CNR基因及其编码的蛋白质在调控植物果实失水中的应用

cnr基因及其编码的蛋白质在调控植物果实失水中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及cnr基因及其编码的蛋白质在调控植物果实失水中的应用。


背景技术：

2.新鲜果品蔬菜含水量高达85％-95％，采收后由于蒸腾作用，水分很容易损失，导致果蔬的失重和失鲜，严重影响果蔬的商品外观和储藏寿命。
3.角质层作为植物的一级保护屏障，发挥着重要的生理作用，例如，防止植物体的失水。角质层由蜡质和角质基质构成。角质基质是含羟基和羟基环氧基的c16、c18脂肪酸交联形成的聚酯基质，其与表皮细胞壁交织在一起，形成角质层的骨架结构。蜡质或镶嵌或覆盖在角质基质上，形成完整角质层。这两种主要成分的缺失会导致角质层厚度及功能发生改变。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供cnr基因的应用。
5.本发明提供了调控cnr基因表达或调控cnr蛋白含量的物质在如下任一中的应用：
6.(1)调控植物果实失水；
7.(2)制备调控植物果实失水的产品；
8.(3)调控植物果实角质层形成；
9.(4)制备调控植物果实角质层形成的产品；
10.(5)调控植物果实总蜡负荷量；
11.(6)制备调控植物果实总蜡负荷量的产品。
12.可选地，根据上述的应用，所述调控植物果实失水为调控植物果实生长发育和/或采后失水率；所述调控植物果实角质层形成为调控植物果实角质层厚度。
13.本发明还提供了cnr基因、cnr蛋白或cnr基因的相关生物材料在如下任一中的应用：
14.(1)调控植物果实失水；
15.(2)制备调控植物果实失水的产品；
16.(3)调控植物果实角质层形成；
17.(4)制备植物果实角质层形成的产品；
18.(5)调控植物果实总蜡负荷量；
19.(6)制备调控植物果实总蜡负荷量的产品。
20.可选地，根据上述的应用，所述调控植物果实失水为调控植物果实生长发育和/或采后失水，例如调控植物果实生长发育和/或采后失水率；所述调控植物果实角质层形成为调控植物果实角质层厚度。
21.本文中，所述cnr基因可为如下任一种：
22.d1)核苷酸序列是是如seq id no.5所示的dna分子；
23.d2)编码序列是如seq id no.6所示的dna分子；
24.d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于番茄且编码cnr蛋白的dna分子；
25.d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码cnr蛋白的dna分子。
26.本文中，所述cnr蛋白可为如下任一种：
27.(a1)氨基酸序列为seq id no.7所示的蛋白质；
28.(a2)将(a1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
29.(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
30.本文中，所述相关生物材料可为下述任一种：
31.c1)抑制cnr基因表达或降低cnr蛋白含量的核酸分子；
32.c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；
33.c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；
34.c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；
35.c5)含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
36.c6)含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织；
37.c7)含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官；
38.c8)含有cnr基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
39.可选地，根据上述的相关生物材料，c1)所述的核酸分子为特异sgrna或表达所述特异sgrna的dna分子，所述特异sgrna的靶点序列如seq id no.1-4中的至少一种所示。
40.可选地，根据上述的相关生物材料，c2)所述的表达盒为含有表达所述特异sgrna的dna分子的表达盒，所述特异sgrna的靶点序列如seq id no.1-4中的至少一种所示。
