用于抗肿瘤免疫治疗的RNA组合物、RNA制剂及用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于抗肿瘤免疫治疗的rna组合物、rna制剂及用途。

背景技术：

1、肿瘤免疫治疗(tumor immunotherapy，cit)包括免疫检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法等，其已成为手术切除、放疗、化疗以外最为重要的肿瘤治疗手段[1]，尤其是以pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体为代表的免疫检查点抑制剂最为瞩目。然而尽管免疫检查点抑制剂在临床上取得了巨大的成功，但是其应用局限于某些特殊的肿瘤类型和部分肿瘤病人。目前许多研究和临床试验正在积极探索与免疫检查点抑制剂联用的药物组合类型和治疗手段，以期发挥其更强的抗肿瘤治疗作用，比如与化疗药物顺铂(nct02494583)、来那度胺(nct02077959)等联用；与靶向药vegf抑制剂(nct01454102)、braf抑制剂和mek抑制剂(nct02130466)等联用等[2]。

2、由免疫细胞分析产生的细胞因子是天然的免疫调节剂，具有调节机体免疫应答的作用。其中，il-12是由抗原呈递细胞(antigen presenting cells，apc)产生的一型促炎症细胞因子，由两个亚基p35和p40组成。经常被用于临床前研究或者临床试验的il-12分子是由柔性linker连接的异二聚体p70，其主要功能包括促进分化、增强t细胞和nk细胞的杀伤能力、抑制免疫抑制细胞如肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage，tam)等[3]。目前正处于临床试验阶段的基于il-12细胞因子的药物类型有很多种，如重组蛋白(nct01417546)、质粒(nct02480374)、病毒(nct03281382)、car-t细胞(nct03932565)和mrna(nct03871348，nct03946800)。

3、与应用质粒、病毒等的肿瘤免疫治疗相比，mrna在肿瘤免疫治疗中的应用上具有多种优势：(1)与重组蛋白相比，mrna制备过程简单，无复杂的表达及纯化步骤，由mrna翻译产生的蛋白具有药代动力学的优势。(2)与质粒和病毒相比，mrna编码蛋白无需进入细胞核，因此无整合到基因组的风险。(3)与病毒相比，mrna可以通过核苷酸修饰和形成环状mrna的形式降低免疫原性，可以多次给药。(4)与细胞制剂相比，mrna具有制备快速、简单、成本低等诸多优势。因此，开发更多适用于肿瘤治疗的mrna治疗药物，提高肿瘤免疫治疗的效果，是当前亟需解决的重要问题。

4、由于mrna本身具有亲水性、高分子量和带负电的特征，使得其本身被细胞摄取的效率较低。合适的递送系统可以实现更高效地mrna组织分布和蛋白表达，无疑会更大程度上提高药物药效。目前用于mrna递送的技术和材料有很多种，主要分为(1)物理手段；(2)基于病毒的技术；(3)基于非病毒载体技术。通过短暂的破坏细胞膜的物理手段包括电转、基因枪等方法。基于病毒的技术手段则是利用修饰过的病毒将mrna递送到目的细胞内部。基于非病毒的载体系统包括聚合物体系、脂质体系和杂合体系。聚合物体系的优势在于他们可以通过多种修饰改变其活性，从而使得其具有更好的生物相容性。常用的聚合物体系有：polyplex、各种形式的pei、psa、壳聚糖、plga等。目前最常用的脂质体系为脂质纳米粒(lipid nanoparticle，lnp)。lnp的基本组成包括阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和peg。经过covid-19疫苗的大规模应用，lnp已经验证了其在mrna递送方面的优势。杂合体系融合了多种材料如聚合物、脂质等[4]。

5、引用文献：

6、[1]wahid b,ali a,rafique s,waqar m,wasim m,wahid k,idrees m.anoverview of cancer immunotherapeutic strategies.immunotherapy.2018 aug；10(11):999-1010.doi:10.2217/imt-2018-0002.

7、[2]alsaab ho,sau s,alzhrani r,tatiparti k,bhise k,kashaw sk,iyerak.pd-1 and pd-l1checkpoint signaling inhibition for cancer immunotherapy:mechanism,combinations,and clinical outcome.front pharmacol.2017 aug 23；8:561.doi:10.3389/fphar.2017.00561.

