用于稻田节肢动物群落研究的环境DNA宏条形码测序法

用于稻田节肢动物群落研究的环境dna宏条形码测序法
技术领域
1.本发明属于分子生态学领域，涉及用于稻田节肢动物群落研究的环境dna宏条形码测序方法。


背景技术：

2.稻田节肢动物群落研究对于提高稻田生态系统稳定性和多样性至关重要。传统的稻田节肢动物群落研究大多数是基于对所采集的所有节肢动物种类鉴定与数量测定的基础上而开展的，需要耗费大量的精力，且鉴定人员需要丰富的经验，难以实现节肢动物群落种类与数量的全貌和精准确定。同时传统的取样方法在取样过程中会对原有稻田生态系统造成影响。基因测序技术和生物信息学的发展，可以高效精准地完成物种分子鉴定，为生态学调查提供了新的研究方法和思路(wilson et al.,2019)。高通量测序技术可以对各种环境样本dna(environmental dna,edna)进行快速测序，将测序数据与已有的dna条形码相结合形成了edna宏条形码技术(edna metabarcoding)(coissac et al.,2012)。edna是指生物释放到水、空气及土壤等环境中的短dna片段，目前edna宏条形码技术已经在淡水和海洋生态系统生物多样性调查、入侵生物监测等方面发挥着重要作用(徐浩等,2014；deiner et al.,2017)。对海洋牡蛎礁进行取样，采用线粒体细胞色素氧化酶coi基因对样品进行pcr扩增，之后通过高通量测序鉴定出体型极其微小且罕见的海洋底栖生物(leray and knowlton,2015)。goldberg等(2013)运用edna宏条形码测序发现了一种新入侵新西兰的淡水螺potamopyrgus antipodarum。
3.近年来，这项技术也开始应用于陆地生态系统节肢动物群落生态学研究中。通过收集牧草的花朵进行高通量测序，可以较为快速准确的计算出草原上节肢动物群落的组成和物种相对丰富度(thomsen and sigsgaard,2019)。陆地生态系统edna宏条形码测序对于取样方法有较高的要求，valentin等(2020)采用“喷雾收集法”和“树干滚筒法”两种新方法收集了植被表面的edna，用于调查森林中入侵害虫斑衣蜡蝉lycorma delicatula的种群数量。目前，edna宏条形码在稻田生态系统中的应用还未有报道，因此本行业期待建立稻田edna宏条形码测序的方法体系，从而期待大大提高稻田节肢动物群落调查的效率和精准度。


技术实现要素：

4.本发明要解决的问题是提供一种用于稻田节肢动物群落研究的环境dna宏条形码方法。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法，其包括以下步骤：
6.1)、设定稻田节肢动物edna的取样；
7.2)、设定pcr扩增所用的引物；
8.3)、将步骤1)取样所得样品进行dna的提取，所得模板dna利用步骤2)所得引物进
行pcr扩增；
9.4)、步骤3)所得的pcr产物先进行纯化，而后进行高通量测序。
10.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的改进：
11.所述步骤1)中：取样包括水稻抽穗期的稻田土层、稻田水层、水稻植株清洗液、水稻花粉。优先推荐采用水稻植株清洗液edna作为稻田节肢动物群落多样性研究。
12.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的进一步改进：
13.当取样为稻田土层时，对水稻抽穗期的稻田土壤，用60ml环刀进行取样；
14.当取样为稻田水层时，对水稻抽穗期的稻田水，用50ml离心管进行取样；
15.当取样为水稻植株清洗液时，对水稻抽穗期的水稻单株用1000ml去离子水对植株根部以上进行清洗，收集清洗液；
16.当取样为水稻花粉时，对水稻抽穗期的稻穗采用白瓷盘(36cm
×
46cm
×
3.5cm)收集花粉。
17.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的进一步改进：
18.pcr扩增所用的引物为mlcoiintf/jghco2198r；
19.mlcoiintf：ggwacwggwtgaacwgtwtayccycc
20.jghco2198r：taaacttcagggtgaccaaaraayca。
21.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的进一步改进：