41.可选地，根据上述的相关生物材料，c3)所述的重组载体为含有表达所述特异sgrna的dna分子的表达盒，所述特异sgrna的靶点序列如seq id no.1-4中的至少一种所示，例如下述实施例制备的pylcrispr/cas9pubi-h-slcnr。
42.可选地，根据上述的相关生物材料，c8)所述的重组载体为含有seq id no.5所示的dna分子的载体，例如下述实施例制备的pcambia1300-35s-gfp-slcnr。
43.上述生物材料中，所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
44.上文中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
45.本文中，术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用计算机软件进
行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
46.上述应用中，调控cnr蛋白含量的物质可为敲除cnr蛋白的编码基因的物质和/或调控cnr蛋白的编码基因表达的物质。
47.上述应用中，调控cnr基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
48.上述应用中，调控cnr基因表达可为抑制或降低cnr基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。
49.所述基因敲除(gene knockout)是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。
50.所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。
51.上述应用中，调控cnr基因表达的物质可为抑制或降低cnr基因表达的试剂。所述抑制或降低cnr基因表达的试剂可为敲除cnr基因的试剂，如通过同源重组敲除cnr基因的试剂，或通过crispr-cas9敲除cnr基因的试剂。所述抑制或降低cnr基因表达的试剂也可以包含靶向cnr基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
52.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。
53.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
54.本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
55.所述严格条件可为在0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)，0.1％sds的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。
56.上文中，所述植物可为茄科植物、番茄属植物或番茄。
57.本发明实施例显示，cr-cnr(cnr基因编辑材料，cr-slcnr#16、cr-slcnr#22、cr-slcnr#23)番茄果实的角质层厚度显著高于野生型，而cnr过表达番茄(oe-slcnr#21、oe-slcnr#24)角质层变薄，厚度显著低于野生型，且表皮更加光亮，表皮蜡晶的堆积更加致密，表明cnr负调控番茄果实角质层的厚度。
58.本发明实施例显示，在mg时期，cr-cnr番茄果实中二十九烷烃的含量极显著升高，短链醇类含量显著升高，蜡质总量升高；在cnr过表达番茄果实中二十九烷烃的含量显著下
降，蜡质总量相对较少，表明cnr参与调控了果实蜡质单体含量的积累。
59.本发明实施例显示，cr-cnr番茄果实失水率低于野生型，而cnr过表达番茄果实失水率高于野生型，表明cnr表达差异影响果实的失水率。
附图说明
60.图1为实施例1三种纯合crispr/cas9-slcnr植株的编辑情况。
61.图2为实施例1western blot检测crispr/cas9-slcnr果实中slcnr蛋白的表达水平。
62.图3为实施例1western blot检测overexperssion-slcnr果实中slcnr蛋白的表达水平。
63.图4为实施例2失水率统计。
64.图5为实施例3番茄果实的表型差异。
65.图6为实施例3绿熟期番茄果实的角质层厚度测定。
66.图7为实施例3破色期番茄果实的角质层厚度测定。
67.图8为实施例3破色后第3天番茄果实的角质层厚度测定。
具体实施方式
68.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
