用于针对无症状个体中的癌症、癌症复发和癌前病症的群体筛选的方法、装置和试剂盒与流程

用于针对无症状个体中的癌症、癌症复发和癌前病症的群体筛选的方法、装置和试剂盒
1.相关申请的交叉引用
2.本技术是于2020年7月23日提交的美国非临时专利申请no.16/937,051的部分继续申请以及于2020年7月23日提交的美国非临时专利申请no.16/936,998的部分继续申请。本技术还要求于2019年8月29日提交的美国临时申请no.62/893,484和62/893,477的优先权和权益；其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及对在其他方面健康的群体和/或个体中的癌前病症进行筛选测试，并且涉及包含用于进行该测试所需组分的试剂盒。


背景技术：

4.癌症是世界上主要的公共健康问题。即使开发出用于治疗癌症的药剂，早期检测和预防仍然是对抗这种人类悲剧的最大希望。在美国专利no.4,857,457和在shamsuddin et uno.，human pathology，19：7-10，1988中(二者均通过引用整体并入本文)，报道了用于结直肠癌的测试，该测试可使用直肠黏液来检测提高的大肠癌风险。黏液通过润湿纤维素膜过滤器与酶半乳糖氧化酶反应，该过滤器先前已用酶的磷酸盐缓冲溶液浸渍然后冻干；并且然后使润湿的纤维素膜过滤器与带有黏液样品的metricel膜过滤器接触1至2小时。然后将带有黏液的膜过滤器用蒸馏水洗涤1分钟，与碱性品红(basic fuchsin)反应15分钟，在自来水中洗涤10分钟，然后风干。
5.这个基本程序虽然简单，但目前用于检测结直肠癌和癌前病症。然而，此后发现所公开的筛选程序(即，使用其中使用的标志物二糖作为结直肠癌的预测指标)并不限于大肠癌。相反，例如，如通过引用整体并入本文的授予shamsuddin的美国专利no.5,162,202和5,348,860中所描述的，二糖标志物可存在于身体周围具有类似癌前或癌性特征的其他部位。此外，其中描述的测试是冗长的。
6.人中的大多数癌症被认为是通过吸入的空气、摄入的食物、消耗的水和饮料等而暴露于一种或更多种环境致癌物的结果。致癌物通过大肠或肾和膀胱、或肺、皮肤(通过汗液)等排泄。因此，除了同时在带有癌和前癌(precancer)的器官中引起相应变化之外，可预期致癌物和/或其代谢物引起那些器官中的变化。前癌或癌前病症是那些使在其他方面健康的、无症状的个体对随后的癌症(高风险症状)高度易感的阶段或疾病，因为其可发展为癌症。因此，通过本发明的方法，首先使用直肠粘液取样，随后如果需要的话，通过对其他体液(例如乳腺、前列腺的分泌物、精液、宫颈和阴道黏液、痰、支气管或肺泡分泌物)进行取样，直到定位癌性或癌前病症的精确位置，可准确地检测个体体内(包括但不限于大肠)中癌性和癌前病症的存在或威胁，而无先前的假阴性风险，所述假阴性风险限制了该技术作为筛选测试，特别是作为一般群体的现场测试的价值。本文中公开的发明具有准确且可靠地检测未表现出癌性或癌前病症的体征或症状的个体的任何器官中的癌症和癌前病症的
出乎意料的益处。
7.如本文中提供的公开内容可另外地用于通过为无癌前病症的明显体征或症状的人提供常规筛选过程来拯救生命。如古老的格言所说：“一盎司的预防比一磅的治疗更好”，本公开内容不仅降低死亡率和发病率，而且在金钱方面，它将显著降低全球患者和提供者等的国家医疗保健成本。
8.发明目的
9.本公开内容的一般目的是提供这样的测试，该测试可例如作为一般群体筛选实践的一部分在公众(包括目前不存在症状或另外表现出需要诊断测试的那些)上进行。本文中提供的筛选测试允许快速测试和结果，从而促进其在不需要特定诊断实验室的大规模测试程序中使用，并允许将测试结果报道至经测试的一个或更多个个体(或其医师)和/或如果阴性结果被确定为假阴性，则在个体离开测试区域之前获得另外的直肠黏液样品。
10.又一个目的是提供这样的试剂盒。
11.本发明的再一个目的是提供用于进行本发明的筛选测试的试剂盒，其关键组分是长期稳定的。
12.再一个目的是提供用于使用本发明的试剂盒进行筛选测试的方法，该方法可在护理点或在对象家中足够快地完成，以在进行测试的个体等待时为其提供测试结果。
13.在进一步研究说明书和所附权利要求书之后，本发明的进一步目的和优点对于本领域技术人员将变得明显。


技术实现要素：

14.本公开内容涉及用于癌性和癌前病症的筛选测试方法、装置和试剂盒。具体地，该方法使用半乳糖氧化酶试剂和席夫试剂(schiff’s reagent)测试黏液或体液中的异常碳水化合物。筛选测试方法、装置和试剂盒提供了提高的准确性，并使处理过程最小化。本公开内容还涉及该装置或试剂盒在健康护理设施中用于对癌性和癌前病症进行初步评价的用途。
15.在一个方面中，用于癌性和癌前病症和病变的筛选方法包括以下步骤：将黏液或体液施加至具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜，通过与半乳糖氧化酶反应来使包含标志物碳水化合物的黏液或体液中的标志物碳水化合物氧化，以及使与测试条或膜相邻的具有席夫试剂溶液的容器活化以接触所述测试条或膜，并且其中席夫试剂溶液最初不与测试条或膜接触。
16.在一些实施方案中，用于癌性和癌前病症和病变的筛选方法包括选自以下的一个或更多个另外的步骤：在将黏液或体液施加至测试条或膜之前将水施加到测试条或膜上，在使具有席夫试剂溶液的容器活化之前通过洗涤来去除黏液或体液，在使席夫试剂溶液接触测试条或膜之后，用自来水洗涤测试条或膜，干燥测试条或膜，和/或评价测试条或膜的颜色。
17.在另一个方面中，用于癌性和癌前病症和病变的装置包含具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜和具有席夫试剂溶液的容器，其中席夫试剂溶液最初不与测试条或膜接触并且可在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后被活化以接触测试条或膜。活化碳水化合物席夫试剂溶液(在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后，以与测试条或膜
接触)的机制是不受限制的。在一个方面中，该机制可以是扭转阀、可破坏屏障等，其中在打开扭转阀或破坏屏障之后，席夫试剂溶液接触测试条或膜。
18.在另一个方面中，本公开内容提供了用于癌性和癌前病症的测试试剂盒，其包含具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜和具有席夫试剂溶液的容器。在一个方面中，具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜还包含干培养基，其中一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可使半乳糖氧化酶活化。在另一个方面中，测试条或膜中预包埋的半乳糖氧化酶是微囊化的。
19.在一个方面中，用于癌性和癌前病症和病变的筛选方法包括以下步骤：将黏液或体液施加至具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜，通过与半乳糖氧化酶反应来使包含标志物碳水化合物的黏液或体液中的标志物碳水化合物氧化，并使包埋在测试条或膜中的席夫试剂活化以接触测试条或膜。
20.在一些实施方案中，用于癌性和癌前病症和病变的筛选方法包括选自以下的一个或更多个另外的步骤：在将黏液或体液施加至测试条或膜之前将水施加到测试条或膜上，在使席夫试剂活化之前通过洗涤来去除黏液或体液，在使席夫试剂接触样品之后，用自来水洗涤测试条或膜，干燥测试条或膜，和/或评价测试条或膜的颜色。
21.在另一个方面中，用于癌性和癌前病症和病变的装置包含具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜和具有半乳糖氧化酶溶液的容器，其中席夫试剂可在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后被活化以接触样品。活化席夫试剂溶液(在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后，以与样品接触)的机制是不受限制的。在一个方面中，该机制可以是通过添加成孔剂。
22.在另一个方面中，本公开内容提供了用于癌性和癌前病症的测试试剂盒，其包含具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜以及具有半乳糖氧化酶试剂溶液的容器。在一个方面中，具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜还包含干培养基，其中一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可使半乳糖氧化酶活化。在另一个方面中，测试条或膜中的席夫试剂是微囊化的。
23.在另一个方面中，公开了本发明提供用于快速测试对象的癌前病症的筛选方法，其中对象无癌性或癌前病症的明显体征或症状。该方法包括在步骤(a)中从个体获得生物样品。在步骤(b)中，测定样品的一部分中包含至少一种碳水化合物的糖蛋白的存在，该碳水化合物选自：β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac、fuc-α-1
→
2 gal-β(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac、fuc-α-1
→
2 gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1＞4)-glcnac和
24.fuc-α-1
→
2-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac。测定生物样品可包括：简短地(briefly)使样品经受氧化条件，该条件能够仅在其带有羟基的环碳原子处选择性氧化样品的糖蛋白中所存在的任何所述标志物碳水化合物的环状糖部分，以形成醛糖部分，并随后用席夫碱脱色染料使由此形成的任何醛糖基团显现。接下来，在步骤(c)中，还可通过以下来测定生物样品的一部分中任何糖蛋白的存在：使样品经受氧化剂的氧化作用，这使其中的任何糖蛋白的糖部分氧化成醛糖部分，并随后使任何由此产生的醛糖部分显现。存在所形成的醛糖部分可证明取样是适当的，而缺少所形成的醛糖部分则可说明阴性测试结果是由于取样错误造成的。在步骤(d)中，该方法