22.扩增体系为：5
×
fastpfu buffer 4μl，dntps 2μl，forward primer(5μm)0.8μl，reverse primer(5μm)0.8μl，fastpfu polymerase 0.4μl，模板dna 10ng，加ddh2o至20μl；
23.反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，共35个循环；72℃ 10min。
24.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的进一步改进：
25.当为稻田土层样品时，采用hipure soil dna kit(magen)提取dna；
26.当为水稻花粉样品时，采用hipure universal dna kit(magen)提取dna；
27.当以水稻植株清洗液和稻田水层为样品时，先采用孔径0.45μm的微孔滤膜进行抽滤，之后将滤膜剪碎裂解，采用hipure water dna kit(magen)提取dna。
28.作为本发明的稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法的进一步改进：
29.将步骤4)高通量测序结果中得到的otu序列与ncbi网站的nt公共数据库进行比对，从而获得取样样品中的稻田节肢动物种类。
30.edna宏条形码技术因其高效精准的优势，在淡水和海洋生态系统生物多样性研究中发挥了重要作用。目前稻田节肢动物群落研究还依赖于每一个田间取样物种的形态学鉴定数据的积累，是否能将这种高效精准的edna宏条形码技术引入到稻田节肢动物群落研究中呢？本发明将edna宏条形码技术应用于稻田节肢动物生态研究中，建立稻田节肢动物edna宏条形码测序的方法体系，解决了传统生态调查方法中物种形态鉴定效率和精准度低下的问题，为稻田生态系统中节肢动物群落的生态效应研究提供了新思路与新方法。
31.说明：传统方法中需要样本收集后，进行人工鉴定。本发明的方法可以快速高效实现稻田节肢动物种类鉴定。
32.本发明中的edna宏条形码技术易于标准化和自动化，未来可以借助该方法开展农田节肢动物群落生物多样性及重要害虫的智能监测和预报，为其他农田作物生态调查提供
参考，助力实现智慧农业。
33.本发明的技术关键主要包括以下两点：
34.1.适用于稻田节肢动物宏条形码测序的pcr体系的建立：根据已有文献报道，对四对条形码通用引物对稻田节肢动物dna的扩增效果进行评估，比较每一种扩增方法可以检测到的节肢动物类群，找到稻田节肢动物dna宏条形码测序的最适扩增引物和扩增体系。结果显示一对线粒体细胞色素氧化酶coi基因的引物扩增效果最好，其可以注释到的稻田常见节肢动物种类最多，可以用于宏条形码测序。
35.2.稻田节肢动物的edna可能存在于稻田土壤、水层及水稻植株表面等，因此稻田edna取样主要为稻田土层、稻田水层、水稻植株清洗液、水稻花粉等，以传统吸虫器取样作为对照。测序结果显示，水稻植株清洗液作为edna样品时可以注释到的稻田常见节肢动物种类最多。相较于传统的节肢动物调查方法，通过edna宏条形码技术可以精准高效鉴定节肢动物种类，并且对原有生态系统不会造成破坏。
附图说明
36.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
37.图1四对通用引物对稻田节肢动物dna样品的pcr扩增结果，其中泳道1，2为引物mlcoiintf/jghco2198r的扩增产物，泳道3，4为引物zbj_art_f/r的扩增产物，泳道5，6为引物16s rrna f/r的扩增产物，泳道7，8为引物18s rrna f/r的扩增产物。m代表dna marker，ck代表阴性对照。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
39.实施例1、稻田节肢动物edna取样
40.(1)试验水稻材料为秀水11(xs11)，取样时间为水稻抽穗期，取样地点为浙江大学长兴试验站(30.5
°
n，119.4
°
e)，共设置3个20m*20m的小区，即设置3个重复。
41.(2)稻田土壤样品用60ml环刀在每个小区随机取样5环刀，放入一个自封袋中，作为一个重复。
42.(3)稻田水层样品采用50ml离心管对每个小区的随机取样5次后倒入一个烧杯中，作为一个重复。