69.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特别说明，采用student’s t.test法进行差异性分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
70.slcnr基因genbank登录号为nc_0154392018年8月8日(序列如seq id no.5所示)，slcnr蛋白genbank登录号为np_001306237，2020年5月14日(序列如seq id no.7所示)，其cds核苷酸序列如seq id no.6所示(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_001306237.1)。
71.番茄(solanum lycopersicum)野生型ac(ailsa craig)种子、slcnr基因编辑(crispr/cas9-slcnr)番茄种子(记载于gao et al，2019)、slcnr基因过表达(over expression-slcnr)番茄种子由本实验室保存，于北京市上庄花卉基地规范种植，待番茄果实成熟(破色7-8天)后，取各株系成熟果实的各组织，液氮速冻后，存于-80℃，用于后续实验。
72.高保真pcr mix(金牌mix)和普通pcr mix、质粒提取试剂盒、琼脂糖购于北京擎科新业生物技术有限公司。
73.slcnr特异性抗体，由本实验室自行制备，制备方法：扩增slcnr的cds序列并构建pet30a-his-slcnr原核表达载体，使pet30a-his-slcnr原核表达载体表达his-slcnr融合蛋白，使用镍-琼脂糖凝胶树脂纯化his-slcnr融合蛋白，用纯化后的his-slcnr蛋白免疫小
鼠获得slcnr特异性抗血清(免疫方法按常规免疫方法进行)。将抗血清与不同浓度cnr-his纯化蛋白孵育，可检测到6ng的slcnr蛋白，说明抗体灵敏度达到要求。
74.下述实施例所使用的slcnr蛋白质免疫印迹western blot检测方法，具体如下。
75.1.蛋白提取——丙酮法
76.1)将番茄组织冻样研磨成粉末，称取约0.5g，放入2ml离心管中；
77.2)加入1.3ml 10％三氯乙酸溶液，剧烈振荡，16000
×
g，4℃，3min；
78.3)弃上清，加入1ml 0.1m乙酸铵溶液，涡旋振荡，16000
×
g，4℃，3min；
79.4)弃上清，加入1ml 80％丙酮溶液，涡旋振荡，16000
×
g，4℃，3min；
80.5)弃上清，放置通风橱15-30min干燥；
81.6)加入1ml tris饱和酚，振荡溶液，随后再加1ml a液，混匀，室温静置5min；
82.7)16000
×
g，室温，3min，转移上清至新的2ml离心管；
83.8)加0.1m乙酸铵溶液1ml，混匀，放置于-20℃过夜；
84.9)16000
×
g，4℃，3min，弃上清；
85.10)加入1ml甲醇，振荡，4℃，16000
×
g，3min，弃上清；
86.11)加入1ml 80％丙酮溶液，振荡，4℃，16000
×
g，3min，弃上清；
87.12)通风橱干燥后，加入100μlsds buffer溶液，溶解沉淀；
88.13)bca法测定蛋白浓度，随后定量加入5
×
sds loading buffer至1
×
，100℃沸水浴5min，变性后蛋白置于4℃储存。
89.丙酮法提取蛋白相关试剂的配制：
90.1)10％三氯乙酸：500g三氯乙酸中加入227ml蒸馏水，混匀，得到100％三氯乙酸溶液，以100％三氯乙酸∶丙酮＝1∶9[v/v]的比例，配制成10％三氯乙酸溶液；
[0091]
2)0.1m乙酸铵：称取3.854g乙酸铵，加400ml甲醇，蒸馏水定容500ml；
[0092]
3)80％丙酮：以水∶丙酮＝1∶4[v/v]的比例，配制成80％丙酮溶液；
[0093]
4)a液：30g蔗糖，2g sds，2.42g tris，5％β-巯基乙醇(现用现加)，用hcl调ph至8.0，蒸馏水定容100ml；
[0094]
5)sds buffer溶液：称取tris 6.05g，sds 1.4g，用hcl调ph至7.0，蒸馏水定容100ml。
[0095]
2.蛋白的western blot检测
[0096]
1)制备浓缩胶为4％，分离胶为10％的两块sds-page电泳胶；
[0097]
2)取25μg变性后蛋白上样，电泳设定条件80v、30min，随后120v、60min；
[0098]
3)将蛋白湿法转膜到硝酸纤维素膜(nc膜)上，转膜条件为4℃、100v、75min；
[0099]
4)蛋白转膜结束后，用1
×