可包括以下：如果第一样品在步骤(b)和(c)中测定为阴性，则以与上文提供的相同方式用新的生物样品重新测试该个体。最后，在步骤(e)中，该方法可包括基于席夫碱染料中显现的颜色变化，将无症状患者诊断为患有癌症或癌前病症。
25.该测定可包括以下步骤：将生物样品吸附到捕获蛋白质的水不溶性基质上，并随后洗涤该基质以从该基质上去除该样品的未固定组分。该不溶性基质可以是膜过滤器。
26.可通过以下来测定标志物碳水化合物糖部分：选择性氧化糖蛋白以使其任何半乳糖部分中的伯羟基选择性氧化成醛基，并随后对由此氧化的糖蛋白测试经氧化的邻近半乳糖部分。可用半乳糖氧化酶氧化半乳糖部分，并且可用碱性品红使经氧化的邻近半乳糖部分显现。样品中的任何醛糖部分可进一步用高碘酸氧化，并用碱性品红显现。
27.作为针对癌症的现场筛选的一部分，可对从多个个体获得的多个生物样品同时进行如上所述的方法。
28.步骤(c)可与步骤(b)用同一生物样品的不同部分同时进行，使得如果在步骤(b)和(c)二者中均获得阴性结果，则随后立即可从该个体中收集另一个生物样品，并且可重复步骤(a)、(b)和(c)。
29.在测定之前，可将生物样品吸附到捕获蛋白质的水不溶性基质上，并且洗涤基质以从基质上去除生物样品的未固定组分。随后在步骤(a)中通过以下来测定样品：选择性氧化样品中的任何糖蛋白以使其中的任何所述碳水化合物的半乳糖部分的伯羟基氧化成醛基，并随后可用碱性品红使由此氧化的半乳糖部分显现。在该测定中测试为阴性的样品可进一步用高碘酸氧化，并且用碱性品红使由此氧化的样品中的醛糖部分显现。
30.不溶性基质可以是膜过滤器，并且半乳糖部分可用半乳糖氧化酶氧化。用于半乳糖部分的氧化剂可存在于不溶性基质中，或者可在将样品施加至该不溶性基质之后直接施加至该不溶性基质。
31.在一些实施方案中，不溶性基质可以是膜过滤器，并且半乳糖部分可用半乳糖氧化酶氧化，其中在将生物样品施加至膜过滤器之后，将半乳糖氧化酶直接施加至膜过滤器。
32.公开了用于筛选人的除了大肠之外的器官中的癌前病症的方法，其中人无癌性或癌前病症的明显体征或症状。该方法可包括对与该器官相关的除了直肠黏液之外的蛋白质分泌物或蛋白质流体的样品进行测定，以测定其中标志物碳水化合物的存在，所述标志物碳水化合物选自β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac、fuc-α-1
→
2 gal-β(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac、fuc-α-1
→
2 gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1＞4)-glcnac和
33.fuc-α-1
→
2-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac。
34.在测定之前，可将蛋白质分泌物吸附到捕获蛋白质的水不溶性基质上，并随后洗涤该基质以从该基质中去除该样品的未固定组分。可通过以下测定样品的标志物碳水化合物：用半乳糖氧化酶选择性氧化样品中的任何糖蛋白以使其中的任何所述标志物碳水化合物的任何半乳糖部分中的伯羟基选择性氧化成醛基。随后用碱性品红使由此氧化的半乳糖部分显现。在该测定中测试为阴性的样品的部分可进一步用高碘酸氧化，并且可用碱性品红使由此氧化的样品中的醛糖部分显现。
35.用高碘酸氧化的蛋白质分泌物的样品部分可以是用半乳糖氧化酶氧化的同一样
品的不同部分，并且可与其同时进行氧化。
36.人可以是女性，并且生物样品可以是阴道黏液、宫颈内黏液、乳头抽吸物、痰、胆管流体、直肠黏液和/或胰管流体抽吸物中的任何一种或全部。人可以是男性，并且生物样品可以是前列腺分泌物、精液、痰、胆管流体、直肠黏液和/或胰管流体抽吸物中的任何一种或全部。
附图说明
37.图1描绘了本发明的试剂盒和方法中涉及的反应原理。在图中，标志物gal-galnac与半乳糖氧化酶(galactose oxidase，go)反应，在c-6位处产生两个邻近的醛，其然后与碱性品红结合以赋予洋红色(magenta color)。
38.图2描绘了要求保护的本发明方法的一个实施方案，其中样品在载片上反应以确定癌性或癌前病症。在来自无任何癌或前癌的对象的样品中，测试组是无色的，而通常洋红(粉红到紫)色指示对癌性和癌前病症和病变具有特异性的标志物二糖。
39.图3描绘了要求保护的本发明方法的一个实施方案，其中样品在载片上反应以确定癌性或癌前病症。在来自无任何癌或前癌的对象的样品中，测试组是无色的，而通常洋红(粉红到紫)色指示对癌性和癌前病症和病变具有特异性的标志物二糖。
具体实施方式
40.以下是提供以帮助本领域技术人员实践本公开内容的详细描述。本领域普通技术人员可在不脱离本公开内容的精神或范围的情况下对本文中描述的实施方案进行修改和变化。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其他参考文献均通过引用整体明确并入。
41.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。说明书中使用的术语仅用于描述具体实施方案并且不旨在限制本公开内容。
42.在提供值的范围的情况下，应当理解在该范围的上限和下限之间的每个中间值，直至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确规定(例如在包含多个碳原子的基团的情况下，在这样的情况下，提供了落入该范围内的每个碳原子数))、以及该规定范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本公开内容内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围内，也涵盖在本公开内容内，受所规定范围中的任何明确排除的限制。当所规定范围包含一个或两个限制时，排除那些被包含的限制的任一个的范围也包含在本公开内容中。
43.本文中详细描述和权利要求书内的所有数值均是通过“约”或“大约”进行修饰的指示值，并考虑了本领域普通技术人员将预期的实验误差和变化。
44.以下术语用于描述本公开内容。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。说明书中使用的术语仅用于描述具体实施方案并且不旨在限制本公开内容。
45.除非上下文另有明确说明，否则如本文中和所附权利要求书中所使用的没有数量词修饰的名词在本文中表示一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)。例如，“要素”意指
一个要素或多于一个要素。
46.本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素(即在一些情况下结合存在而在其他情况下不结合存在的要素)中的“任一者或两者”。用“和/或”列出的多个要素应以相同方式解释，即如此结合的要素的“一者或更多者”。除了由“和/或”子句具体地所指明的要素之外，其他要素任选地存在，不管与具体地所指明的那些要素相关或不相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言例如“包含”结合使用时，提及“a和/或b”可以在一个实施方案中仅指a(任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中仅指b(任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中指a和b二者(任选地包括其他要素)；等。
47.如本文中在说明书和权利要求书中使用的“或”应理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为是包括性的，即包括多种要素或要素列表中的至少一种，但也包括多于一种，以及任选地另外未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如
“……
中仅一个”或
“……
中恰好一个”，或者当在权利要求书中使用时“由
……
组成”，将指包含多种要素或要素列表中的恰好一种要素。一般而言，本文中使用的术语“或”当前面有排他性术语，例如“任一”、
“……
中之一”、
“……
中仅一个”或
“……
中恰好一个”时仅应解释为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个，但不是二者”)。
48.所有的连接词如“包含”、“包括”、“携有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(united states patent office manual of patent examining procedures)第2111.03节中所述，仅连接词“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”应分别为封闭式或半封闭式的连接词。
49.如本文中在说明书和权利要求书中使用的，关于一个或更多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为意指从要素列表中的任一个或更多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且也不排除要素列表中的任何要素组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素的列表中具体标识的要素之外，还可以任选地存在要素，无论其与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“a和b中的至少一个”(或等同地，“a或b中的至少一个”，或等同地，“a和/或b中的至少一个”)在一个实施方案中可以指存在至少一个a，任选地包括多于一个a，但不存在b(并且任选地包括除b之外的要素)；在另一个实施方案中可以指存在至少一个b，任选地包括多于一个b，但不存在a(并且任选地包括除a之外的要素)；在又一个实施方案中可以指存在至少一个a，任选地包括多于一个a，以及存在至少一个b，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其他要素)；等等。