43.(4)水稻植株表面取样时将水稻单株移入实验室，用1000ml去离子水对植株根部以上进行清洗，收集清洗液。
44.(5)水稻花粉取样时，采用一白瓷盘(36cm
×
46cm
×
3.5cm)于水稻穗部轻轻拍打，之后将白瓷盘收集的花粉转移至1.5ml离心管，每个重复收集花粉0.1g。
45.(6)采用传统取样方法作为对照，吸虫器采用真空吸虫器(model 1612,florida，usa)进行节肢动物群落收集。将取样框(0.5m
×
0.5m
×
0.9m，有盖无底)罩于稻田，一般可罩住9株水稻。吸虫器在取样框内自上而下快速吸样，尽量将取样框内的节肢动物都吸进集虫袋(市售尼龙袜)，每个取样点吸虫1分钟，取样之后将集虫袋带回实验室将节肢动物挑出，保存至100％无水乙醇中。
46.(7)对于以上所有取样，均在每个小区内采用对角线五点随机取样，每次取样重复3次。取好的样品置于4℃冰箱并尽快提取dna。
47.实施例2、dna的提取及pcr扩增
48.(1)对实施例1中的吸虫器取样样品进行dna提取(每个重复分别进行dna提取)，提取方法采用硅胶柱纯化法，按照hipure universal dna kit(magen)说明书的操作步骤进行。提取好的dna采用nanodrop 2000(thermo scientific)测量质量和浓度，并保存在-20℃低温冰箱。
49.(2)参考之前的研究，选用线粒体细胞色素氧化酶coi基因的引物mlcoiintf/jghco2198r(leray et al.,2013)和zbj_art_f/r(zeale et al.,2011)，以及16s rrna f/r(elbrecht et al.,2016)和18s rrna f/r(zinger et al.,2019)作为pcr扩增的引物，序列信息见表1。
50.表1、四对通用引物的序列
[0051][0052]
(3)利用步骤(2)中的引物同时对步骤(1)中提取的吸虫器取样的样本dna进行pcr扩增，所用试剂为transstart fastpfu dna polymerase，扩增体系为：5
×
fastpfu buffer 4μl，dntps 2μl，forward primer(5μm)0.8μl，reverse primer(5μm)0.8μl，fastpfu polymerase 0.4μl，模板dna 10ng，加ddh2o至20μl。反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，共35个循环；72℃ 10min。
[0053]
(4)对步骤(3)中的pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，从图1可以看出，目的条带清晰且单一，说明以所采用的pcr扩增体系，每对引物对样本dna均具有较好的扩增效果，可以用于后续的高通量测序试验。
[0054]
实施例3、适用于稻田节肢动物宏条形码测序的通用引物的确定
[0055]
(1)对实施例2获得的pcr产物进行纯化，纯化后的产物送至上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序。测序采用illumina pe250平台，测序得到的reads根据overlap关系进行拼接，并对序列质量进行质控和过滤。按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)进行otu(operational taxonomic units)聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到otu的代表序列。
[0056]
(2)采用ncbi网站的nt公共数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/)进行out序列比对，以90％序列相似性作为物种注释标准。
[0057]
(3)对统计otu注释物种数据进行统计，分析在各个分类水平：class(纲)、order(目)、family(科)、species(种)统计各样本的群落组成。
[0058]
说明：上述(1)、(2)、(3)，均为常规技术，例如可参照已公开的《用于大型底栖动物群落结构研究的环境dna宏条形码方法》(专利号cn112359119a)进行。
[0059]