丽春红溶液将nc膜染色3min，蒸馏水清洗nc膜，可看到清晰的红色条带，说明转膜成功；
[0100]
5)确认蛋白及maker均转上nc膜后，用tbst溶液洗去丽春红染液；
[0101]
6)将两张膜放入小盒中，分别加入20ml封闭液，室温孵育2h；
[0102]
7)去除封闭液，分别加10ml新的封闭液，其中一个以1∶10000比例加入slcnr抗体，另一个以1∶5000比例加入actin抗体，4℃过夜孵育；
[0103]
8)去除封闭液，用tbst溶液洗3次，时间分别为15min，10min，10min；
[0104]
9)再分别加入10ml封闭液，均以1∶10000比例加入二抗，室温孵育1h；
[0105]
10)去除封闭液，用tbst溶液洗3次，时间分别为15min，5min，5min，随后用蒸馏水洗3次，每次5min；
[0106]
11)用滤纸擦干nc膜，涂上发光液，暗处反应3min，显影仪显影，分析蛋白条带。
[0107]
sds-page和western blot相关试剂的配制：
[0108]
1)浓缩胶缓冲液：6.05g tris，使用hcl将ph调至6.8，蒸馏水定容100ml；
[0109]
2)分离胶缓冲液：18.15g tris，使用hcl将ph调至8.8，蒸馏水定容100ml；
[0110]
3)tris-甘氨酸电泳缓冲液：3.03g tris、14.4g甘氨酸、1g sds，蒸馏水定容1l；
[0111]
4)转膜缓冲液：3.03g tris、14.4g甘氨酸，甲醇200ml，蒸馏水定容1l；
[0112]
5)10％过硫酸铵(ap)：称取0.05g过硫酸铵，蒸馏水0.5ml溶解，现用现配；
[0113]
6)10％sds溶液：10g sds，蒸馏水100ml溶解，室温保存；
[0114]
7)4％浓缩胶：蒸馏水1.815ml、浓缩胶缓冲液0.75ml、30％丙烯酰胺0.405ml、10％sds 20μl、10％ap 10μl、temed 1.8μl，混匀；
[0115]
8)10％分离胶：蒸馏水4ml、分离胶胶缓冲液2.5ml、30％丙烯酰胺3.3ml、10％sds 0.1ml、10％ap 50μl、temed 6μl，混匀；
[0116]
9)tris缓冲盐溶液(10
×
tbs)：称取8.8g的nacl，加200ml 1m tris-hcl(ph＝7.5)溶液，蒸馏水定容1000ml；
[0117]
11)tbst缓冲液：取100ml tris缓冲盐溶液(10
×
tbs)，蒸馏水稀释至1
×
，再加入500μl吐温20；
[0118]
12)封闭液：称取2g脱脂奶粉，加入40ml tbst缓冲液，混匀；
[0119]
13)10
×
丽春红：称取2g丽春红、30g三氯乙酸、30g磺基水杨酸，蒸馏水定容100ml。
[0120]
14)5
×
sds-page loading buffer：0.5m tris-hcl(ph＝6.8)1.2ml、10％sds 2ml、0.5％溴酚蓝、2ml甘油1ml、β-巯基乙醇0.5ml、蒸馏水3.3ml。
[0121]
实施例1、获取slcnr基因编辑番茄和slcnr基因过表达番茄材料
[0122]
一、获取slcnr基因编辑番茄材料
[0123]
1.获取slcnr基因编辑番茄材料
[0124]
采用crispr/cas9技术制备slcnr基因编辑番茄，靶点序列如下，划线处为pam。
[0125]
t1：5
’‑
ctctctggtaggaagctagttgg-3’(seq id no.1)；
[0126]
t2：5
’‑
gtcggcacatccttcttgccagg-3’(seq id no.2)；
[0127]
t3：5
’‑
ggtccagctagtcacgtgacgtc-3’(seq id no.3)；
[0128]
t4：5
’‑
ggtcttcgctaagacagtcgtta-3’(seq id no.4)。
[0129]
将编码上述靶点序列对应的sgrna片段采用金门克隆插入pylcrispr/cas9pubi-h载体获得pylcrispr/cas9pubi-h-slcnr。采用农杆菌将pylcrispr/cas9pubi-h-slcnr转化至野生型番茄。在通过测序检测获得slcnr基因编辑植株。具体制备方法参考gao y，zhu n，zhu xf，wu m，jiang c z，grierson d，luo y b，shen w，zhong s l，fu d q，qu g q.diversity and redundancy of the ripening regulatory networks revealed by the fruitencode and the new crispr/cas9 cnr and nor mutants[j].horticulture research，2019，6(1)：10)。