50.如本文中在说明书和权利要求书中使用的，短语“标志物碳水化合物”或“标志物糖类”应理解为意指可通过使用本文中描述的方法提供癌性和癌前信息的碳水化合物。标志物碳水化合物包括但不限于β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac、fuc-α-1
→
2 gal-β(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac、fuc-α-1
→
2 gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1＞4)-glcnac和
51.fuc-α-1
→
2-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac。
52.如本文中在说明书和权利要求书中使用的，短语“黏液”或“体液”应是可互换的。短语“黏液”或“体液”应广义地解释为来自人体的包含标志物碳水化合物的任何流体或黏液。
53.如本文中在说明书和权利要求书中使用的，短语“包埋的”、“浸渍的”和“预包埋的”应是可互换的。在某些实施方案中，本发明的试剂可通过将试剂结合或固定在膜或测试条的表面上或者通过将试剂加载到多孔膜的孔中，经由包衣直接包埋到膜或测试条中。在又一些实施方案中，本发明的试剂被包封在胶囊或微囊中并且随后包埋、包被或浸渍到试剂或测试条中。在又一些实施方案中，试剂可用作侧流测定或侧流测试条中的洗脱液。在一些具体实施方案中，包含席夫试剂的流体可用作侧流测定或侧流测试条中的洗脱液。在另一个具体实施方案中，包含半乳糖氧化酶的流体可用作侧流测定或侧流测试条中的洗脱液。
54.在本公开内容中使用的用于在针对癌性和癌前病症进行测试的个体的黏液或体液中检测标志物碳水化合物的存在的背景和理论在美国专利no.4,857,457、5,162,202和5,348,860中以及在usefulness of galactose oxidase-schiff test in rectal mucus for screening of colorectal malignancy anticancer research 21：1247-1256(2001)中进行了公开。所有这些参考文献均并入本文。在本发明的方法和试剂盒中使用的反应如图1中所示。
55.本发明是对如前所述的测定关于以下的改进：使由于取样或程序错误而导致的假阳性最小化以及为了方便。
56.还应该理解，在本文中所述的包括多于一个步骤或动作的某些方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于其中记载的该方法的步骤或动作的顺序，除非上下文另有说明。
57.在本说明书通篇，使用术语“患者”或“对象”来描述向其提供使用根据本公开内容的组合物的治疗，包括预防性治疗的动物，优选人或驯养动物。对于对特定动物(例如人患者)具有特异性的那些感染、病症或疾病状态的治疗，术语患者是指该特定动物，包括驯养动物(例如狗或猫)或者农场动物(例如马、牛、绵羊)等。通常，在本公开内容中，术语患者是指人患者，除非在使用该术语的上下文中另有说明或暗示。
[0058]“无明显体征或症状”或“未表现出症状”包括表现出通常与癌或前癌相关的最小症状或无症状的在其他方面健康的对象。在某些实施方案中，术语“无明显体征或症状”包括在遗传上易患某些癌症或具有这样的癌症的家族史的在其他方面健康的个体(例如，在“对随后的癌症高度易感”类别中的在其他方面健康的个体)。在某些实施方案中，术语“无明显体征或症状”包括基于生活方式、环境或其他社会决定因素而处于某些癌症的提高风险中的在其他方面健康的个体(例如，吸烟者；使用辐射或有害材料工作的个体；通过地下水暴露于致癌物的个体；服用提高癌症风险的药物的个体)。在某些实施方案中，术语“无明显体征或症状”包括先前已针对癌性病症进行治疗的在其他方面健康的个体，该癌性病症已被去除或进入缓解期。在这样的实施方案中，本发明的方法可用于检测癌性病症的复发。在某些实施方案中，术语无明显体征或症状包括经历并非仅归因于癌或前癌的症状的个体。这样的症状包括但不限于疲劳、食欲不振、体重减轻、咳嗽、呼吸短促、淋巴结肿大、消化不良、恶心和疼痛。在一些具体实施方案中，如果人表现出肋骨或胸部区域中的疼痛、慢性
或长期咳嗽、呼吸短促和/或哮鸣的最小症状或无症状，则认为其无肺癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出乳房中的肿块、乳房压痛、乳头溢液和/或乳房或乳头的形状上的变化的最小体征或症状或者无体征或症状，则认为其无乳腺癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出排便习惯上的变化、粪便硬度上的变化、粪便中的血和/或持续腹部不适的最小症状或无症状，则认为其无结肠癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出尿频、难以开始或维持稳定的尿流、滴尿、排尿过多或排尿冲动、尿潴留、渗漏和/或骨痛的最小症状或无症状，则认为其无前列腺癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出骨盆中的疼痛、性交期间的不适或疼痛、月经异常或出血、阴道出血异常和/或阴道分泌物异常的最小症状或无症状，则认为其无子宫内膜癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出腹部或骨盆疼痛、排便习惯上的变化、腹部饱胀、腹部中的流体和/或腹部中的肿块的最小症状或无症状，则认为其无卵巢癌的明显体征或症状。在一些具体实施方案中，如果人表现出腹部疼痛或中背部疼痛、腹部中的流体、异常深色尿液和/或发黄的皮肤或眼的最小症状或无症状，则认为其无胰腺癌的明显体征或症状。在一个具体实施方案中，当对象未表现出肿胀或不愈合的疮；口腔中的红色或白色斑块；头或颈区域中的伴有或不伴有疼痛的肿块、凸块或团块；持续性咽痛；不能用卫生来解释的恶臭(foul)的口腔气味；声音嘶哑或变化；鼻阻塞或持续性鼻塞时，则认为对象无头颈癌的明显体征或症状。
[0059]
本发明中用于检测有症状个体(显示结肠癌和肠癌的体征和症状)的直肠黏液中存在的标志物碳水化合物的技术的具体实施方案公开于美国专利no.4,857,457和5,348,860中，其全部内容通过引用并入本文。
[0060]
本发明提供了用于检测多种癌症的可靠的筛选工具，癌症例如肺癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、头颈癌、宫颈癌、子宫癌和卵巢癌。本发明还提供了用于检测癌前病症或提高的风险的可靠的筛选工具，例如如果个体具有高风险症状(例如，在“对随后的癌症(subsequent cancer)高度易感”类别中)。例如，“对随后的癌症高度易感”的患者可能包括没有表现出癌症或癌前病变体征和症状，但可能受到某些生活方式或工作相关外部因素(如吸烟、酗酒或吸毒、不健康饮食、久坐、危险或有毒的工作或生活条件等)影响的个体。在这些情况下，患者当时可能没有癌症或癌前病变的明显体征或症状，但可能趋向于癌症或癌前病变症状。然而，所描述的筛选测试、试剂盒和方法可用于一般筛选，例如用于不属于高风险类别的患者，或者没有已知癌症或癌前病变症状的患者。理想情况下，这将有益于将所描述的筛选测试、试剂盒和方法作为目标人群中患者的年度体检或定期医生访视的一部分，从而实现更早的检测和干预。如本文中使用的，目标人群通常可以是30岁以上的人，但没有理由不能对更年轻的个体进行筛选。
[0061]
在一些具体实施方案中，本发明提供了用于检测多种癌症的可靠筛选工具，癌症例如肺癌、直肠癌、结肠癌、淋巴结癌、胃癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫癌和卵巢癌。例如，在个体没有明显体征或症状的癌前病症中。换言之，本发明提供了即使在没有迹象表明存在病症时也可以检测癌症或癌前病变的工具。这也包括在遗传上易患某些癌症或有这样的癌症家族史的个体(例如，属于“对随后的癌症高度易感”类别)。然而，所描述的筛选测试、试剂盒和方法可用于一般筛选，例如在不属于高风险类别或没有已知癌症或癌前病变症状的患者中。
[0062]
在一些实施方案中，当本发明的筛选工具显示癌性或癌前病症的证据时，本发明还提供开始治疗癌性或癌前病症或者恢复先前暂停的癌性病症治疗的步骤。在一些实施方案中，当本发明的筛选工具未显示癌性或癌前病症的证据时，本发明提供在预定时间段之后再次筛选个体的步骤。
[0063]
在一些具体实施方案中，本发明提供了用于多种生物样品、生物基质和生物流体的筛选工具。术语“生物样品”是指含有分子或分子混合物的任何溶液或提取物，所述分子或分子混合物包含至少一种生物分子，所述生物分子经受源自生物来源(例如人和动物)的提取或分析。生物样品旨在包括粗制或纯化样品，例如分离的或商业获得的样品。生物样品可以是但不限于包涵体、生物流体、生物组织、生物基质、包埋的组织样品、细胞(例如，一种或更多种类型的细胞)和细胞培养上清液。具体实例可以包括血浆、尿、脑脊液、滑液和其他生物流体，包括组织的提取物，例如肝组织、肌肉组织、脑组织和心脏组织等。
[0064]
术语“生物基质”旨在包括细胞含有或制造的任何东西，例如骨、包涵体、血液组分、细胞碎片，例如细胞裂解物等。
[0065]
本文所用的术语“生物流体”旨在包括从生物来源获得的流体。示例性生物流体包括但不限于血、血浆、尿、脊髓液、黏膜组织分泌物、泪、组织间液、唾液、痰、滑液、精液和乳房分泌物。在一些具体实施方案中，生物流体是含蛋白质生物流体或蛋白质的生物流体。在另一些实施方案中，生物流体是痰、唾液、乳头抽吸物、前列腺按摩分泌物、胰腺和胆管流体、直肠黏液或子宫颈黏液。在一些具体实施方案中，生物流体不是直肠黏液。
