1.本发明涉及生物
技术领域：
：。更具体地，本发明涉及一种可用于预测dmmr/msi-h胃肠癌患者对免疫检查点321制剂疗法的原发耐药的生物学标志物及其用途和使用方法。
背景技术：
：：2.近年来，免疫检查点抑制剂疗法(immune-checkpointinhibitor，ici，包括抗pd-1/pd-l1/ctla-4抑制剂)已成为肿瘤治疗中广泛应用的治疗方案。2017年，美国fda批准dmmr(dnamismatchrepair-deficient，错配修复功能缺陷)/msi-h(microsatelliteinstability-high，高度微卫星不稳定)作为泛实体瘤患者进行免疫治疗的生物标志物。胃肠肿瘤，包括胃癌和结直肠癌，是dmmr/msi-h型泛实体瘤中最常见的肿瘤之一。ici对晚期或转移性dmmr/msi-h胃肠肿瘤的临床疗效已在多项ii期和iii期研究中得到充分验证，客观缓解率(objectiveresponserate,orr)在33％至57.1％不等，即其中仍有一半左右甚至更多患者会发生免疫治疗原发耐药(不响应或快速进展)，不能从中获益。但是，临床上尚缺乏可靠的技术手段来甄别dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者中原发耐药的人群。因此，开发合适的生物标志物，精准筛选dmmr/msi-h型胃肠肿瘤免疫治疗耐药人群，减少患者不必要的治疗副作用和经济支出，是临床医生迫切需要解决的问题。3.目前针对dmmr/msi-h型胃肠肿瘤免疫治疗耐药人群筛选生物标志物的研究报道较少。国外目前有四篇研究分别纳入了45例dmmr/msi-h型胃肠道肿瘤患者、19例dmmr/msi-h型胃癌患者、22例msi-h型结直肠癌患者和29例高肿瘤突变负荷型(tumormutationalburden-high；tmb-h)结直肠癌患者进行预测免疫治疗效果生物标志物的分析，均有分析tmb在区分免疫治疗效果中的作用，但研究结果并不一致。4.尽管tmb已在2020年作为泛实体瘤患者进行免疫治疗的生物标志物获得美国fda批准，但其批准引起颇多争议，tmb检测尚缺乏标准方法，不同检测机构的产品和算法各异，tmb阈值也无统一定论。针对dmmr/msi-h型胃肠肿瘤，有限的预测免疫治疗疗效的生物标志物研究中，有研究表明tmb低水平是免疫治疗效果差的生物标志物，也有研究显示tmb水平与免疫治疗效果无相关性，其中tmb检测平台和计算方法不一样，tmb-h的阈值为10～41不等。5.因此，本领域急需一种可靠且方便应用于临床的预测dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的原发耐药性的生物标志物。技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种能够预测dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的原发耐药性的生物标志物，从而能够可靠且方便应用于临床。7.在第一方面，本发明提供akt1基因和/或cdh1基因、它们的mrna、cdna、或蛋白或检测试剂的用途，用于制备预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的检测试剂或检测试剂盒；或者预测肿瘤患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性的测试剂或检测试剂盒。8.在具体的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。9.在具体的实施方式中，所述肿瘤患者为dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者，包括dmmr/msi-h型胃癌或肠癌患者。10.在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。11.在优选的实施方式中，所述预测是通过检测akt1突变和/或cdh1突变的存在进行预测。12.在优选的实施方式中，akt1基因突变和/或cdh1基因突变的存在是胃肠肿瘤患者对ici耐药的指征；akt1突变和/或cdh1突变的存在是肿瘤患者对靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性的指征。13.在优选的实施方式中，所述突变为点突变，包括但不限于单核苷酸多态性，碱基取代、插入、缺失、沉默突变、错义突变。14.在优选的实施方式中，所述免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(pd-1)、程序性死亡配体1(pd-l1)、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla-4)；也包括一些新发现的免疫检查点，例如淋巴细胞活化基因3(lag3)、t-细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(tim-3)、t细胞活化的v结构域免疫球蛋白抑制剂(vista)、腺苷a2a受体(a2ar)唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7/9等；优选pd-1、或pd-l1、或ctla-4。15.在第二方面，本发明提供一种用于预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的试剂盒，所述试剂盒中包括检测akt1基因突变和/或cdh1基因突变、它们的mrna、cdna、或蛋白的试剂。