[0130]
上述获得的slcnr基因编辑植株，期间经历无菌播种、外植体获取、预培养、侵染、共培养、抗性筛选、继代培养、生根培养、土壤栽培等过程，收集slcnr基因编辑(crispr/
cas9-slcnr)番茄种子用于后续实验。
[0131]
2.基因验证
[0132]
采用全式金easyplant genomic dna kit试剂盒(ee111)提取基因编辑植株及野生型番茄叶片dna。
[0133]
以叶片dna为模板，参照表1的pcr体系及表2的pcr程序，进行编辑位点的扩增。引物序列为：
[0134]
正向引物：5
’‑
tttatctggcttcctcactc-3’，
[0135]
反向引物：5
’‑
tgttgctgttgtactttcgt-3’。
[0136]
测序引物为cnr-t：5
’‑
ctaacaaatgggaagggaagaga-3’[0137]
取5μl pcr产物进行核酸电泳，得到符合预期大小的600bp左右的pcr产物。将剩余的pcr产物直接送至公司进行测序。
[0138]
表1 pcr体系
[0139][0140]
表2 pcr反应程序
[0141][0142]
将不同编辑株系与野生型进行序列比对，发现各株系均产生纯合基因编辑方式，且编辑方式与其母本相同，slcnr#16、slcnr#22、slcnr#23的具体编辑位置和编辑情况如图1所示，其中划线部分为相应的靶点序列。
[0143]
slcnr#16的编辑情况为slcnr基因的第548-552位缺失5个核苷酸。
[0144]
slcnr#22的编辑情况为slcnr基因的第547-553位缺失7个核苷酸，第580-581位之间插入一个核苷酸t，第695-696位之间插入一个核苷酸g。
[0145]
slcnr#23的编辑情况为slcnr基因的第546-553位缺失8个核苷酸。
[0146]
基因编辑之后，cnr的dna序列突变，导致翻译提前终止，蛋白呈现截短。
[0147]
为了避免后续cas9蛋白的影响，对纯系编辑的每个植株进行了cas9基因的pcr验证，所用引物为正向引物：5
’‑
cgacttcctcgaggccaagg-3’，反向引物：5
’‑
ggtgatggactggtggatgagag-3’。
[0148]
选取cas9-free的植株(slcnr#16(下述也称cr-slcnr#16)、slcnr#22(下述也称cr-slcnr#22)、slcnr#23(下述也称cr-slcnr#23))用于后续研究。
[0149]
3.western blot验证
[0150]
提取本实验中用到的三个基因编辑株系，即slcnr#16、slcnr#22、slcnr#23的成熟果实的果皮总蛋白，利用slcnr特异性抗体，利用western blot进行slcnr蛋白检测。
[0151]
结果如图2所示，以野生型ac为阳性对照的泳道可以检测出大小为15kd左右的蛋白信号(cnr)，但在三个不同基因编辑(#16、#22和#23)株系的成熟果实果皮中均不能检测出slcnr蛋白信号，说明实验中所用编辑果实为slcnr蛋白缺失材料。
[0152]
二、获得slcnr基因过表达番茄材料
[0153]
1.获得slcnr基因过表达番茄材料
[0154]
1)slcnr基因过表达载体的构建
[0155]
将slcnr基因dna全长连接至pcambia1300-35s-gfp载体中，生成pcambia1300-35s-gfp-slcnr过表达载体。
[0156]
2)slcnr基因过表达载体转化
[0157]
将pcambia1300-35s-gfp-slcnr过表达载体转化至农杆菌gv3101中，利用农杆菌介导的叶盘转化法将该载体转化至番茄叶片外植体中，在选择分化培养基上进行筛选，选择具有抗性的愈伤组织进行继代培养；经过芽诱导、芽伸长、生根后移栽到土中，获得转基因t0代植物。抽提以上t0代植物苗期叶片的基因组dna，使用hyg-f/r引物进行pcr扩增和鉴定。上述的引物序列如下：hyg-f：5
′‑
atgttggcgacctcgtattggg-3
′
；hyg-r：5
′‑
cgttatgtttatcggcactt-3
′
。能够扩增520bp的片段的t0代植物即为将pcambia1300-35s-gfp-slcnr过表达载体成功载入的植株，将其命名为t0代阳性植物，即为slcnr基因过表达株系。
[0158]
2.western blot验证
[0159]
提取本实施例中用到的两个slcnr过表达株系，即oe21(下述也称oe-slcnr#21)、oe24(下述也称oe-slcnr#24)的成熟果实的果皮总蛋白，利用slcnr特异性抗体进行slcnr蛋白检测。