[0066]
详细地，黏液或体液样品中的标志物碳水化合物或糖类通过用半乳糖氧化酶或相当的氧化剂(其仅将糖蛋白中存在的糖类中半乳糖部分的伯羟基氧化成醛基)选择性氧化黏液或体液样品中的糖蛋白来检测。然后可以用席夫试剂，例如形成洋红色的碱性品红使所得醛基显现。
[0067]
半乳糖部分标志物碳水化合物或糖类在室温下被半乳糖氧化酶例如在少于约15分钟(例如约5至10分钟)内快速(并且在升高的温度直至酶的失活温度下甚至更快)选择性地氧化成醛糖部分。可使用这样的比率，所述比率为当使用本领域公知的酶时酶与底物和适合于活化该酶的载剂的比率。
[0068]
然后在进行或不进行首先去除或灭活半乳糖氧化酶的情况下，用使由此产生的醛糖部分显现或允许其显现的试剂(例如，品红、蔷薇苯胺、洋红或其他席夫碱脱色染料)对氧化的样品进行处理。
[0069]
本发明的目的、特征和优点是在其一个方面通过提供快速、可靠的关于假阴性和商业上可行的方法以用于在人中检测癌前或癌性病症的存在而获得的。本发明使用这样的测试方法，其包括获得黏液或体液样品，测定样品以检测在其中以下标志物碳水化合物中的至少一种的存在：β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac，fuc-α-1
→
2gal-β(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac，fuc-α-1
→
2gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1＞4)-glcnac和
[0070]
fuc-α-1
→
2-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac；以及，任选地，基于在黏液或体液中检测到的标志物碳水化合物的量来诊断前癌或癌的存在和程度。
[0071]
使用半乳糖氧化酶条测试进行初步筛选
[0072]
该技术使用半乳糖氧化酶选择性氧化黏液中糖蛋白的半乳糖部分的c-6羟基的能力，例如β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac的半乳糖和n-乙酰基半乳糖胺残基二者到d-半乳糖己二醛糖。在这种如此氧化的产物中存在醛糖部分是糖蛋白中标志物碳水化合物的证据。可以使用席夫试剂(例如碱性品红)检测它们的存在。
[0073]
获得样品并将其涂抹在一块膜过滤器(例如，metricel膜过滤器0.45μm，gelman sciences，inc.，ann arbor，mich.48106)的刻痕侧上。将适量(取决于滤纸的大小)的半乳糖氧化酶直接应用于过滤器。在约5至10分钟的反应时间之后，通常在室温下，将膜在去离子水中洗涤1分钟，并随后将膜置入席夫试剂中1分钟，并随后将膜在流动的自来水中洗涤1分钟。抖落多余的水并通过空气干燥或在烘箱中干燥膜。完全干燥之后，黏液涂片呈明亮的洋红色，表明检测呈阳性。
[0074]
对于典型的结果，与结肠癌的常规血液测试相比，没有发现假阴性并且假阳性少得多。然后根据本发明通过用高碘酸氧化然后再次用席夫试剂处理来测试给出阴性结果的样品的糖蛋白含量。洋红色的显现证实了阴性结果是生物学阴性，而不是由于采样误差而导致的假阴性。因为整个过程需要不到一个半小时，所以可以方便地从第一个样品产生假阴性的个体获得第二个样品。
[0075]
制备
[0076]
储存稳定的席夫试剂溶液
[0077]
将1.0gm碱性品红溶解在200.0ml热蒸馏水中并达到沸点。冷却至50℃，添加20.0ml的1n hcl并进一步冷却，并添加1.0gm焦亚硫酸钠。在黑暗中冷藏，直到溶液变成稻草色(约48小时)。然后添加5g活性炭，充分搅拌并通过过滤去除炭。澄清的滤液是席夫试剂，其可稳定储存很多个月，例如至少一年。此外，由此产生的洋红色比用常规制备的席夫试剂获得的洋红色更强烈。
[0078]
半乳糖氧化酶测试条
[0079]
本公开内容提供了具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜。不需要单独的半乳糖氧化酶溶液。测试条或膜中的半乳糖氧化酶可以被包封，其可以通过湿气或与水接触来活化。测试条或膜中半乳糖氧化酶的量不受限制，条件是该量足以氧化样品中的标志物碳水化合物。
[0080]
在一个方面，本公开内容的测试条或膜可以设计成具有不同量的流体摄入以适应不同黏液或体液中不同量的标志物碳水化合物。例如，用于测试直肠黏液的条或膜可不同于用于在流体摄入方面测试乳房分泌物的条或膜。在另一个方面，测试条或膜中半乳糖氧化酶的量也可以基于不同黏液或体液中标志物碳水化合物的浓度而改变。在另一个方面，测试条或膜还包含干培养基，并且一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可使半乳糖氧化酶活化。
[0081]
半乳糖氧化酶测试条装置
[0082]
本公开内容提供了具有以下的装置：具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜和具有席夫试剂溶液的容器，其中席夫试剂溶液最初不与测试条或膜接触并且可在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后被活化以接触测试条或膜。
[0083]
活化席夫试剂溶液(在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后，以接触测试条或膜)的机制是不受限制的。在一个方面，该机制可以是扭转阀、可破坏屏障等，其中在打
开扭转阀或破坏屏障之后，席夫试剂溶液接触测试条或膜。在另一个方面，活化席夫试剂溶液的机制是手动将席夫试剂溶液转移到测试条或膜上。在一个方面，本发明的装置在单个单元中包括所有组分以使采样或程序错误最小化。
[0084]
在一个方面，具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜还含有干培养基，其中一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可使半乳糖氧化酶活化。在另一个方面，测试条或膜中预包埋的半乳糖氧化酶是微囊化的。在另一方面，测试条或膜中预包埋的半乳糖氧化酶可以通过在测试条或膜上添加数滴水或者通过在测试条或膜上添加黏液或体液来活化。
[0085]
在一个方面，本公开内容涉及该装置用于筛选癌性或癌前病症的用途。癌性或癌前病症的类型是不受限制的，假定标志物碳水化合物存在于癌性或癌前病症(例如直肠、结肠、血液、淋巴结、胃、肾、胆囊、前列腺、睾丸、乳房、宫颈和卵巢)的黏液或体液中。
[0086]
在某些实施方案中，具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜还包含预包埋的席夫试剂。在这样的一些实施方案中，预包埋的半乳糖氧化酶在预包埋的席夫试剂活化之前被活化，以使得样品与半乳糖氧化酶的反应在与席夫试剂的反应之前发生。
[0087]
具有包埋的席夫试剂的半乳糖氧化酶测试条
[0088]
本公开内容提供了用于样品与半乳糖氧化酶反应的具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜。测试条或膜中的席夫试剂可被包封，其可通过湿气溶胀或通过与成孔剂接触来活化。测试条或膜中席夫试剂的量是不受限制的，条件是该量足以在半乳糖氧化酶氧化之后与样品中的标志物碳水化合物发生反应。
[0089]
在一个方面，本公开内容的测试条或膜可以设计成具有不同量的流体摄入以适应不同黏液或体液中不同量的标志物碳水化合物。例如，用于测试直肠黏液的条或膜可不同于用于在流体摄入方面测试乳房分泌物的条或膜。在另一个方面，测试条或膜中半乳糖氧化酶的量也可以基于不同黏液或体液中标志物碳水化合物的浓度而改变。在另一个方面，测试条或膜还含有干培养基，并且一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可使半乳糖氧化酶活化。
[0090]
具有包埋的席夫试剂的半乳糖氧化酶测试条装置
[0091]
本公开内容提供了具有以下的装置：具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜以及具有半乳糖氧化酶试剂溶液的容器，其中半乳糖氧化酶试剂溶液最初不与测试条或膜接触。将样品和半乳糖氧化酶试剂溶液添加至测试条，并在席夫试剂活化之前进行反应。
[0092]
在一个方面，具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜还含有干培养基，其中一旦将样品添加到测试条或膜上，干培养基就可以活化。在另一个方面，测试条或膜中预包埋的席夫试剂是微囊化的。在另一个方面，测试条或膜中预包埋的席夫试剂可以通过在测试条或膜上添加数滴水或者通过在测试条或膜上添加黏液或体液来活化。在另一方面，测试条中预包埋的席夫试剂可以通过在添加样品之前、之后或同时将成孔剂添加至该条来活化。
[0093]
在一个方面，本公开内容涉及该装置用于筛选癌性或癌前病症的用途。癌性或癌前病症的类型是不受限制的，假定标志物碳水化合物存在于癌性或癌前病症(例如直肠、结肠、血液、淋巴结、胃、肾、胆囊、前列腺、睾丸、乳房、宫颈和卵巢)的黏液或体液中。
[0094]
在某些实施方案中，具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜还含有预包埋的半乳糖氧化酶。在这样的一些实施方案中，预包埋的半乳糖氧化酶在席夫试剂活化之前被活化，以使得样品与半乳糖氧化酶的反应在与席夫试剂的反应之前发生。
[0095]
包埋和包封
[0096]
如上所讨论的，在某些实施方案中，半乳糖氧化酶被预包埋到测试条或膜中。在一些实施方案中，半乳糖氧化酶被包埋在膜或测试条中、吸收在其中、包被在其上或直接浸渍在其中。在一些具体实施方案中，半乳糖氧化酶在被包埋、吸收、包被或浸渍在膜或测试条中之前被包封。