16.在具体的实施方式中，所述试剂盒还包括指导如何利用检测akt1基因突变和/或cdh1基因突变的试剂来预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的使用说明书。17.在具体的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。18.在具体的实施方式中，所述肿瘤患者为dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者，包括dmmr/msi-h型胃癌或肠癌患者。19.在优选的实施方式中，所述检测剂在核酸水平进行；优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及hrm法；20.在优选的实施方式中，所述检测剂在蛋白水平进行；优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。21.在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。22.在优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括野生型akt1基因和/或cdh1基因作为对照。23.在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。24.在第三方面，本发明提供akt1基因和cdh1基因、它们的mrna、cdna、或蛋白或检测试剂的组合。25.在优选的实施方式中，所述组合用于预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性或对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性，或用于制备预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的检测试剂或检测试剂盒，或用于制备预测肿瘤患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性的测试剂或检测试剂盒。26.在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。27.在第四方面，本发明提供一种预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性的模型构建方法，包括以下步骤：28.1)筛选能够预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药的基因；29.2)构建并评估基因突变联合模型预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药；30.3)验证突变联合模型在肿瘤患者中对免疫检查点抑制剂疗法耐药的预测价值；和31.4)探究突变联合模型的预后价值。32.在优选的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。33.在优选的实施方式中，所述肿瘤患者为dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者，包括dmmr/msi-h型胃癌或肠癌患者。34.在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。35.在第五方面，本发明提供一种预测或筛查肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法耐药性，或者预测所述患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性的方法：36.1)评估所述患者的akt1基因突变；37.2)评估所述患者的cdh1基因突变；38.3)基于1)和2)评估结果预测所述患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性；或者预测所述患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性。39.在优选的实施方式中，所述肿瘤是胃肠肿瘤，包括但不限于胃、小肠、结肠、直肠的肿瘤。40.在优选的实施方式中，所述肿瘤患者为dmmr/msi-h型胃肠肿瘤患者，包括dmmr/msi-h型胃癌或肠癌患者。41.在优选的实施方式中，所述耐药性是原发耐药性。42.在优选的实施方式中，所述方法的具体步骤如下：43.1)从样品中提取dna，所述样品选自所述dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者的血液、血清、血浆、胸水、腹水、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种；44.2)加入检测剂，靶向测序包含akt1和cdh1两个基因的panel；45.3)基因组改变分析：使用burrows-wheeleraligner(v0.7.12)将原始测序序列与人类基因组参考序列(hg19)进行比对；以测序样本的配对白细胞dna作为对照，去除胚系变异，获得样本体细胞变异；内容包括单碱基替换(snv)、短片段插入缺失(indel)、基因拷贝数变异(cnv)，基因重排、tmb、msi；通过标准判断所鉴别的突变是否为真；msi计算：选择已筛选出的覆盖范围排名前100的微卫星位点进行msi(microsatelliteinstability,微卫星不稳定)测定；46.4)预测所述患者对使用ici的耐药性；或者预测所述患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性。