[0160]
结果如图3所示，以ac为阴性对照，1和2分别代表over expression-slcnr材料的不同植株，表明基因过表达番茄的成熟果实中，同时含有植株本底表达的slcnr蛋白(cnr)及过表达载体表达的gfp-slcnr蛋白(gfp-cnr)，实验所用植株均为slcnr基因过表达阳性植株。
[0161]
实施例2、不同转基因材料番茄果实的失水速率比较
[0162]
选取野生型ac、cr-cnr两个株系cr-slcnr#16和cr-slcnr#23以及cnr过表达的两个株系oe-slcnr#21和oe-slcnr#24红熟期的果实在室温条件下贮存60天。
[0163]
果实失水率测定方法具体如下。
[0164]
1)分别取大小相近，表皮完整的野生型ac、cr-slcnr#16、cr-slcnr#23、oe-slcnr#21和oe-slcnr#24红熟期的果实6-10个，将融化的石蜡油涂抹至果柄离层处，室温冷却凝固。
[0165]
2)称取果实重量，记作m，果实室温放置于通风干燥条件下，每隔6日称取一次质
量，分别记作m1，m2，
…
mx。
[0166]
3)通过(m-mx)/m计算果实失水率。
[0167]
随着贮藏时间的增长，cnr过表达材料(即oe-slcnr#21和oe-slcnr#24)果实皱缩程度最大，甚至会产生明显的变形，而cr-cnr材料(即cr-slcnr#16和cr-slcnr#23)果实皱缩程度较低，也未发生严重形变。失水率统计结果如图4和表3所示，在常温贮藏60天后，野生型失水率为23.39
±
1.15，cnr敲除果实cr-slcnr#16和cr-slcnr#23失水率分别为20.03
±
0.32和21.60
±
0.26，而cnr过表达果实oe-slcnr#21和oe-slcnr#24的失水率分别为33.80
±
0.85和35.17
±
0.94。角质层厚度较小的oe-slcnr#21和oe-slcnr#24果实失水率高于其他两种材料，而cr-slcnr#16和cr-slcnr#23的失水率明显小于其他材料。
[0168]
表3失水统计
[0169]
贮存天数(天)accr-slcnr#16cr-slcnr#23oe-slcnr#21oe-slcnr#2463.09
±
0.162.52
±
0.052.64
±
0.133.88
±
0.363.47
±
0.51125.36
±
0.234.34
±
0.064.79
±
0.137.38
±
0.366.85
±
0.60187.82
±
0.316.44
±
0.096.90
±
0.1210.54
±
0.3810.26
±
0.662410.22
±
0.428.53
±
0.149.13
±
0.1813.88
±
0.1413.81
±
0.493011.90
±
0.529.91
±
0.1310.61
±
0.1816.24
±
0.0816.29
±
0.463614.79
±
0.6512.26
±
0.1313.21
±
0.0420.43
±
0.2020.60
±
0.364216.58
±
0.8514.30
±
0.1415.45
±
0.0323.76
±
0.1423.92
±
0.684819.29
±
0.9516.37
±
0.1517.59
±
0.0527.41
±
0.0227.98
±
0.826023.39
±
1.1520.03
±
0.3221.60
±
0.2633.80
±
0.8535.17
±
0.94
[0170]
实施例3、不同转基因材料番茄果实角质层形成比较
[0171]
一、不同转基因材料番茄果实的表型差异
[0172]
对野生型ac、cr-cnr两个株系cr-slcnr#16和cr-slcnr#23以及cnr过表达的两个株系oe-slcnr#21和oe-slcnr#24的b+7时期(破色后第7天)的果实进行了图像采集。
[0173]
部分结果如图5所示，在相同照明条件下可以观察到cr-cnr材料(即crispr/cas9-cnr)果实光亮程度相对较差，而cnr过表达材料(即cnr超表达)的光亮程度显著高于其他两种材料，表明不同转基因材料的果实角质层可能厚度不同。
[0174]
二、果实角质层厚度测定
[0175]
采用石蜡切片测量测定野生型ac、cr-cnr两个株系cr-slcnr#16和cr-slcnr#23以及cnr过表达的两个株系oe-slcnr#21和oe-slcnr#24的果实角质层厚度。取番茄生长成熟早期的果实制作切片，共选取了三个时期，分别是绿熟期(mature green)、破色期(break)和破色后第3天(break+3)。
[0176]
具体方法如下。
[0177]
1.果实表皮石蜡切片制备
[0178]
