一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法与流程

1.本发明涉及技术胚胎培养技术领域，尤其涉及一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法。


背景技术：

2.体外受精(invitrofertilization)或(externalfertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为ivf。由于它与胚胎移植技术(et)密不可分，又简称为ivf-et。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术
3.卵母细胞体外成熟培养是体外受精、体细胞核移植、动物胚胎体外生产和转基因克隆等胚胎工程技术的基础和关键环节。卵母细胞体外成熟不仅受到卵巢周期、动物品种、卵泡大小、激素、血清等多种因素影响，而且与卵母细胞体外成熟的程序和方法及培养液成分密切相关，特别是血清会导致体外生产胚胎的巨大胎儿综合征。现有的卵母细胞体外培养方法大多采用人工血清进行卵母细胞培养，容易出现巨胎症，对后续的养殖十分不利。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法，旨在解决现有卵母细胞体外培养方法容易出现巨胎症的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法，包括：
6.按比例配置基础培养液和添加剂获得卵母细胞培养液；
7.移植卵母细胞到所述卵母细胞培养液中清洗一次，获得无菌卵母细胞；
8.将所述无菌卵母细胞移植到新的卵母细胞培养液，获得初步培养皿；
9.将所述初步培养皿放入培养箱进行培育，获得成熟卵母细胞。
10.其中，所述基础培养液为成熟卵泡液，提取自动物生殖腔。
11.其中，所述添加剂的成分包括无脂肪酸bsa-6mg/ml、hmg-0.075iu/ml、17β-雌二醇-1μg/ml、egf-60ng/ml、l-cysteine-0.57mm、bfgf-40ng/ml、glutamax(100x)-1.6μl/ml、叶酸50μm、胆酸-2μg/ml、cxcl12-50ng/ml。
12.其中，所述清洗卵母细胞的具体步骤包括：
13.将卵母细胞置入所述卵母细胞培养液，静置1-2小时；
14.向所述卵母细胞培养液中加入氯化钾及氯化钠杀菌液进行消毒；
15.取出所述卵母细胞，获得无菌卵母细胞。
16.其中，所述将所述初步培养皿放入培养箱进行培育的具体步骤包括：
17.将所述初步培养皿置入所述培养箱常温静置1-3小时；
18.将所述培养箱调节至合适温度及湿度并开始培养；
19.维持所述培养箱温度及二氧化碳饱和湿度持续培养44小时获得成熟卵母细胞。
20.其中，所述合适温度及湿度为38.5℃以及5％二氧化碳饱和湿度。
21.本发明的一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法，采用无血清体外培养的方法，使用无血清的基础培养液，以及包括无脂肪酸bsa、hmg、17β-雌二醇、egf、l-cysteine、bfgf、glutamax(100x)、叶酸、胆酸、cxcl在内的添加剂组成卵母细胞培养液，在不使用血清的情况下培养卵母细胞，提高了卵母细胞的成熟率，避免了巨胎症，并有效提高体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的早期胚胎发育率。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1是本发明的一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法的流程图。
24.图2是清洗卵母细胞的具体步骤流程图。
25.图3是将初步培养皿放入培养箱进行培育的具体步骤流程图。
26.图4是配制卵母细胞培养液的具体步骤流程图。
27.图5是获取卵母细胞的具体步骤流程图。
具体实施方式
28.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
29.请参阅，本发明提供一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法，包括：
30.s101按比例配置基础培养液和添加剂获得一号卵母细胞培养液和二号卵母细胞培养液；
31.所述一号卵母细胞培养液用于卵母细胞的清洗，所述二号卵母细胞培养液用于卵母细胞培养，二者成分相同，但处理操作不同，采用不含血清的基础培养液配置所述卵母细胞液，能够提高卵母细胞的成熟率，避免后续胚胎培养的发育问题。
32.s102移植卵母细胞到所述一号卵母细胞培养液中清洗一次，获得无菌卵母细胞；
33.清洗一次是为了起到消毒杀菌的作用，同时使卵母细胞对所述卵母细胞培养液产生亲和，避免排斥反应。
34.s103将所述无菌卵母细胞移植到所述二号卵母细胞培养液，获得初步培养皿；