47.在第五方面，本发明提供akt1基因和/或cdh1基因、它们的mrna、cdna、或蛋白或检测试剂，用于预测肿瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法的耐药性；或者预测肿瘤患者对使用靶向akt1和/或cdh1基因和/或相关信号通路抑制剂的靶向疗法联合或不联合ici的敏感性。48.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明49.图1显示在dmmr/msi-h胃肠道肿瘤中，识别与ici原发耐药相关的基因突变；(a)单变量cox比例风险回归模型识别icis治疗后与pfs相关的特定基因突变。(b)特定基因-突变和野生型患者在ici敏感组和耐药组中的百分比。(c和d)akt1(c)或cdh1突变(d)与野生型患者pfs比较的kaplan-meier曲线。icis：免疫检查点抑制剂；dmmr：dna错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；gi：胃肠；pfs：无进展生存；wt：野生型：mut：突变体。50.图2显示了发现队列中akt1和cdh1基因的突变位点；51.图3显示了iopred在dmmr/msi-h胃肠肿瘤中的模型构建及性能评价；其中(a)多变量cox回归分析表明，akt1和cdh1能够独立预测接受ici治疗的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者的pfs。akt1和cdh1被整合为免疫肿瘤治疗预测因子(iopred)，以识别不能从ici获益的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者。(b-d)kaplan-meier曲线比较患有dmmr/msi-hgi胃肠肿瘤(b)、胃癌(c)或肠癌(d)的iopred-mut和wt患者的pfs。(e)在患有dmmr/msi-h胃肠肿瘤、胃癌或肠癌的ici敏感和耐药患者中，iopred-mut和wt患者的百分比。(f)采用roc曲线和auc计算评价iopred对dmmr/msi-h胃肠肿瘤原发耐药的预测准确性。在胃肠道肿瘤数据集中，iopred的auc值为0.751(95％ci为0.639-0.862)，特异性为98％，敏感性为52％。dmmr：dna错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；ici：免疫检查点抑制剂；pfs：无进展生存；wt：野生型；mut：突变；gi：胃肠；ic：肠癌；gc：胃癌；roc：受试者特征；auc：曲线下面积。52.图4显示了验证队列中akt1和cdh1基因的突变位点；53.图5显示了icis对dmmr/msi-h胃肠道肿瘤的原发耐药预测价值的验证；其中(a和b)在22例接受ici治疗的dmmr/msi-h胃肠道肿瘤患者中，iopred-mut和wt患者的pfs(a)和os(b)的kaplan-meier曲线比较。(c)单因素cox回归分析显示，只有iopred与pfs显著相关。(d)在验证队列中，iopred用于原发耐药预测的auc值为0.658(95％ci0.48-0.84)，特异性为91.67％，敏感性为40％。dna错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；ici：免疫检查点抑制剂；pfs：无进展生存；os：总生存；wt：野生型；mut：突变；gi：胃肠；auc：曲线下面积；54.图6显示了tcga队列中akt1/cdh1/iopred突变或正常表型msi-h胃肠肿瘤患者生存分析；其中(a-f)kaplan-meier曲线比较未接受ici治疗的msi-htcga-stad和tcga-crc队列中akt1/cdh1/iopred-mut和wt患者的pfs(a-c)和os(d-f)。msi-h：高度微卫星不稳定；gi：胃肠；ici：免疫检查点抑制剂；pfs：无进展生存期；os：总生存期；wt：野生型；mut：突变型；tcga：癌症基因组图谱；stad：胃腺癌；crc：结直肠癌。具体实施方式55.发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现akt1基因和cdh1基因独立预测pfs和原发耐药。因此，akt1和cdh1突变联合可以作为免疫肿瘤治疗预测因子(animmuno-oncologytherapypredictor,iopred)来识别对免疫检查点抑制剂(ici)耐药的dmmr/msi-h胃肠癌患者。在此基础上完成了本发明。56.术语定义57.原发性耐药58.本文所用的术语“原发性耐药”或“原发耐药”是指开始免疫治疗后，首次肿瘤评估时为肿瘤进展(diseaseprogression，pd)、3个月内死亡引起的不可评估(notestimable，ne)或无进展生存(progression-freesurvival，pfs)《6个月的稳定疾病(stabledisease，sd)的患者。59.akt1基因、cdh1基因和相关信号通路抑制剂60.akt1(ncbi登录号：nc_000014.9)作为akt一种最常见的亚型，通过控制细胞内pi3ks的水平成为pi3k/akt/mtor信号通路的活性中心。