[0097]
在其中半乳糖氧化酶被包封或微囊化的一些实施方案中，包封材料可以用一种或更多种聚合物制成以提供试剂的控制、持续或立即释放。
[0098]
如上所述，在某些实施方案中，半乳糖氧化酶被预包埋入测试条或膜中。在一些实施方案中，席夫试剂被包埋在膜或测试条中、吸收在其中、包被在其上或直接浸渍在其中。在一些具体实施方案中，席夫试剂在被包埋、吸收、包被或浸渍在膜或测试条中之前被包封。
[0099]
在其中席夫试剂被包封或微囊化的一些实施方案中，包封材料可以用一种或更多种聚合物制成以提供试剂的控制、持续或立即释放。
[0100]
在某些实施方案中，包封材料可以按照caruso(phys.chem.chem.phys.，2011，13，4782)；sukhishvili(chem.mater.，2006，18(2)，328)；us20150164805；ep2213280或schwendeman(j control release.2014；196：60)的方法制备。用于制备包封材料的材料包括(但不限于)：乳化剂、具有不同熔点的材料、具有不同亲水/亲油平衡(hydrophilic/lipophilic balance，hlb)的材料、磷脂、脂肪酸、植物甾醇、脱水山梨醇酯、蜂蜡、巴西棕榈蜡、石蜡、硬脂酸盐/酯、虫胶、纤维素衍生物、麦芽糖糊精、淀粉、树胶、纤维素、聚吡咯、聚碳酸酯、十六烷基三甲基卤化铵、硅烷、二嵌段共聚物、三嵌段共聚物(例如聚(环氧乙烷)-嵌段聚(环氧丙烷)-嵌段-聚(环氧乙烷)，命名为p123(peo20ppo70peo20)和f127(peo106ppo70-peo1o6))、藻酸盐/酯、壳聚糖、黄原胶、多糖、多糖水凝胶、聚赖氨酸、聚丙烯酸、琼脂糖、peg、聚(甲基丙烯酸羟乙酯-甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸-共-丙烯酰胺)、聚(烯丙胺盐酸盐)、聚(苯乙烯磺酸钠盐)、聚-(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(乙烯亚胺)、n-羟基琥珀酰亚胺-peg、马来酰亚胺-peg-共轭磷脂(maleimide-peg-conjugated phospholipids)、石蜡、环糊精、羧甲基化多糖、聚己内酯、腐殖质、span 60、胆固醇、n-三甲基壳聚糖氯化物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚(n-异丙基甲基丙烯酰胺)、聚(n-正丙基丙烯酰胺)、羧甲基纤维素、塑料、金、分子量截止过滤器、混合有机/无机材料、金属氧化物、塑料、二氧化硅包括sba-15(pd)和mcm-41、陶瓷、黏土、近晶黏土(smectic clay)和泡囊(niosome)。
[0101]
在某些实施方案中，包封材料含有或随后被修饰以展示能够随后使用标准合成反应与膜或测试条反应的官能团。例如，在某些实施方案中，包封材料可包含氨基-烷基官能团、酯官能团、酰胺官能团或氨基甲酸酯官能团，其可与膜或测试条上的活性基团反应以提供试剂的固定。在文献中有许多已知的标准偶联方法，包括但不限于march(advanced organic chemistry，3rd edition，wiley，new york，1985)；odian(the principles of polymerization，2nd edition，wiley，new york，1981)和bioconjugate techniques(hermanson，g.t.，bioconjugate techniques；academic press：san diego，1996)。
[0102]
其他包封方法包括但不限于在us20160075976a1或us6258870b1中公开的那些方法，其各自通过引用并入本文。
[0103]
聚合材料
[0104]
用于作为包封材料并入的合适的热塑性聚合物包括但不限于：聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚酸酐、聚酰胺、聚氨酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、聚(苹果酸)聚合物、聚马来酸酐、聚(甲基乙烯基)醚、聚(氨基酸)、甲壳质、壳聚糖，以及上述材料的共聚物、三元共聚物或者组合或混合物。
[0105]
适合用于本发明的组合物和方法的生物可降解聚合物和低聚物的实例包括但不限于：聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、和聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(己内酯)、聚(苹果酸)、聚酰胺、聚酸酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚醚酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦嗪(polyphosphazine)、聚磷酸酯、聚酯酰胺、聚二烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚原碳酸酯、可降解聚氨酯、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、甲壳质、壳聚糖、氧化纤维素，以及任何上述材料的共聚物、三元共聚物、共混物、组合或混合物。
[0106]
如本文中使用的“疏水的”是指基本上不溶于水的聚合物。如本文使用的“亲水的”是指可以是水溶性的聚合物或者是指具有吸收水的亲和性(但当与疏水组分共价连接作为共聚物时通常不是这样)的聚合物，并且其将水吸引到装置中。
[0107]
适合于本文中使用的亲水性聚合物可以从本领域公知的多种商业、天然或合成来源获得。合适的亲水性聚合物包括但不限于：聚阴离子，其包括阴离子多糖例如藻酸酯/盐、琼脂糖、肝素、聚丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸盐、乙烯马来酸酐共聚物(半酯)、羧甲基直链淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基葡聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基甲壳质/壳聚糖、羧基纤维素、2，3-二羧基纤维素、三羧基纤维素、羧基阿拉伯胶、羧基卡拉胶、羧基果胶、羧基黄蓍胶、羧基黄原胶、羧基瓜尔胶、羧基淀粉、戊聚糖多硫酸盐、凝乳、肌醇六硫酸盐、β-环糊精硫酸盐、透明质酸、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸葡聚糖、硫酸肝素、卡拉胶、聚半乳糖醛酸、聚磷酸盐、聚醛碳酸、聚-1-羟基-1-磺酸-丙烯-2、共聚苯乙烯马来酸、间质聚糖(mesoglycan)、磺丙基化聚乙烯醇、硫酸纤维素、硫酸鱼精蛋白、磷瓜尔胶、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚氨基酸、及其任何衍生物或组合。本领域技术人员将理解也在本发明范围内的其他亲水性聚合物。
[0108]
适合于本文中使用的多种水溶性聚合物包括但不限于：聚(亚烷基二醇)、聚乙二醇(“peg”)、丙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(“pvoh”)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(亚烷基胺)、聚(环氧烷烃)、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇琥珀酸酯、甘油、环氧乙烷、环氧丙烷、泊洛沙姆(poloxamer)、烷氧基化共聚物、水溶性聚阴离子、及其任何衍生物或组合。另外，水溶性聚合物可具有任何合适的分子量，并且可以是支链或非支链的。
[0109]
根据期望的包封材料柔软度和柔性、试剂释放的速率和程度、降解速率等，可以改变聚合物的量和类型以产生所期望的结果。
[0110]
包封壳和浸渍层
[0111]
在某些实施方案中，聚合物形成可以在某些条件下和随时间呈现多孔的包封壳，从而控制释放。孔可以通过聚合物壳的溶胀或通过壳的溶解或降解而形成。
[0112]
每个包封壳/球体中聚合物的重量、体积和厚度也可以变化以调节并入试剂的释放速率。
[0113]
如本文中使用的术语壳/球体的使用是不限于包封材料的形状。尽管材料的形状通常为球形，但可以制备和利用锥形壳、管状壳、椭圆形壳、圆柱形棒等。在某些实施方案中，材料可以是无定形或不规则形状的。在某些另外的实施方案中，包封材料可以包被或结合至支架材料或色谱材料的表面。在这样的一些实施方案中，包封材料可采用其所结合的材料的形状。在其中色谱材料或支架材料是多孔的某些实施方案中，包封可以或可以不穿透下面材料的孔。
[0114]
在某些另外的实施方案中，聚合物可以用试剂浸渍并包被到膜或测试条的表面上。在这样的一些实施方案中，试剂与聚合物共混或混合，以使得试剂包埋、包封或浸渍到聚合物基质中。在这样的一些实施方案中，包封材料不形成离散的包封壳，而是含有试剂的包封材料可以作为层包被到膜或测试条上，并且任选地与其共价或离子键合。
[0115]
在某些实施方案中，包封材料可以是蜡、水凝胶、硅橡胶或海藻糖玻璃。水凝胶、硅橡胶和海藻糖玻璃的使用特别适合于将试剂浸渍到聚合物材料中，但是在这样的一些实施方案中可以使用任何合适的聚合物。
[0116]
在又一些实施方案中，试剂可以加载到多孔膜或测试条材料的孔中。在这样的一些实施方案中，一旦将试剂加载到多孔材料的孔中，多孔材料就可以用一种或更多种如本文中所述的聚合物包封材料包被。
[0117]
诱导释放
[0118]
包封的半乳糖氧化酶试剂可通过本领域普通技术人员可能已知的任何数量的方式从包封材料中释放。在本发明的某些实施方案中，可以通过使包封材料与成孔剂接触来诱导这样的释放。在本发明的另一些实施方案中，可以通过物理变化或化学变化来诱导释放。例如但不限于，可以通过改变温度、ph、离子电荷、反荷离子电荷或反荷离子原子来诱导释放。类似地，可以通过使包封材料与溶剂接触来诱导释放，溶剂包括但不限于有机溶剂、水性溶剂、脂肪族溶剂、芳香族溶剂、含氧溶剂(oxygenated solvent)或卤化溶剂或水。