(4)以四对通用引物同时对吸虫器取样样本dna扩增的产物进行宏条形码测序后，分析结果可知(表2)，通用引物mlcoiintf/jghco2198r的扩增产物可以注释到最多的稻田节肢动物种类，其中包括蜘蛛纲、昆虫纲、鳃足纲等节肢动物。该通用引物可以用于后续稻田edna宏条形码测序。
[0060]
表2、四对通用引物对稻田节肢动物dna样品的扩增产物的高通量测序结果
[0061][0062]
说明：为了节省成本，在引物筛选时每对引物只对吸虫器取样样本dna三个重复中的一个样本进行扩增测序。
[0063]
实施例4、稻田节肢动物edna宏条形码应用于稻田节肢动物群落研究
[0064]
(1)对实施例1中所有取样样品如同实施例2中的方法进行dna提取(即，每个样品的每个重复分别进行dna提取)。
[0065]
对于水稻植株清洗液和稻田水层样品，先采用孔径0.45μm的微孔滤膜进行抽滤，之后将滤膜剪碎裂解提取dna，提取试剂盒采用hipure water dna kit(magen)；土壤样品dna提取试剂盒采用hipure soil dna kit(magen)；水稻花粉样品dna提取采用hipure universal dna kit(magen)。
[0066]
其余等同于实施例2。
[0067]
(2)按照实施例3中的方法，利用通用引物mlcoiintf/jghco2198r，对实施例1中所有稻田edna取样样品分别进行高通量测序，并分别分析各类edna样品可以检测到的稻田节肢动物。即，将高通量测序所得的otu序列与ncbi网站的nt公共数据库进行比对，从而获得如表3所述结果。
[0068]
(3)从测序结果可以看出(表3)，将每种取样方法下三个重复的结果进行汇总，在节肢动物科的层面，相较于吸虫器取样对照，水稻抽穗期的植株清洗液edna样品中可以检测到更多的节肢动物种类，这其中包括了飞虱科、叶蝉科、盲蝽科、瓢虫科、长角跳科，狼蛛科等常见稻田节肢动物。此外，水稻花粉的edna样品中检测到节肢动物种类略低于吸虫器对照，稻田土壤和水层的edna样品可以检测到的节肢动物种类最少。吸虫器取样的样品dna可以检测到的优势节肢动物(out序列占比最高)为瓢虫科、飞虱科、爪跳科、猎蝽科等，而水稻植株清洗液中可以检测到的优势节肢动物为爪跳科、瓢虫科、飞虱科、蚧总科等，其优势
节肢动物种类基本一致。
[0069]
表3、不同edna取样样品可以检测到的稻田节肢动物种类
[0070]
[0071][0072]
注：“+”代表可以检测到该科节肢动物，
“‑”
代表不能检测到该科节肢动物。
[0073]
(4)在节肢动物种的层面，计算各取样样品中稻田节肢动物的多样性指数(表4)，与传统吸虫器取样方法相比，水稻植株表面清洗液样品的物种丰富度最高，且物种均匀度较好，该取样方法适用于稻田节肢动物群落edna取样。
[0074]
表4、稻田不同edna样品中的节肢动物群落多样性指数
[0075][0076]
注：平均值
±
标准误，每个处理3个重复。
[0077]
说明：
[0078]
物种丰富度为指群落中物种的种类个数；
[0079]
simpson指数的计算公式为其中s是群落中的物种数，ni为第i个物种的个体数量，n为总个体数；
[0080]
shannon指数的计算公式为其中s是群落中的物种数；pi＝ni/n,pi是群落中第i个物种的个体数量(ni)占总个体数量(n)的比例；
[0081]
均匀度指数的计算公式为其中h’max
为h’的最大理论值，即假设群落中所有物种的个体数量都相同时的h’值，实际计算时，一般用lns替代h’max
。
[0082]
上述计算方式为常规技术，例如可参照《昆虫生态学原理与方法》(戈峰，2008，高等教育出版社)中的方法进行计算。
[0083]
(5)根据表4，可获得以下结论：运用本发明方法建立的稻田节肢动物edna宏条形码技术体系可以用于研究稻田节肢动物群落的多样性，推荐采用水稻植株清洗液edna作为稻田节肢动物群落多样性研究。
[0084]
说明：本发明中的试验，以传统吸虫器取样作为对照，传统方法可以鉴定的节肢动物种类，本发明的方法大部分也可以鉴定到(在科的水平，检出率为62.96％)，而传统方法中未鉴定出的节肢动物种类也可以通过该方法鉴定到。本发明的方法相对于传统方法能更加便捷地调查稻田节肢动物多样性，并且对原有稻田生态系统不会造成破坏。
[0085]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。