pi3k/akt/mtor信号转导通路调节肿瘤细胞存活、增殖、分化、凋亡等多种过程，从而对肿瘤的发生、发展发挥关键性作用。该通路的过度活化广泛存在于各类癌种，包括乳腺癌、肺癌、头颈部肿瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、结直肠癌等。此外，越来越多的证据表明akt1在调节免疫细胞发育中发挥着关键作用，包括t细胞、b细胞、树突状细胞和巨噬细胞，它的突变通过创造免疫抑制条件和逃避免疫识别贡献于癌症的发生和发展。61.cdh1(ncbi登录号：nc_000016.10)作为广泛报道的肿瘤抑制基因，编码上皮细胞钙粘蛋白(e-cadherin)，参与调节上皮细胞间的粘附、迁移和增殖，其功能缺失突变与肿瘤侵袭和转移的增加相关。近几年，也有一些研究报道了cdh1表达与免疫疗效的相关性，例如hugo等人报道了在接受抗pd-1治疗的黑色素瘤患者中，应答的患者相比于非应答的患者具有较高的cdh1表达。此外，在kwon等人进行的派姆单抗治疗晚期msi-h型胃癌患者的ii期试验中，19例患者中有5例有cdh1突变，他们均对抗pd-1治疗无反应。62.突变63.本文所用的“突变”或“基因突变”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。64.在具体的实施方式中，所述突变可以是点突变，包括但不限于单核苷酸多态性、碱基取代、插入、缺失、沉默突变、错义突变，等等。65.免疫检查点抑制剂(ici)66.本文所用的“免疫检查点(immunecheeckpoint)”具有本领域技术人员常规理解的含义，是指在免疫系统中起抑制作用的调节分子，其起到维持自身耐受、防止自身免疫反应、以及通过控制免疫应答的时间和强度而使组织损伤最小化等作用。67.免疫检查点分子表达于免疫细胞上，将抑制免疫细胞功能，使机体无法产生有效3.0荧光仪和labchipgxtouchht分析仪测定。文库浓度及片段均符合预期后按照要求进行上机测序。96.库检合格后，把不同文库按照目标下机数据量的需求pooling后使用illuminanovaseq6000进行pe100bp的测序。在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dntp、dna聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dntp就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。97.本发明靶向测序包含akt1和cdh1两个基因的任何panel，包括但不限于：381、733或189个基因。可检测单碱基替换(snv)、短片段插入缺失(indel)、基因拷贝数变异(cnv)，基因重排、tmb、msi，可为患者提供靶向、化疗、免疫治疗及遗传风险等相关的检测结果。98.2.基因组改变分析99.本发明检测基因组改变的内容，包括snv、indel、cnv和基因重排。使用burrows-wheeleraligner(v0.7.12)将原始测序序列与人类基因组参考序列(hg19)进行比对。以测序样本的配对白细胞dna作为对照，去除胚系变异，获得样本体细胞变异。100.判断所鉴别的突变是否为真101.msi计算：选择已筛选出的覆盖范围排名前100的微卫星位点进行msi(microsatelliteinstability,微卫星不稳定)测定。对于每个样本，计算微卫星不稳定位点的百分比，认为大于0.4的百分比为高度微卫星不稳定(microsatelliteinstability-high,msi-h)，否则为微卫星稳定(microsatellitestability,mss)。102.在优选的实施方式中，所述试剂盒还包括其他基因突变的检测剂。103.鉴于akt1和cdh1基因均为能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和蛋白水平上，本领域技术人员可以从转录和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生基因突变，这些都可以应用于本发明。104.因此，在具体的实施方式中，所述检测剂可以在核酸水平进行检测，即检测akt1和cdh1基因，或者它们的mrna、cdna、蛋白。优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及hrm法。在另一具体的实施方式中，所述检测剂还可以在蛋白水平进行检测，即检测akt1和cdh1基因的编码蛋白。优选地，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。105.所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。106.所述样品选自所述dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者的血液、血清、血浆、胸水、腹水、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。107.本发明还提供一种预测或筛查dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者对ici原发耐药预测试剂盒，所述试剂盒中包含用于akt1和cdh1突变检测的试剂。优选地，所述试剂盒中还包括其他基因突变检测的试剂。108.本发明涉及的样本可以是肿瘤组织和外周血；或者，样本可以是：血清、血浆、脑脊液、胸腹水、肿瘤组织裂解液、细胞培养上清液、精液、尿液以及唾液样品中的至少一种。109.