[0119]
一般而言，试剂的释放速率将由技术人员基于所使用的膜或测试条来确定。在某些实施方案中，所期望的释放速率是即时的，而在另一些实施方案中，控制释放速率以使得试剂在一段时间内释放。在某些实施方案中，试剂在测试/工作流程的过程中被释放，以使得约100％的样品已被引入时释放约100％的试剂。在另一些实施方案中，试剂在测试/工作流程的过程中被释放，以使得约90％的样品已被引入时、约80％的样品已被引入时、约75％的样品已被引入时、约50％的样品已被引入时、或者约25％的样品已被引入时释放约100％的试剂。
[0120]
成孔剂
[0121]
可以使用其他添加剂以有利于进一步控制用于特定测试/工作流程方案的试剂的期望释放速率。例如，如果热塑性聚合物液体组合物太不透水，则可以添加成孔剂以在基质中产生另外的孔。任何相容的水溶性材料都可以用作成孔剂。这些试剂可以溶解在液体组合物中或仅仅分散在其中。其能够溶解、扩散或分散出凝结聚合物基质和形成的聚合物系统二者，并因此在基质和系统中产生孔和微孔通道。组合物中成孔剂的量(和这样的成孔剂的分散颗粒的尺寸，如果合适的话)将直接影响聚合物系统中孔的尺寸和数量。
[0122]
其他因素也可以影响聚合物系统中形成的孔的尺寸和/或直径。例如，有机溶剂的量和聚合物系统的固化速率都会影响聚合物系统的孔隙率。虽然根据本发明可以产生没有分解的核和皮(skin)的一般微孔基质，但通常，在没有另外的成孔剂的情况下，由液体组合物形成的聚合物系统由表面皮和内核构成。当与内核相比时，表面皮的多孔性通常较小，并且甚至相对无孔。内核可包含直径为约10至1000um的孔。用另外的成孔剂，核和皮的孔径变得基本均匀，以使得其都具有10至1000um范围的孔。
[0123]
组合物中成孔剂相对于热塑性聚合物的浓度将根据所期望的成孔程度而变化。通常，该浓度范围为约0.01至1gm成孔剂/gm聚合物。如果试剂可溶于液体组合物中，则试剂在液体组合物中的混合或分布以及热塑性塑料凝固时的聚集将决定试剂从聚合物基质中溶出时所得孔的尺寸。
[0124]
成孔剂包括任何这样的可药用有机或无机物质，其基本上可在水和体液中混溶，并且将从正在形成和已形成的基质中消散到水性介质或体液中；或与水不混溶的物质，其快速降解为水溶性物质。成孔剂可溶于或不溶于本发明的聚合物液体组合物中。在本发明的液体组合物中，还优选的是成孔剂可混溶或分散在有机溶剂中以形成均匀混合物。合适的成孔剂包括例如糖，如蔗糖和右旋糖；盐，例如氯化钠和碳酸钠；以及聚合物，例如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮。通过改变并入到聚合物系统中的成孔剂的分子量和百分比，可以在宽范围内改变孔的尺寸和程度。
[0125]
可以将其他赋形剂材料添加至装置以改变孔隙度，例如以下材料，如蔗糖、右旋糖、氯化钠、山梨醇、乳糖、聚乙二醇、甘露醇、果糖、聚乙烯吡咯烷酮或其适当组合。另外，活性剂可用油(例如，芝麻油、玉米油、植物)或其与磷脂(例如，卵磷脂)或中链脂肪酸甘油三酯(例如，miglyol 812)的混合物分散以提供油性混悬液。
[0126]
测试方法
[0127]
本公开内容提供了用于使用具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜与席夫试剂溶液，或使用半乳糖氧化酶与预包埋的席夫试剂快速检测对象中标志物碳水化合物的表达的方法。
[0128]
本公开内容还提供了用于使用具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜与席夫试剂溶液或使用半乳糖氧化酶与预包埋的席夫试剂快速测试人类癌性或癌前病症的方法。
[0129]
在一个方面，该方法包括以下步骤：将黏液或体液施加至具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜，通过与半乳糖氧化酶反应来使包含标志物碳水化合物的黏液或体液中的标志物碳水化合物氧化，以及使与测试条或膜相邻的具有席夫试剂溶液的容器活化以接触测试条或膜，并且其中席夫试剂溶液最初不与测试条或膜接触。
[0130]
在一个方面，该方法包括以下步骤：使黏液或体液与半乳糖氧化酶反应，以及使氧化的样品与具有预包埋的席夫试剂的测试条或膜接触，以及使测试条或膜中的席夫试剂溶液活化以接触样品。
[0131]
在一些实施方案中，该方法包括选自以下的一个或更多个步骤：在将黏液或体液施加至测试条或膜之前将水施加到测试条或膜上，在使具有席夫试剂溶液的容器活化之前通过洗涤来去除黏液或体液，在使席夫试剂溶液接触测试条或膜之后用自来水洗涤测试条或膜，干燥测试条或膜，和/或评价测试条或膜的颜色。
[0132]
在一些实施方案中，该方法包括选自以下的一个或更多个步骤：在将黏液或体液
施加至测试条或膜之前将水施加到测试条或膜上，在使席夫试剂活化之前通过洗涤来去除黏液或体液，在使席夫试剂接触样品之后用自来水洗涤测试条或膜，干燥测试条或膜，和/或评价测试条或膜的颜色。
[0133]
在一个方面，通过与半乳糖氧化酶反应来使黏液或体液中的标志物碳水化合物氧化的时段没有特别限制。例如，氧化时段可以为3至30分钟、5至20分钟、7至15分钟或8至12分钟。在另一个方面，使席夫试剂溶液接触测试条或膜的时段没有特别限制。例如，接触时段可以为0.2至10分钟、0.5至5分钟、0.8至3分钟或1至2分钟。
[0134]
在另一个方面，活化席夫试剂溶液(以在标志物碳水化合物经半乳糖氧化酶氧化之后，接触测试条或膜)的机制是不受限制的。在一个方面，该机制可以是扭转阀、可破坏屏障等，其中在打开扭转阀或破坏屏障之后，席夫试剂溶液接触测试条或膜。可破坏屏障的材料是不受限制的，并且可破坏屏障可以由塑料、玻璃或任何适合于液体容器的材料制成。
[0135]
测试试剂盒
[0136]
使用简单的测试试剂盒以常规方式包装在纸板箱中，试剂盒含有：(a)加盖的小瓶，其含有根据下文制备方法制备的一定量的储存稳定的碱性品红，足以饱和两次；(b)膜过滤器(metricel膜过滤器0.46μm，gelman sciences，inc.，ann arbor，michigan)条。试剂盒中还存在(c)一定量的储存稳定形式的半乳糖氧化酶，其存在于试剂盒中的密封盖瓶中，所述半乳糖氧化酶浸渍在膜过滤器条中，其量足以氧化样品中的标志物碳水化合物。还提供了(d)高碘酸和(e)用于比较测试结果及其解释的比色图。
[0137]
出于现场测试的目的，所述试剂盒含有多个膜过滤器条，例如5、10、50、100个或更多，并且半乳糖氧化酶、缓冲溶液和碱性品红溶液的量成比例地增加。
[0138]
本公开内容提供了用于使用具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜与席夫试剂溶液快速检测对象中标志物碳水化合物的表达的筛选试剂盒。
[0139]
本公开内容还提供了用于快速测试人癌性或癌前病症的筛选试剂盒，其含有具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜和具有席夫试剂溶液的容器。
[0140]
在一个方面，具有预包埋的半乳糖氧化酶的测试条或膜还含有干培养基，其中一旦将水添加到测试条或膜上，干培养基可活化半乳糖氧化酶。在另一个方面，测试条或膜中预包埋的半乳糖氧化酶是微囊化的。
[0141]
本公开内容也提供了用于使用具有半乳糖氧化酶和预包埋的席夫试剂的测试条或膜快速检测对象中标志物碳水化合物之表达的筛选试剂盒。
[0142]
本公开内容还提供了用于快速测试人癌性或癌前病症的筛选试剂盒，其包含具有半乳糖氧化酶和预包埋的席夫试剂的测试条或膜。
[0143]
在一个方面，测试条或膜中预包埋的席夫试剂是微囊化的。
[0144]
在一个方面，本公开内容涉及测试试剂盒用于筛选癌性或癌前病症的用途。癌性或癌前病症的类型是不受限制的，只要标志物碳水化合物存在于癌性或癌前病症例如直肠、结肠、血液、淋巴结、胃、肾、胆囊、前列腺、睾丸、乳房、宫颈和卵巢的癌性或癌前病症的黏液或体液中。
[0145]
没有显示出癌性或癌前病症明显体征或症状的群体
[0146]
在一些具体实施方案中，本发明提供了用于监测患有癌症并接受治疗的个体的疾病复发的工具。研究显示，53名结肠癌患者中有32名(60％)在肿瘤切除之后对该标志物呈
阳性。在这32名患者中，有5名(16％)在术后一年内持续存在阳性肿瘤复发。因此，用标志物和测试监测术后患者将允许医生在早期识别复发性癌症，并制定适当的管理。
[0147]
在另一个实施方案中，在没有肺癌体征和症状的28名个体中，发现21人为阳性，其中15名患者在进一步病情检查中被确定患有肺癌。因此，监测检测呈阳性的个体对于及早识别疾病非常重要。
[0148]
在动物模型和人疾病中结肠癌的病理学和发病机制的比较和相关研究导致了“场效应”理论的概念化和癌变早期表达的标志物的识别。这个同化的知识体系已导致开发了用于结肠癌筛选的简单直肠黏液测试，所述测试也可用于筛选其他上皮癌。标志物半乳糖-n乙酰基半乳糖胺(gal-galnac)在患有结肠癌患者的直肠黏液或癌前病灶中表达，并通过酶促氧化(10分钟)随后显色反应(1分钟)进行检测。该测试的高灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值以及成本效益使其成为我们早期检测从而控制结肠癌策略中的一个很好的工具。该标志物在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宫癌、胰腺癌中的类似表达使其成为潜在有用的一般癌症筛选测试。由于其高准确性(例如，与粪便隐血测试相反)和成本效益(例如，与胸部x光片相比)，它将减少不必要的结肠镜检查和其他昂贵程序的数量，从而降低对社会的国家总医疗保健费用。
[0149]