35.所述初步培养皿是卵母细胞在体外发育的第一步，对卵母细胞进行的初步培养。
36.s104将所述初步培养皿放入培养箱进行培育，获得成熟卵母细胞。
37.其中，所述基础培养液为成熟卵泡液，提取自动物生殖腔。
38.其中，所述添加剂的成分包括无脂肪酸bsa-6mg/ml、hmg-0.075iu/ml、17β-雌二醇-1μg/ml、egf-60ng/ml、l-cysteine-0.57mm、bfgf-40ng/ml、glutamax(100x)-1.6μl/ml、叶酸50μm、胆酸-2μg/ml、cxcl12-50ng/ml。
39.其中，所述清洗卵母细胞的具体步骤包括：
40.s201将卵母细胞置入所述一号卵母细胞培养液，静置1-2小时；
41.s202向所述卵母细胞培养液中加入氯化钾及氯化钠杀菌液进行消毒；
42.s203取出所述卵母细胞，获得无菌卵母细胞。
43.其中，所述将所述初步培养皿放入培养箱进行培育的具体步骤包括：
44.s401将所述初步培养皿置入所述培养箱常温静置1-3小时；
45.s402将所述培养箱调节至预设温度及湿度并开始培养；
46.s403维持所述培养箱温度及二氧化碳饱和湿度持续培养44小时获得成熟卵母细胞。
47.其中，所述预设温度及湿度为38.5℃以及5％二氧化碳饱和湿度。
48.其中，所述配制卵母细胞培养液的具体步骤包括：
49.s111提取成熟卵泡液获得基础培养液；
50.s112无菌环境下向所述基础培养液中依次加入添加剂得到常温培养液；
51.s113将所述常温培养液放入恒温箱内加热至动物体温并保存备用得到卵母细胞培养液。
52.其中，所述获取卵母细胞的具体步骤包括：
53.s121从动物体取出卵巢并置于含抗生素的生理盐水中；
54.s122用针头注射器取出卵泡；
55.s123在显微镜的辅助下用捡卵针捡取卵母细胞。
56.本发明的一种高质量培养卵母细胞的体外培养方法，采用无血清体外培养的方法，使用无血清的基础培养液，以及包括无脂肪酸bsa、hmg、17β-雌二醇、egf、l-cysteine、bfgf、glutamax(100x)、叶酸、胆酸、cxcl在内的添加剂组成卵母细胞培养液，在不使用血清的情况下培养牛卵母细胞，提高了牛卵母细胞的成熟率，避免了巨胎症，并有效提高体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的早期胚胎发育率。
57.以下是本发明的实施例：
58.处理组：将选择的cocs在无血清的牛卵母细胞体外成熟培养液(实施例1的体外成熟培养液，作为处理组)中洗两遍，然后移入装有3ml实施例1的体外成熟培养液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养18～22h。将培养成
59.熟的cocs用pbs液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无ca
2+
、mg
2+
，pbs中消化1～2min，并用1000ml移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在pbs中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。
60.对照组1：将选择的cocs在牛卵母细胞有血清体外成熟培养液(对比例1的体外成熟培养液，作为对照组1)中洗两遍，然后移入装有3ml的对比例1的体外成熟培养液的3cm平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养18～22h。将培养
61.成熟的cocs用pbs液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无ca
2+
、mg
2+
pbs中消化1～2min，并用1000ml移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在pbs中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。
62.对照组2：将选择的cocs在牛卵母细胞无血清体外成熟培养液(对比例2的体外成熟培养液，作为对照组2)中洗两遍，然后移入装有3ml的对比例2的体外成熟培养液的3cm平
皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％co2、饱和湿度条件下培养18～22h。将培养成熟的cocs用pbs液清洗3次，放入含0.1％透明质酸酶的无ca
2+
、mg
2+
pbs中消化1～2min，并用1000ml移液枪反复吹打，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在pbs中洗3次，然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞，挑选有极体的卵母细胞待用。
63.以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。