8、[3]nguyen kg,vrabel mr,mantooth sm,hopkins jj,wagner es,gabaldon ta,zaharoff da.localized interleukin-12 for cancer immunotherapy.frontimmunol.2020 oct 15；11:575597.doi:10.3389/fimmu.2020.575597.

9、[4]baptista b,carapito r,laroui n,pichon c,sousa f.mrna,a revolutionin biomedicine.pharmaceutics.2021dec 5；13(12):2090.doi:10.3390/pharmaceutics13122090.

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、目前，编码il-12sc的mrna单药虽然展现出了抗肿瘤作用，但其单一用药仍然存在很多不足，例如缺乏t细胞共刺激信号、缺乏对dc细胞的招募和动员、缺乏某些天然免疫受体的刺激作用等，依然存在临床患者不能产生免疫治疗响应。对此，本发明拟提供用于抗肿瘤免疫治疗的rna组合物，利用mrna的编码序列高效、稳定地表达特定组合的治疗性多肽，实现更强大、更完备的抗肿瘤作用，进一步通过设计多种mrna组合形式，实现更广谱的抗肿瘤作用。

3、用于解决问题的方案

4、[1]、一种rna组合物，其编码的目标多肽包括如下(i)-(iv)所示多肽中的任意两种或两种以上的组合：

5、(i)4-1bbl多肽；

6、(ii)选自gm-csf多肽和flt3l-fc多肽中的至少一种多肽；

7、(iii)选自casting多肽和catlr4多肽中的至少一种多肽；

8、(iv)il-12sc多肽；

9、其中，(i)-(iv)所示的多肽由一种或两种以上的mrna编码。

10、[2]、根据[1]所述的rna组合物，其中，所述rna组合物包含如下(a)-(d)所示mrna中的任意两种或两种以上的组合，或者，所述rna组合物包含如下(e)所示的mrna：

11、(a)第一mrna，所述第一mrna包含编码4-1bbl多肽的第一编码序列；

12、(b)第二mrna，所述第二mrna包含编码gm-csf多肽或flt3l-fc多肽的第二编码序列；

13、(c)第三mrna，所述第三mrna包含编码casting多肽或catlr4多肽的第三编码序列；

14、(d)第四mrna，所述第四mrna包含编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

15、(e)第五mrna，所述第五mrna包含编码重组多肽的第五编码序列；其中，所述第五编码序列包括如下任意两种或两种以上的组合：编码4-1bbl多肽的第一编码序列、编码gm-csf多肽或flt3l-fc多肽的第二编码序列、编码casting多肽或catlr4多肽的第三编码序列，以及编码il-12sc多肽的第四编码序列。

16、[3]、根据[2]所述的rna组合物，其中，所述rna组合物为包含如下所示的mrna的组合：

17、所述第四mrna，以及，

18、所述第一mrna、第二mrna和第三mrna中的至少一种；

19、优选地，所述rna组合物选自如下(f)-(k)中任意一项所示的mrna的组合：

20、(f)包含编码所述4-1bbl多肽的第一mrna和编码所述il-12sc多肽的第四mrna的组合；

21、(g)包含编码所述gm-csf多肽的第二mrna和编码所述il-12sc多肽的第四mrna的组合；

22、(h)包含编码所述flt3l-fc多肽的第二mrna和编码所述il-12sc多肽的第四mrna的组合；

23、(j)包含编码所述casting多肽的第三mrna和编码所述il-12sc多肽第四mrna的组合；

24、(k)包含编码所述catlr4多肽的第三mrna和编码所述il-12sc多肽第四mrna的组合。

25、[4]、根据[2]所述的rna组合物，其中，所述rna组合物中包含所述第五mrna；所述第五mrna包含编码重组多肽的第五编码序列；其中，所述重组多肽包括il-12sc多肽，以及4-1bbl多肽、gm-csf多肽、flt3l-fc多肽、casting多肽和catlr4多肽中的至少一种；优选地，所述第五mrna的第五编码序列选自如下(l)-(p)中任意一项：

26、(l)所述第五编码序列包含编码所述4-1bbl多肽的第一编码序列和编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

27、(m)所述第五编码序列包含编码所述gm-csf多肽的第二编码序列和编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

28、(n)所述第五编码序列包含编码所述flt3l-fc多肽的第二编码序列和编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

