反应时间为12-72小时。
11.优选的，步骤(1)所述反应液的ph值为4-6，透析液包括但不限于超纯水、去离子水、生理盐水、pbs的至少一种。
12.优选的，步骤(1)所述含氨基的天然高分子材料包括但不限于聚赖氨酸、明胶、壳聚糖及其衍生物的至少一种。
13.优选的，步骤(2)所述高碘酸钠溶液的浓度为10-200mg/ml，加入高碘酸钠溶液后的反应时间为1-4小时，滴加乙二醇后的反应时间为0.5-3小时，透明质酸钠的浓度为1-20mg/ml，透明质酸钠的分子量为5-200万道尔顿。
14.优选的，步骤(3)所述含导电化合物包括但不限于碳纤维、石墨烯、碳量子点、碳纳米管、三氯化铁的至少一种，光引发剂为i2959，光引发剂的浓度为1-20mg/ml，l-精氨酸改性的天然高分子衍生聚合物的浓度为30-240mg/ml，氧化透明质酸钠的浓度为20-100mg/ml，聚乙二醇二丙烯酸酯的浓度为30-200mg/ml，导电化学物的浓度为1-10mg/ml。
15.优选的，步骤(4)所述的3d打印机打印头移动速度倍率为25-300，挤出压力为25-75psi，紫外光光照时间为0-120分钟。
16.本发明还提供由上述方法制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶。
17.本发明还提供由上述可3d打印心脏瓣膜水凝胶制备的3d打印心脏瓣膜。
18.本发明还提供由上述方法制备的可3d打印心脏瓣膜水凝胶在心血管、心脏瓣膜及组织工程领域。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.本发明利用l-精氨酸对含氨基的天然高分子材料进行功能化修饰，旨在实现内源性no气体的缓控释释放，赋予水凝胶优异的血管化性能，此外，l-精氨酸介导的水凝胶体系还具有优异的抗氧化性能，能够清除或减缓活性氧及活性氧介导的氧化应激信号，为钙化主动脉瓣疾病的防治提供了新思路。利用挤压式3d打印技术联合紫外光引发自由基聚合策略打印心脏瓣膜，可实现心脏瓣膜组织病变的精确和个性化治疗。导电化合物的引入可实现对心脏主动脉血流动力学的精准检测，便于临床治疗过程中的体外诊断，可广泛用于心血管、心脏瓣膜及组织工程领域。
附图说明
21.图1是本发明所述可3d打印心脏瓣膜水凝胶的血液相容性。
22.图2是本发明所述可3d打印心脏瓣膜水凝胶的蛋白吸附效果图。
23.图3是本发明所述聚赖氨酸导电水凝胶的电传导性能。
24.图4是本发明所述聚赖氨酸导电水凝胶的抗氧化性能。
25.图5是本发明所述聚赖氨酸导电水凝胶的no释放性能。
26.图6是本发明所述聚赖氨酸导电水凝胶的促血管生成示意图。
27.图7是本发明所述聚赖氨酸3d打印心脏瓣膜示意图。
具体实施方式
28.根据下述实施例和附图，可以更好地理解本发明并对本发明作进一步说明。然而，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不是对本发明权利要求的限制。
29.实施例1
30.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入5mg/ml聚赖氨酸进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为4.5，30℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于超纯水中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与聚赖氨酸的氨基摩尔比为3∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为2∶1。
31.(2)在暗室中向5mg/ml的透明质酸钠(200万道尔顿)溶液中滴加5mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应2小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应2小时后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
32.(3)将所述的l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物(200mg/ml)、氧化透明质酸钠(100mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg/ml)及碳纳米管(5mg/ml)在5mg/ml光引发剂i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
33.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为30和挤出压力50psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化20分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
34.实施例2
35.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入5mg/ml聚赖氨酸进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为4.5，4℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于超纯水中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与聚赖氨酸的氨基摩尔比为3∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶1。
36.(2)在暗室中向10mg/ml的透明质酸钠(20万道尔顿)溶液中滴加5mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应2小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应1小时后进行透
析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
37.(3)将所述的l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物(200mg/ml)、氧化透明质酸钠(200mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg/ml)及石墨烯(5mg/ml)在5mg/ml光引发剂i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
38.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为100和挤出压力50psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化20分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
39.(5)将可3d打印心脏瓣膜水凝胶与2％的兔红细胞悬液共培养一段时间后评价其血液相容性能。
40.实施例3
41.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入5mg/ml明胶进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为4.5，40℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于超纯水中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的明胶衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与明胶的氨基摩尔比为3∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶1。