本发明的优点：110.1、尽管fda已批准ici用于dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者的治疗，但仍有约50％的患者不能从ici治疗中长期获益，目前尚无明确的生物标志物来区分这些对ici原发耐药的患者。本发明筛选出iopred基因突变作为预测dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者中对ici原发耐药的生物标志物；在本发明通过iopred基因突变，能够准确预测耐药人群，避免盲目用药，提高ici治疗的经济性能。111.2、本发明中采用的iopred基因突变可通过液体活检(本研究中使用的是血液)获取，克服了晚期患者组织难获取的问题，扩大了其在临床实践中的运用范围。112.3、本发明方法有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，适于推广应用。113.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅以阐释为目的而非限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。114.以下实施例中未注明具体条件的实验方法可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。115.实施例116.本发明具体采用如下方法学进行研究117.样本材料：118.发现队列：65个ici治疗前的dmmr/msi-h胃肠肿瘤组织样本及对照白细胞(wbc)样本(所有患者ngs鉴定均为msi-h)，其中50例肠癌(intestinalcancer,ic)和15例胃癌(gastriccancer，gc)患者，38例具有一致的免疫组化(immunohistochemistry，ihc)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)鉴定的dmmr和msi-h表型，26例为ihc鉴定的dmmr，没有pcr数据，1例为pcr-msi-h，没有ihc数据。表1总结了患者的基线特征。研究通过靶向捕获ngs测序分析，具体涉及包含381或733个癌症相关基因的组合。119.验证队列：22个ici治疗前的dmmr/msi-h胃肠肿瘤血液样本，其中16个ic，6个gc患者，所有病例均经ihc诊断为dmmr，其中15例经肿瘤组织pcr鉴定为msi-h，其余7例无pcr数据。表3总结了患者的基线特征。研究通过靶向捕获ngs测序分析，具体涉及包含189个癌症相关基因的组合。120.实施例1.发现队列dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者表征121.表1.发现队列中dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者基本特征122.[0123][0124]dmmr：错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；gi：胃肠；ici：免疫检查点抑制物；ecogps：东方合作肿瘤学小组表现状态；ic：肠癌；gc：胃癌；pd-1：程序性死亡1；pd-l1：程序性死亡配体1；her2：人表皮生长因子受体2；ctla4：细胞毒性t淋巴细胞抗原-4；tps：肿瘤比例评分；ls：林奇综合征。[0125]大多数患者(62/65，95.38％)有良好的身体状况(ecog0或1)，并既往接受过至少一次全身性治疗(54/65，83.08％)。1例her2阳性(1/53，1.89％)和8例(8/49，16.33％)pd-l1tps≥1％的患者。14例(21.54％)诊断为林奇综合征(lynchsyndrome，ls)。57例(57/65，87.69％)接受抗pd-1/l1单药治疗，8例(8/65，12.31％)接受抗pd-1/l1联合抗ctla-4治疗。中位随访时间20.20个月，免疫治疗的客观反应率(objectiveresponserate，orr)为53.85％，其中部分缓解(partialresponse，pr)的29例，完全缓解的(completeresponse，cr)6例。中位pfs(mpfs)为10.43个月，中位总生存(mos)为20.20个月。原发耐药定义为开始免疫治疗后，首次肿瘤评估时为肿瘤进展(diseaseprogression，pd)、3个月内死亡引起的不可评估(notestimable，ne)或无进展生存(progression-freesurvival，pfs)《6个月的稳定疾病(stabledisease，sd)的患者。根据原发性耐药的定义，65例患者中，21例(32.31％)属于ici-耐药组，44例(67.69％)为ici-敏感组。两组间的人口统计学和基线特征在总体上是平衡的。[0126]实施例2.筛选能够预测dmmr/msi-h胃肠癌患者免疫治疗耐药的基因[0127]通过三步法筛选原发耐药预测基因：[0128]第一步：通过单变量cox比例风险回归模型筛选与pfs显著相关的基因组突变(p《0.05)；共筛选出三个基因akt1、cdh1和cul3(p＝0.013forakt1；p＝0.046forcul3；和p＝0.046forcdh1)(图1a)。[0129]第二步：比较第一步筛选的三个基因在ici-耐药组和ici-敏感组突变频率的差异，识别有显著突变频率差异的基因(p《0.05)，发现akt1和cdh1在耐药组和敏感组突变频率有显著差异(p＝0.002forakt1；p＝0.005forcdh1)，cul3在两组的突变频率无差异(p＝0.080)，(图1b)。