29、(o)所述第五编码序列包含编码所述casting多肽的第三编码序列和编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

30、(p)所述第五编码序列包含编码所述catlr4多肽的第三编码序列和编码所述il-12sc多肽的第四编码序列。

31、[5]、根据[1]-[4]中任一项所述的rna组合物，其中，所述rna组合物中的各mrna彼此独立地选自线状mrna或环状mrna；优选地，所述rna组合物中的各mrna为环状mrna。

32、[6]、根据[5]所述的rna组合物，其中，所述环状mrna包含编码序列和与所述编码序列可操作地连接的翻译起始序列；所述编码序列包含编码4-1bbl多肽的第一编码序列、编码gm-csf多肽或flt3l-fc多肽的第二编码序列、编码casting多肽或catlr4多肽的第三编码序列和编码il-12sc多肽的第四编码序列中的至少一种；

33、可选地，所述rna组合物包含如下(a1)-(d1)所示环状mrna中的任意两种或两种以上的组合，或者，所述rna组合物包含如下(e1)所示的环状mrna：

34、(a1)第一环状mrna，所述第一环状mrna包含编码4-1bbl多肽的第一编码序列；

35、(b1)第二环状mrna，所述第二环状mrna包含编码gm-csf多肽或flt3l-fc多肽的第二编码序列；

36、(c1)第三环状mrna，所述第三环状mrna包含编码casting多肽或catlr4多肽的第三编码序列；

37、(d1)第四环状mrna，所述第四环状mrna包含编码所述il-12sc多肽的第四编码序列；

38、(e1)第五环状mrna，所述第五环状mrna包含所述第一编码序列、第二编码序列、第三编码序列和第四编码序列中的任意两种或两种以上的组合；

39、可选的，所述环状mrna具有如下(q)-(t)中任一项所示排列次序的序列：

40、(q)第一外显子序列、第二外显子序列、5’间隔区序列、翻译起始序列、编码序列和3’间隔区序列；

41、(r)第一外显子序列、第二外显子序列、翻译起始序列和编码序列；

42、(s)翻译起始序列和编码序列；

43、(t)翻译起始序列、编码序列和插入元件序列；

44、优选地，所述环状mrna具有如(t)所示排列次序的序列；

45、可选的，所述环状mrna由环化前体rna发生剪切反应后环化形成；

46、可选的，所述环化前体rna包含如下(w)-(s1)中任一项所示排列次序的序列：

47、(w)5’同源臂、内含子片段ii、第二外显子、5’间隔区、翻译起始序列、编码序列、3’间隔区、第一外显子、内含子片段i和3’同源臂；

48、(x)5’同源臂、内含子片段ii、第二外显子、翻译起始序列、编码序列、第一外显子、内含子片段i和3’同源臂；

49、(y)内含子片段ii，编码序列截断片段ii，翻译起始序列，编码序列截断片段i，内含子片段i；

50、(z)内含子片段iii，编码序列截断片段iv，翻译起始序列，编码序列截断片段iii，内含子片段iv；

51、(s1)内含子片段ii，翻译起始序列截断片段ii，编码序列，翻译起始序列截断片段i，内含子片段i。

52、[7]、根据[6]所述的rna组合物，其中，所述翻译起始序列包含如下所示的至少一种具有翻译起始活性的序列：ires序列、5’utr序列、kozak序列、包含m6a修饰的序列、核糖体18s rrna的互补序列。

53、[8]、根据[5]-[7]中任一项所述的rna组合物，其中，所述rna组合物包含如下所示的mrna的组合：

54、所述第四环状mrna，以及，

55、所述第一环状mrna、第二环状mrna和第三环状mrna中的至少一种；

56、优选地，所述rna组合物选自如下(f1)-(k1)中任意一项所示的环状mrna的组合：

57、(f1)包含编码所述4-1bbl多肽的第一环状mrna和编码所述il-12sc多肽的第四环状mrna的组合；

58、(g1)包含编码所述gm-csf多肽的第二环状mrna和编码所述il-12sc多肽的第四环状mrna的组合；

59、(h1)包含编码所述flt3l-fc多肽的第二环状mrna和编码所述il-12sc多肽的第四环状mrna的组合；

60、(j1)包含编码所述casting多肽的第三环状mrna和编码所述il-12sc多肽的第四环状mrna的组合；

61、(k1)包含编码所述catlr4多肽的第三环状mrna和编码所述il-12sc多肽的第四环状mrna的组合。

62、[9]、根据[1]-[8]中任一项所述的rna组合物，其中，

63、所述4-1bbl多肽的氨基酸序列包含如seq id no.13所示的序列，或与seq idno.13所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有4-1bbl多肽活性的序列；