在来自81例乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌和子宫内膜癌和52例各自正常对照的总共133个组织样品中确定gal-galnac的表达。52例正常组织(胃的15例除外)均无gal-galnac表达。相比之下，100％的来自乳房(19例中的19例)、卵巢(15例中的15例)和胰腺(6例中的6例)的腺癌和94.1％的胃癌(17例中的16例)和91.7％(12例中的11例)的子宫腺癌表达gal-galnac。另外，65例前列腺癌中的62例(95.4％灵敏度)表达了所述标志物，而35种前列腺良性增生中没有一例(100％特异性)表达所述标志物。乳房、支气管、子宫内膜和胰管中的癌附近(“区域”内)的正常上皮细胞及其分泌物也表达gal-galnac，而从非癌个体获得的正常组织完全无反应。因此，得出的结论是，半乳糖氧化酶-席夫序列识别的肿瘤标志物gal-galnac不仅在多种腺癌中高表达，而且在明显表现正常的上皮细胞及其附近或甚至远离癌的分泌物中也有高表达。
[0150]
腺癌是产生黏液的肿瘤。令人惊讶的是，发现所述标志物也在患有非腺癌的癌症的个体咳出的痰中表达；这些癌症，例如鳞状细胞癌、小细胞未分化癌(又名燕麦细胞癌)、大细胞未分化癌等，不产生黏液。本领域普通技术人员不会预期或不理解在这些非黏液分泌性癌症的痰样品中存在标志物。
[0151]
在一项研究中，123名患有鳞状细胞癌患者中的113名(91.9％)和19名患有小细胞未分化癌患者中的16名(84.2％)出乎意料地在咳出的痰中表达了该标志物。
[0152]
多种类型的肺癌对gal-galnac的表达：
[0153]
诊断表达标志物的患者/总(％)鳞状细胞癌113/123(91.9％)腺癌36/40(90％)小细胞(燕麦细胞)未分化癌16/19(84.2％)
[0154]
同样，除了产生黏液的腺癌之外，头颈区域的癌症还包括很大比例的非产生黏液的鳞状细胞癌。患有癌症或癌前病变的那些人的唾液会表达标志物。
[0155]
关于本发明的试剂盒方面，出乎意料地发现，如果不遵循在制备之后将试剂与活
性炭混合然后冷藏的普遍接受的用于生产席夫试剂的技术，则可以容易且可再现地生产在室温下储存稳定数月的溶液。该方法使颜色反应比使用常规席夫试剂所获得的颜色反应更强烈。根据本发明的技术，首先在不存在活性炭的情况下将席夫碱例如在约0℃至15℃、优选约0℃至10℃下冷藏例如持续1天、2天或更多天(通常约48小时)，直至其颜色褪色至稻草色(straw shade)。在溶液褪色至稻草色之后，然后用活性炭或类似表面活性吸收剂对其进行处理，例如通过搅拌进行处理，例如在室温下持续约几分钟至几小时或几天。在去除炭(例如通过过滤)之后，将席夫试剂填充到体积适合于进行试剂盒设计的测试次数(例如1次、5次、10次、50次、100次或更多次)的小瓶或瓶中。虽然本文公开的筛选方法和试剂盒是使用席夫试剂描述的，但本领域普通技术人员应理解，在一些实施方案中，在不脱离本公开内容范围的情况下，功能与席夫试剂基本相同或相似方式的材料也可用于着色、染色或以其他方式标记样品。
[0156]
在本发明的另一方面，该检测方法用于对多个个体的任何癌性或癌前病症进行现场测试。当进行其步骤时，优选仅对那些对标志物糖类测定呈阴性的样品进一步测试任何糖类。或者，可以将每个样品分成两部分，第一部分测定标志物糖类，后者测定可氧化成醛糖部分的任何其他糖类，从而允许同时进行诊断程序和假阴性测试，从而进一步缩短能够报告生物学阴性测试结果所需的时间。
[0157]
进一步关于本发明的速度方面，如从下文的实施例中证明的，标志物糖类的测定可以比来自上述美国专利no.4,857,457和本人在human pathology中的出版物中远远更快速地进行，包括假阴性测试在内的整个测试程序可以在样品采集之后少于半小时内完成，例如在约15分钟至20分钟内完成。这使测试医师或实验室能够在个体离开测试区域之前报告测试结果(或在获得生物学阴性结果时采集另一个样品)。
[0158]
通过用仅会将糖蛋白中存在的糖类中的半乳糖部分的伯羟基氧化成醛基的半乳糖氧化酶或相当的氧化剂选择性氧化黏液样品中的糖蛋白来检测样品中的标志物糖类。然后可以用席夫试剂(例如，形成洋红色的碱性品红)使所得醛基显现。样品可以为直肠黏液、咳出的痰、乳头抽吸物、宫颈内黏液、前列腺按摩分泌物、胰管或胆管分泌物。
[0159]
半乳糖部分标志物糖类在室温下被半乳糖氧化酶例如在少于约15分钟(例如约5分钟至10分钟)内快速(并且在升高的温度直至酶的失活温度下甚至更快)地选择性氧化成醛糖部分。可采用当使用这种酶时本领域公知的酶与底物的比率和适合于活化该酶的载剂。
[0160]
然后在进行或不进行首先去除或灭活半乳糖氧化酶的情况下，用使由此产生的醛糖部分显现或允许其显现的试剂(例如，品红、蔷薇苯胺、洋红或其他席夫碱脱色染料)对氧化的样品进行处理。
[0161]
可以通过用半乳糖氧化酶选择性氧化其中的半乳糖部分，然后用碱性品红使由此产生的醛糖显现来测定标志物碳水化合物。还可以采用凝集抑制测试来对其进行测定，例如使用大约化学计量的花生凝集素、木菠萝素(jacalin)、麦胚凝集素或其他合适的凝集素，通过使其与缀合有另一种酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)的亲和素反应，通过检测生物素化凝集素的存在并检测复合物。类似地，可以根据标准elisa测定，使用针对标志物的一抗，然后与缀合有酶的二抗反应，并通过染料进行检测来检测标志物。
[0162]
生物学流体样品中的标志物糖类还可以通过敏化珠的聚集来检测。
[0163]
本发明的目的、特征和优点是在其一个方面体现为通过提供快速、关于假阴性可靠的和商业上可行的方法以用于在人中检测癌前或癌性病症的存在。本发明采用这样的测试方法，其包括获得直肠黏液样品，测定样品以检测在其中以下标志物碳水化合物中的至少一种的存在：β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac、fuc-α-1
→
2 gal-β(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac、fuc-α-1
→
2 gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1＞4)-glcnac和
[0164]
fuc-α-1
→
2-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac-β-(1
→
3)-gal-β-(1
→
4)-fuc-α-1
→
3-glcnac；以及，任选地，基于在直肠黏液中检测到的标志物碳水化合物的量来诊断前癌或癌的存在和程度。除了本发明中的使得测试程序快速、关于假阴性方面可靠并且商业上可行的的修改之外，该测试方法是在美国专利no.4,857,457和1988年8月5日提交的先前提交的美国专利申请序列no.07/228,468中公开的那些，其公开内容通过引用并入本文。
[0165]
在一个实施方案中，可以通过使体液与精确量的花生凝集素或其他特异性结合部分如凝集素(pna、jac、aca、sna、srl、wga、半乳糖凝集素-3等)，和/或任何合适的针对糖类的抗体反应，然后检测未结合部分的存在来进行测定。可以将反应物部分固定在水不溶性支持物上，例如膜过滤器或胶乳、塑料、玻璃的固体珠等。为了提高方法的灵敏度，可以首先将反应物部分以常规方式生物素化。
[0166]
复合物可以通过任何多种合适的技术(例如免疫学、酶促、氧化-还原等)直接或间接地进行检测。目前，优选的是与缀合有合适标志物(例如，品红或其他染料、放射性标记、荧光染料如异硫氰酸荧光素或罗丹明b、发光染料如荧光素、鲁米诺、生物素等)的亲和素形成复合物。
[0167]
二糖β-d-gal-(1
→
3)-galnac的存在容易通过用pna、jac、srl、wga、aca、sna、半乳糖凝集素-3等包被的敏化珠(例如，玻璃、琼脂糖、聚苯乙烯、胶乳等)的聚集来检测。用于检测复合物的存在的优选方法是通过将糖类的半乳糖部分例如用半乳糖氧化酶选择性氧化成醛二糖，并检测由此氧化的醛糖部分的存在。
[0168]
在一方面，该测定性测试检测对象(例如大肠)的与癌性或癌前病症相关的特异性生化变化，该变化导致产生二糖β-d-gal-(1
→
3)-d-galnac(也称为t抗原或tf抗原)，其在正常个体的体液中不存在，但存在于具有至少一些癌性和癌前病症的个体的直肠黏液中。shamsuddin等开发了多种用于以简单且廉价的方式检测这种糖部分的技术(但不如本发明中采用的方法或者允许使用储存稳定的品红或消除假阴性的方法快速)，这些技术可以用于一般性地筛选个体的大肠疾病，包括癌症。
[0169]
凝集素、花生凝集素(pna)与t抗原特异性结合并导致t抗原活化的rbc的凝集。利用pna的这些特性，最初开发了其中体液样品中的t抗原会与pna结合，因此pna不会与rbc反应，并因此红细胞不会凝集的简单的抑制测定。该测试非常简单，并且可以快速进行。使用微量滴定板可以在短时间内筛选大量样品。半乳糖氧化酶测试可以方便地在膜过滤器的条上进行。
[0170]
由于并非所有的癌性和癌前病症都以相同比例产生本文确定的所有标志物碳水化合物，因此在本发明的一个实施方案中，多于本文描述的一种测定性测试被用于测试作为特异性癌性或癌前病症而筛选的个体的多个蛋白质体液样品。
[0171]
除了癌性病症，本发明的方法中使用的测试还可以检测结肠的其他疾病，包括携
带癌症高风险的疾病，例如息肉、瘘管、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
[0172]
在一个实施方案中，测试生物学流体的标志物碳水化合物作为任何癌性或癌前病症的存在的第一步筛选测试。如果筛选测试呈阳性，则将测试通过非侵入性方法容易地获取的其他蛋白质体分泌物作为靶向特定器官中癌症或前癌的筛选方法的第二步。
[0173]
其他一些特性，例如pna或其他合适的凝集素在水不溶性支持物上的固定、糖缀合物的免疫学检测、或糖部分的氧化、以及通过染料、放射化学物质进行的检测等，可用于开发另外的测定。在免疫测定中使用针对该糖部分的抗体能够精确预估并监测直肠黏液以及其他体液中的该部分。在免疫测定中，可以通过放射性荧光或其他合适的标记对抗体进行靶向，以用于定量或半定量检测。
[0174]