42.(2)在暗室中向10mg/ml的透明质酸钠(20万道尔顿)溶液中滴加5mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应2小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应1小时后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
43.(3)将所述的l-精氨酸改性的明胶衍生物(200mg/ml)、氧化透明质酸钠(200mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg/ml)及石墨烯(5mg/ml)在10mg/ml光引发剂i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
44.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为100和挤出压力60psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化30分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
45.(5)将可3d打印心脏瓣膜水凝胶与fitc标记的牛血清蛋白共培养一段时间后评价其蛋白黏附性能。
46.实施例4
47.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入5mg/ml明胶进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为5.0，40℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于去离子水中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的明胶衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与明胶的氨基摩尔比为3∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶1。
48.(2)在暗室中向10mg/ml的透明质酸钠(20万道尔顿)溶液中滴加5mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应2小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应1小时后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
49.(3)将所述的l-精氨酸改性的明胶衍生物(200mg/ml)、氧化透明质酸钠(200mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg/ml)及碳纤维(5mg/ml)在10mg/ml光引发剂i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
50.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为100和挤出压力60psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化30分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
51.(5)利用电阻测定设备评价可3d打印心脏瓣膜水凝胶电传导性能。
52.实施例5
53.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入5mg/ml明胶进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为5.0，40℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于生理盐水中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的明胶衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与明胶的氨基摩尔比为3∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为2∶1。
54.(2)在暗室中向10mg/ml的透明质酸钠(100万道尔顿)溶液中滴加10mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应3小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应1小时后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
55.(3)将所述的l-精氨酸改性的明胶衍生物(200mg/ml)、氧化透明质酸钠(200mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(150mg/ml)及碳纤维(5mg/ml)在10mg/ml光引发剂i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
56.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为100和挤出压力60psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化30分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
57.(5)将所述的可3d打印心脏瓣膜水凝胶进行过氧化氢清除测试评价其抗氧化性能。
58.实施例6
59.(1)向l-精氨酸盐酸盐溶液中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺对l-精氨酸盐酸盐的羧基基团进行活化后加入10mg/ml聚赖氨酸进行酰胺化偶联反应，调整反应ph值为5.5，37℃进行反应24小时，待反应结束后将反应液置于pbs中透析纯化、冻干可得l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物，其中l-精氨酸盐酸盐的羧基与聚赖氨酸的氨基摩尔比为1∶1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与l-精氨酸盐酸盐的摩尔比为1∶2，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶1。
60.(2)在暗室中向10mg/ml的透明质酸钠(200万道尔顿)溶液中滴加5mg/ml高碘酸钠溶液并进行反应4小时，待反应结束后加入乙二醇终止高碘酸钠的氧化反应2小时后进行透析纯化，冻干可得氧化透明质酸钠；
61.(3)将所述的l-精氨酸改性的聚赖氨酸衍生物(150mg/ml)、氧化透明质酸钠(200mg/ml)、聚乙二醇二丙烯酸酯(100mg/ml)及碳量子点(2.5mg/ml)在15mg/ml光引发剂
i2959溶液中依次溶解混合制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶；
62.(4)将所述的3d打印心脏瓣膜水凝胶置于3d打印机的注射器中，然后调整3d打印机打印头移动速度倍率为200和挤出压力50psi，进行心脏瓣膜的构建，最后使用紫外光照射固化20分钟，即得3d打印心脏瓣膜。
63.(5)将可3d打印心脏瓣膜水凝胶置于pbs中，使用griess试剂评价其no的生成能力。
64.综上表明，本发明提供了一种促血管化和抗钙化且可3d打印心脏瓣膜的水凝胶，旨在通过席夫碱交联技术制备可3d打印心脏瓣膜水凝胶，然后利用挤压式3d打印策略打印心脏瓣膜，最后用紫外光引发自由基聚合策略强化心脏瓣膜的交联密度，为其提供良好的机械性能。此外，水凝胶还具有优异的促血管化性能、抗氧化、抗凝血和抗钙化性能，可以有效促进瓣膜组织的再生与重建、避免多次手术，可广泛用于心血管、心脏瓣膜及组织工程领域。