64、所述gm-csf多肽的氨基酸序列包含如seq id no.14所示的序列，或与seq idno.14所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有gm-csf多肽活性的序列；

65、所述flt3l-fc多肽的氨基酸序列包含如seq id no.15所示的序列，或与seq idno.15所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有flt3l-fc多肽活性的序列；

66、所述casting多肽的氨基酸序列包含如seq id no.16所示的序列，或与seq idno.16所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有casting多肽活性的序列；

67、所述catlr4多肽的氨基酸序列包含如seq id no.17所示的序列，或与seq idno.17所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有catlr4多肽活性的序列；

68、所述il-12sc多肽的氨基酸序列包含如seq id no.12所示的序列，或与seq idno.12所示的序列具有至少80％的序列同一性，且具有或部分具有il-12sc多肽活性的序列；

69、可选地，编码所述4-1bbl多肽的第一编码序列包含如seq id no.7所示的序列，或与seq id no.7所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有4-1bbl多肽活性的多肽的核苷酸序列；

70、编码所述gm-csf多肽的第二编码序列包含如seq id no.8所示的序列，或与seqid no.8所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有gm-csf多肽活性的多肽的核苷酸序列；

71、编码所述flt3l-fc多肽的第二编码序列包含如seq id no.9所示的序列，或与seqid no.9所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有flt3l-fc多肽活性的多肽的核苷酸序列；

72、编码所述casting多肽的第三编码序列包含如seq id no.10所示的序列，或与seqid no.10所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有casting多肽活性的多肽的核苷酸序列；

73、编码所述catlr4多肽的第三编码序列包含如seq id no.11所示的序列，或与seqid no.11所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有catlr4多肽活性的多肽的核苷酸序列；

74、编码所述il-12sc多肽的第一编码序列包含如seq id no.6所示的序列，或与seqid no.6所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有il-12sc多肽活性的多肽的核苷酸序列。

75、[10]、一种rna制剂，其中，所述rna制剂包含如[1]-[9]任一项所述的rna组合物；

76、可选地，所述rna制剂为液体制剂；优选地，所述rna制剂为注射剂；

77、可选地，所述rna制剂中包含用于递送所述rna组合物的递送载体；优选地，所述递送载体选自脂质纳米粒、鱼精蛋白、聚合物和病毒中的任意一种。

78、[11]、一种药物组合物，其包括[1]-[9]中任一项所述的rna组合物，或如[10]所述的rna制剂；可选地，所述药物组合物中包含免疫检查点抑制剂；

79、可选的，所述免疫检查点抑制剂选自如下所示的至少一种具有免疫检查点抑制活性的物质：pd-1抗体、pd-l1抗体、ctla-4抗体。

80、[12]、根据[1]-[9]中任一项所述的rna组合物、根据[10]所述的rna制剂和/或根据[11]所述的药物组合物在如下(u)-(w)至少一项中的用途：

81、(u)作为或制备用于预防和/或治疗癌症的药物；

82、(w)作为或制备用于减小或消除肿瘤的药物。

83、[13]、一种预防和/或治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的根据[1]-[9]中任一项所述的rna组合物，根据[10]所述的rna制剂和/或根据[11]所述的药物组合物；

84、可选地，经静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病损内、颅内、关节内、胸膜内、气管内、鼻内、直肠内、局部、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、膀胱内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局域、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过导管、通过灌洗或通过灌注来给受试者施用所述rna组合物、所述rna制剂或所述药物组合物；

85、优选的，所述施用的方式包括瘤内注射。

86、发明的效果

87、通过上述技术方案的实施，本发明提供的rna组合物可以包含编码不同蛋白质的mrna，体内药效学实验证明其可以有效抑制肿瘤生长，药效相比编码il-12sc的mrna单药更加显著，且其在与免疫检查点抑制剂联用时，可以实现更好的药效。