1)将新鲜果实用锋利的刀片沿着果实赤道面横切，取1.0cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小组织块。
[0179]
2)将组织块放入faa固定液固定24h。
[0180]
3)去除faa固定液，用70％酒精浸洗，洗去残留的固定液，60min以后用蒸馏水浸洗，重复一次。
[0181]
4)用不同浓度梯度的酒精进行逐级脱水(60％
→
75％
→
90％
→
100％)，其中浓度梯度在65％
→
90％之间的步骤每次脱水1.5-2h，在100％乙醇中脱水2次，第一次40min，第二次20min。
[0182]
5)通过调整溶液中不同组分的比例使材料逐级透明，成分比率为如表4。
[0183]
表4溶液成分比例
[0184][0185]
6)将材料先放入低石蜡中，放置于30℃恒温培养箱中过夜浸蜡；然后将其放入由比例为1∶9的蜂蜡和低熔点石蜡组成的混合蜡中，置于60℃恒温箱中浸蜡6h，3h时换一次混合石蜡。
[0186]
7)浸蜡结束后，立即用镊子转移至装有液态混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却，已备切片使用。
[0187]
8)根据番茄材料在蜡块中的位置和方向，修整蜡块使其石蜡块切面与番茄组织块切面平行，用切片机进行切片，切片厚度为10μm。
[0188]
9)在洁净的载玻片上均匀涂上少许羊毛脂凡士林混合剂(v∶v＝1∶1)，将蜡带放在45℃-50℃的水面上，待蜡带展平后捞起，放入35℃恒温箱中烘干。
[0189]
10)用二甲苯脱蜡10-15min，用油红o染色液进行染色。
[0190]
11)擦去多余二甲苯，滴上中性树胶，盖上玻片，树胶用量适当，避免产生气泡，做上标记。
[0191]
2.果实角质层厚度测量
[0192]
1)将制作完成的石蜡切片置于光学显微镜下观察。
[0193]
2)用测微尺进行校准，量取比例尺，用imageview软件进行图像采集，调整白平衡。
[0194]
3)使用imageview软件自带的测量功能量取两个表皮细胞最薄处和表皮细胞连接点最厚处的厚度，记作l1(即表皮细胞(epidermal cells)上方较薄处，一般位于表皮细胞中央)和l2(即表皮细胞背斜挂钩(ap)较厚处，一般位于表皮细胞连接处)。
[0195]
4)同一材料同一时期量取多个l1和l2，计算平均值作为最终的数据。
[0196]
绿熟期番茄果实的角质层厚度测定结果如图6和表5所示，其中，a为石蜡切片图片，b为较薄区域l1厚度测定统计，c为较厚区域l2厚度测定统计，sd为皮下角质层累积，ap为背斜挂钩；*代表该组与ac相比，有统计上的显著差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n≥12，黑色线段代表20μm。对比绿熟期不同材料果实的角质层，可直观地看到cr-cnr材料的角质层厚度大于野生型ac材料，而cnr过表达材料的角质层厚度明显减少，在oe-slcnr#21材料中角质层由于较薄表面会随着表皮细胞的形态呈不规则的起伏。l1厚度差异显著性较为符合直接观察结果，oe-slcnr#21的角质层可能是因其在胞外沉积得较为均匀，导致l1的厚度与野生型ac差异不明显。而oe-slcnr#24中l2的厚度与野生型ac差异不明显的可能原因是其角质结构较为疏松，表皮层下蜡质沉积较多，特别是在两个细胞交接处的
背斜挂钩中，导致测量的厚度偏大。通过观察细胞形态可知，cr-slcnr#16的表皮细胞切面呈圆锥形，而其余材料的表皮细胞切面多呈扁平状，野生型ac材料和cr-cnr材料的表皮细胞空隙处大小明显小于cnr过表达材料，但结合表皮细胞的胞间距差异，推测大小和形状差异很可能是由于角质层累积厚度不同导致的结果。
[0197]
破色期番茄果实的角质层厚度测定结果如图7和表6所示，其中，a为石蜡切片图片，b为较薄区域l1厚度测定统计，c为较厚区域l2厚度测定统计，sd为皮下角质层累积，ap为背斜挂钩；*代表该组与ac相比，有统计上的显著差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n≥12，黑色线段代表20μm。观察破色期的角质层可知，油红染色的角质层在cr-cnr的两个株系cr-slcnr#16和cr-slcnr#23厚度显著大于野生型ac，过表达的oe-slcnr#21和oe-slcnr#24角质层厚度显著低于野生型。进一步量化角质层厚度，各个株系都呈现显著差异性。
[0198]