[0130]第三步：基因突变需要满足突变频率≥5％的标准，以保证两组之间的比例差异不是由随机发生的突变引起的。akt1和cdh1的突变频率均≥5％。进一步对akt1和cdh1基因突变位点进行分析，发现基因变异位点散布于akt1和cdh1基因全长(图2)。[0131]通过以上三步连续筛选，识别akt1和cdh1这两个基因作为生物标志物来预测预测dmmr/msi-h胃肠癌患者对免疫治疗耐药的情况。此外，kaplan-meier生存曲线展示接受ici治疗后，akt1或cdh1突变的患者相比于野生型患者均有较差的pfs(图1c和d)。[0132]实施例3.构建akt1和cdh1突变联合模型预测dmmr/msi-h胃肠癌患者免疫治疗耐药[0133]在发现队列中，有5名akt1-mut(mut：突变)患者，6名cdh1-mut患者，1名akt1和cdh1共突变患者。[0134]鉴于满足以下两个条件：1，多变量cox回归分析显示akt1和cdh1是pfs的独立预测因子(p《0.05，图3a)；2，多变量逻辑回归分析显示akt1和cdh1与原发性耐药独立相关(p《0.05)。我们联合akt1和cdh1突变作为免疫肿瘤治疗预测因子iopred来识别对ici耐药的dmmr/msi-h胃肠癌患者。发现无论是在dmmr/msi-h表型的胃癌，肠癌还是整体的胃肠肿瘤中，iopred-mut(cdh1或akt1突变)的患者在接受ici治疗后均有较差的pfs相比于野生型的患者(图3b-d)。为了进一步评价iopred对免疫治疗疗效的预测价值，我们对iopred与临床病理参数进行单因素cox回归分析，结果显示iopred是接受ici治疗的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者pfs的唯一预测因子(表2)。iopred突变显著富集在原发耐药组中(图2e)。此外，采用受试者工作特性(areceiveroperatingcharacteristic，roc)曲线及对应的曲线下面积(areaundercurve，auc)来评价iopred预测ici原发耐药的准确性。auc值为0.751(95％ci0.64-0.86)，特异性为98％(95％ci0.88-1.00)，敏感性为52％(95％ci0.32-0.72)。[0135]表2.发现队列中dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者临床分子因素与pfs相关性的单因素和多因素分析[0136][0137]dmmr：dna错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；gi：胃肠；ici：免疫检查点抑制剂；mut：突变；wt：野生型；pd-1：程序性死亡1；pd-l1：程序化死亡配体1；ctla4：细胞毒性t淋巴细胞抗原4；mono：抗pd-1/l1单药治疗；comb：抗ctla4联合抗pd-1/l1治疗；ecogps：东部合作肿瘤学小组(ecog)表现状态(ps)；ic：肠癌；gc：胃癌；ls：林奇综合症。[0138]实施例4.验证iopred对dmmr/msi-h胃肠癌患者免疫治疗耐药的预测价值[0139]独立的验证队列包含22个接受免疫治疗的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者，其基本特征展示在表3。在该队列中，akt1和cdh1突变频率分别为13.64％(3/22)9.09％(2/22)。进一步对akt1和cdh1基因突变位点进行分析，发现基因变异位点比较分散，没有明显的热点突变区域(图4)。生存分析展示接受ici治疗后，iopred-mut相比于iopred-wt患者有显著差的pfs和os(图5a和b)。cox回归分析展示iopred也是接受ici治疗的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者pfs的唯一预测因子(图5c)。在验证队列中，iopred用于初步耐药预测的auc值为0.658(95％ci0.48-0.84)，特异性为91.67％(95％ci0.65-0.99)，敏感性为40％(95％ci0.17-0.69)(图5d)。[0140]表3.验证队列中dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者的基本特征[0141][0142][0143]缩写：dmmr：错配修复缺陷；msi-h：高度微卫星不稳定；gi：胃肠；ici：免疫检查点抑制物；ecogps：东方合作肿瘤学小组表现状态；ic：肠癌；gc：胃癌；pd-1：程序性死亡1；pd-l1：程序性死亡配体1；her2：人表皮生长因子受体2；ctla4：细胞毒性t淋巴细胞抗原-4；tps：肿瘤比例评分；ls：林奇综合征。[0144]实施例5.iopred预后价值的探究[0145]通过从公共数据库tcga下载未接受免疫治疗的dmmr/msi-h胃肠肿瘤患者，探究iopred对预后的影响，在152例患者tcga队列中，30例患者为iopred-mut，包括18例结肠癌(crc)和12例胃癌。在这些病例中，单个akt1或cdh1突变和iopred-mut均与pfs或os无关(图6)。[0146]可见iopred不是预后标志物，仅作为ici疗效的预测标志物，其突变与dmmr/msi-h胃肠肿瘤中对ici的原发耐药和pfs显著相关。[0147]在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12当前第1页12