亲和素，一种糖蛋白(67,000mw)，对维生素生物素具有极高的亲和力。由于生物素分子可以与各种蛋白质偶联(生物素化)，亲和素可以与多种标记物例如酶、染料、重金属、放射性同位素等缀合。亲和素具有四个生物素结合位点，并且许多生物素分子可以并入给定的蛋白质上。这种扩增原理可用于检测在直肠指检期间获得的直肠黏液的糖蛋白中的微量(即，ng/ml或甚至pg/ml)标志物二糖。包含特异性二糖的黏液糖蛋白将与固定在固相上的凝集素紧密结合。由生物素化凝集素和酶-亲和素d缀合物形成的基质将与固定的糖蛋白凝集素上的残留二糖结合，同时合适的底物将扩大该反应。
[0175]
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员可以使用前面的描述来最大限度地利用本发明。因此，以下优选的具体实施方案应被解释为仅是举例说明性的，而无论如何不以任何方式限制本公开内容的其余部分。
[0176]
在前述和以下实例中，所有温度均以摄氏度阐述而未经校正，除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。上文和下文引用的所有申请、专利和出版物(如果有的话)以及相关申请的全部公开内容在此通过引用并入。
[0177]
在本文描述的所有测试中，应佩戴无菌手套；镊子、剪刀和所有工作台面都应严格清洁，膜过滤器应使用镊子进行操作，并且过滤器不能被污染(甚至唾液也可能污染)。
[0178]
实施例
[0179]
实施例1-从对象中采集黏膜刮擦样品。将刮擦样品与蒸馏水或反渗透水混合并施加至具有浓度为100u/ml的预包埋的半乳糖氧化酶的测试条上。使样品在测试条上保持10分钟，之后用另外的蒸馏水冲洗测试条。在单独的容器中，使席夫试剂在溶液中活化，之后将溶液添加至测试条。使样品与席夫试剂保持接触1分钟，之后用水冲洗测试条并在露天或烘箱中干燥。图2提供了测试样品处理的描述。颜色变化(从白色或无色到洋红)指示存在碳水化合物标志物。
[0180]
实施例2-从对象中采集黏膜刮擦样品。将刮擦样品与蒸馏水或反渗透水混合并添加至浓度为100u/ml的半乳糖氧化酶溶液中。使样品与半乳糖氧化酶保持接触10分钟，该点之后将样品添加至具有预包埋的席夫试剂的测试条中。用另外的蒸馏水冲洗测试条，之后使席夫试剂活化并使其与样品保持接触1分钟，之后用水冲洗测试条并在露天或烘箱中干燥。图3提供了测试样品处理的描述。颜色变化(从白色或无色到洋红)指示存在碳水化合物标志物。
[0181]
实施例3-按照上述半乳糖氧化酶条测试的程序，对患有大肠或其他身体部位的已知癌性或癌前病症或者未表现出癌症或前癌的任何明显体征或症状的382名个体的直肠黏
液进行测试。术语“其他身体部位”包括但不限于子宫、子宫颈、肾脏、头颈、卵巢、乳腺、淋巴结、胃、睾丸、前列腺、肺、胆囊、肝和胰腺。
[0182][0183]
第一行中的数据是每个类别中测试呈阳性的个体数/个体总数。应注意，仅5％的表面上健康的个体引发阳性反应。
[0184]
根据本发明，通过直肠指检获得每个个体的黏液样品，其中用生理盐水或用于这样的程序的其他常用润滑剂对戴手套的手指进行润滑。将检查手指上的黏液涂抹在蛋白质捕获膜过滤器上，在环境温度(25℃)下与半乳糖氧化酶反应10分钟，用去离子蒸馏水洗涤，与碱性品红反应1分钟，然后在自来水中洗涤1分钟。癌性或癌前病症的存在通过样品区域的粉红色、洋红色或紫色着色来指示。然后将该测试中因不存在品红色着色而测试呈阴性的各个样品与高碘酸反应5分钟，用去离子蒸馏水洗涤并与碱性品红再次反应1分钟并用自来水洗涤。引发粉红色到紫色到洋红色的阳性反应指示这样的事实：确实已获得黏液糖蛋白，但针对其中标志物碳水化合物的存在是阴性的。不存在粉红色、洋红色或紫色着色意味着采样错误，并用新的黏液样品对个体再次进行测试。
[0185]
在采用上述技术的另外的独立研究中，直肠黏液、半乳糖氧化酶和碱性品红的阳性测试表明存在9/11的胃癌，4/4的肝癌、胆囊癌、胆总管癌和胰腺癌，以相同方式，在另一项研究中，12/18的患有胃癌、胰腺癌和肝癌的患者得到阳性测试结果。在另一些研究中，患有卵巢癌、乳腺癌或胃癌的个体的直肠黏液测试为标志物蛋白呈阳性。
[0186]
本发明方法的预期等同方案是其作为采用前列腺液、射液、乳腺分泌物、阴道黏液、咳出的痰、胰腺和胆管分泌物来分别检测前列腺、乳腺和子宫颈和/或卵巢、肺、胰腺、肝和胆管的癌性或癌前病症的初级筛选测试的用途，以及代替半乳糖氧化酶的另一种半乳糖部分特异性氧化剂的用途。
[0187]
实施例4-血细胞凝集抑制测试-例如，如美国专利no.4,857,457中所述的标准血细胞凝集抑制测试可用于本发明中采用的标志物碳水化合物测试。
[0188]
与常规粪便潜血测试中相比，在该测试的典型结果中，未获得假阴性，且获得少得多(约三分之一相对于约95)的假阳性。根据本发明，通过测试样品的糖蛋白含量，阴性测试结果被用于检查适当的黏液采样程序。
[0189]
实施例5-胶乳凝集试验-在该测试中，将500μl悬浮的胶乳珠(15.8μ直径，sigma chemical co.，st.louis，mo)以3,000rpm离心15秒并倾析上清液。将500μg凝集素例如pna(vector laboratories ltd.，burlingame，calif.)溶解在500μl碳酸盐缓冲液(ph 9.6)中并添加至胶乳珠沉淀中。将沉淀重悬并在25℃下孵育2小时，伴随偶尔轻微摇动以使珠重悬并实现更均匀的结合。在孵育之后，将样品以3,000rpm离心15秒，倾析上清液，并将沉淀重
悬于pbs(ph 7.4)中。通过重复前一步骤3次洗去任何未结合的pna。将最终的沉淀在pbs中悬浮并稀释1∶10。
[0190]
为了测试在直肠指检期间采集的黏液样品，将10μl在pbs中的黏液添加至等量的胶乳珠中并放置在载玻片上。在25℃下孵育5分钟之后，读取载玻片。指示存在标志物二糖的珠的凝集被读取为癌性病症呈阳性，而5分钟之后未凝集指示不存在二糖并因此处于无癌状态或者采样错误。根据本发明，通过测定黏液样品的糖蛋白含量消除后一种可能性。
[0191]
实施例6-生物素化凝集素亲和素-酶测定-将植物凝集素例如pna、jac、aca、sna、srl、wga溶解在碳酸盐缓冲液(ph 9)中至终浓度为100ng/ml，并用于盖上微量滴定孔。将100μl缓冲液中的10ng凝集素放置在每个孔中，并在37℃下孵育2小时。然后用ph 7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗去孔，之后将100μl测试黏液(溶解在pbs中)添加至微量滴定孔中，并将混合物在37℃下孵育1小时。然后将孔用pbs洗涤3次以去除100μl未结合的黏液。将生物素化凝集素(1μg/ml)在37℃下孵育另外1小时以与残留的标志物碳水化合物(如果有的话)结合。将孔用pbs洗涤3次以洗去未结合的生物素化凝集素。然后将亲和素-d-碱性磷酸酶(vector corporation，burlingame，calif)添加(100μl/孔，1∶50稀释)到孔中并在37℃下孵育1小时。在用pbs洗涤2次并用碳酸氢盐缓冲液(ph 9.8)洗涤3次之后，向孔中添加底物磷酸对硝基苯酯(1mg/ml)(100μl/孔)。在37℃下孵育30分钟之后读取405nm处的吸光度。来自已知癌症患者的黏液得到阳性结果，而来自非癌症患者的黏液得到阴性结果。
[0192]
在另一个实施例中，将样品施加到硝酸纤维素过滤器上，并用3％bsa-pbs处理1小时。之后，将过滤器与浓度为1μg/ml的缀合有过氧化物酶的花生凝集素(pna，sigma，st.louis，mo)在0.1％bsa-pbs中孵育1小时；每个过滤器使用10ml pna溶液。将过滤器用0.1％bsa-pbs洗涤三次(每次10分钟)，并单独用pbs洗涤一次。然后在0.15％h2o2的存在下使用0.6mg/ml pbs的氯萘酚(sigma)作为底物，并在室温下显影10分钟。紫色沉淀指示阳性染色。使用计算机辅助图像分析程序来评估染色以评价pna阳性。
[0193]
实施例7-使用抗gal-galnac抗体的免疫测定-将针对gal-galnac(也称为tf抗原)的单克隆抗体施加至nunc 96孔板。将100ul样品在含有0.1％吐温20的tbs中洗涤并用含有2％牛血清白蛋白的溶液封闭之后进行添加，并在室温下孵育4小时。将生物素化去唾液酸胎蛋白(tf的标准来源)在含有0.1％吐温20的tbs中洗涤之后进行添加。将经洗涤的孔与亲和素/过氧化物酶复合物一起孵育，并通过在2，2-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)液体底物体系中孵育来测量过氧化物酶活性。用elisa读板器在405nm处读取吸光度。通过将吸光度值与使用不同稀释度的生物素化去唾液酸胎蛋白完成的标准曲线进行插值来确定gal-galnac(tf)的浓度。
[0194]
通过用本发明的一般或具体描述的反应物和/或操作条件替换前述实施例中使用的反应物和/或操作条件，可以同样成功地重复前述实施例。
[0195]
通过引用并入
[0196]
本文引用的所有专利、公开的专利申请和其他参考文献的全部内容在此通过引用整体明确地并入本文。
[0197]
等同方案
[0198]
本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验来确定本文描述的具体实施方案和方法的许多等同方案。这样的等同方案旨在涵盖在所附权利要求书的范围内。
[0199]
应当理解，本文描述的详细实施例和实施方案仅出于举例说明性目的而以实例的方式给出，决不被认为是对本公开内容的限制。根据其的各种修改或变化将被建议给本领域技术人员并且包括在本技术的精神和范围内并且被认为在所附权利要求书的范围内。例如，可以改变成分的相对量以优化期望的效果，可以添加另外的成分，和/或可以用类似成分替换一种或更多种所述成分。与本公开内容的系统、方法和过程相关的另外的有利特征和功能将从所附权利要求书中显而易见。此外，本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文描述的公开内容的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被所附权利要求书涵盖。