破色后第3天(b+3)番茄果实的角质层厚度测定结果如图8和表7所示，其中，a为石蜡切片图片，b为较薄区域l1厚度测定统计，c为较厚区域l2厚度测定统计，sd为皮下角质层累积，ap为背斜挂钩；*代表该组与ac相比，有统计上的显著差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n≥12，黑色线段代表20μm。结果表明，在b+3时期不同材料之间的l1和l2都呈现显著性差异，即cr-slcnr#16和cr-slcnr#23厚度显著大于野生型ac，过表达的oe-slcnr#21和oe-slcnr#24角质层厚度显著低于野生型。
[0199]
表5绿熟期番茄果实的角质层厚度统计
[0200][0201]
表6破色期番茄果实的角质层厚度统计
[0202]
cnr两个株系cr-slcnr#16和cr-slcnr#23以及cnr过表达的两个株系oe-slcnr#21和oe-slcnr#24的三个果实同时提取整果蜡质，混合浓缩，进行气相色谱-质谱联用检测。
[0209]
1)用游标卡尺测量果实三个垂直维度的直径，读数至小数点后三位。计算平均值，按球体表面积计算公式s＝4π(d/2)2计算果实表面积。
[0210]
2)在烧杯中加入100ml氯仿，将整果浸入氯仿，静止1min，取出果实。同一生物学重复的果实重复上述步骤。
[0211]
3)加入100μg正二十四碳烷作为内标，将浸提过的氯仿倒入烧瓶，5ml氯仿清洗烧杯2次，转入烧瓶，旋转蒸发仪50℃浓缩至10ml左右。
[0212]
4)置于氮吹仪下，氮气吹扫，干燥浓缩至1.5ml，转入进样瓶中继续吹扫至氯仿全部蒸发。
[0213]
5)加入200μl bstfa-tmcs(99∶1)试剂，100℃水浴或金属浴衍生化20min，氮气吹扫，除去有机试剂。
[0214]
6)用1ml正己烷(色谱纯)溶解样品，经0.45μm有机滤膜过滤，可保存于-20℃。
[0215]
7)使用气相色谱-质谱联用测定蜡质的单体成分(型号为7890a-5975c，agilent)，进样瓶按顺序放置于自动进样器上，以流速为1ml/min氦气作为载气测定，四级杆温度150℃，离子源温度230℃，升温程序如表8。
[0216]
表8升温程序
[0217][0218]
8)蜡质成分定性结合nist11数据库的峰图和相较于内标出峰时间间隔，定量分析基于待测物质检测峰面积和内标检测峰面积的比值，最终结果比上果实表面积即为单位面积的物质负荷量。
[0219]
结果如表9和表10，共检测鉴定出21种蜡质成分，其中长链烷烃类有6种，分别是碳链长度为27到32的正构烷烃；脂肪酸类有7种，分别是碳链长度为16-24的饱和脂肪酸再加上不饱和的油酸和亚油酸；醇类有5种，分别是正十八醇、正二十二醇、正二十四醇、正二十六醇和正二十八醇；三萜类有3种，分别是α-香树素、β-香树素、δ-香树素。
[0220]
计算mg期不同材料的蜡质成分含量，将各组分与野生型ac的组分进行比较，在oe-slcnr#21中二十九烷含量有显著下降，三种三萜类物质的含量有极显著下降，其余组分含量相近，而在oe-slcnr#24中除了二十四烷酸、二十六烷醇和二十八烷醇有显著增加外，其余组分含量无显著差异。cr-slcnr#16中正二十七烷和二十四烷酸含量略有上升，而二十九烷含量极显著上升，三十二烷含量有显著下降，其余组分含量无显著差异；在cr-slcnr#23中正二十七烷、正二十八烷和二十四烷酸含量略有上升，α-香树素含量略有下降，而二十九烷烃含量极显著上升，其余组分含量无显著差异。
[0221]
计算b+7时期不同材料的蜡质成分含量，将各组分与野生型ac组分进行比较，在
oe-slcnr#21中二十七烷、三萜类物质含量略有下降，不同饱和度的十八碳脂肪酸之间存在差异，二十九烷含量有显著下降，其余组分含量相近，而在oe-slcnr#24中二十七烷、二十四烷酸和二十八烷醇含量略有下降，油酸含量有显著上升，其余组分含量无显著差异。cr-cnr材料中均未检测到二十七烷的存在，二十九烷含量上升，不饱和脂肪酸的含量也有上升，另外正十八醇、正二十二醇、正二十四醇都有显著的上升。而在cr-slcnr#23中，三萜类物质含量也略有下降。
[0222]
综上可知，oe-slcnr#21果实的总蜡负荷量是显著降低的，cr-slcnr#16和cr-slcnr#23的总蜡负荷量都有不同程度的上升，而oe-slcnr#24果实的总蜡负荷量虽然与ac接近，但组成成分存在差异。对比两个时期的蜡质成分差异随着成熟进程的发展，果实蜡质总量呈减少的趋势，且醇类物质和长链烷烃类蜡质组分的含量变化较为明显。
[0223]
表9 mg期不同番茄材料果实的蜡质成分鉴定及含量
[0224][0225][0226]
表10 b+7期不同番茄材料果实的蜡质成分鉴定及含量
[0227][0228][0229]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。