生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、丙酮酸，又称2-氧代丙酸或乙酰甲酸，为浅黄色至黄色的透明液体，有酸味。丙酮酸分子结构中含有活化酮和羧基基团，是一种基本的化工原料，广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域。丙酮酸是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，广泛参与生物体内糖、脂肪、蛋白质的代谢过程。另外，丙酮酸也是一些高附加值化学品的合成前体，例如d/l-丙氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、左旋多巴、n-乙酰-d-神经氨酸等产品(krzysztof cybulski，ludwika tomaszewska-hetman，magdalena rakicka，piotrjuszczyk，anitaproduction of pyruvic acid from glycerol by yarrowialipolytica.folia microbiol.2019，64(6)：809-820.)。

2、目前，工业上可通过化学合成和微生物发酵等方法生产丙酮酸。化学合成法主要以酒石酸或乳酸为原料，在高温高压条件下或通过金属催化剂催化合成丙酮酸。化学合成法反应条件苛刻、污染严重、转化率低、生产成本高，难以满足目前工业生产要求。微生物发酵法具有发酵条件温和、绿色可持续、转化率高、成本低的特点，因而更具有市场竞争优势。

3、通过代谢工程技术对丙酮酸合成途径进行改造，已经在多种微生物中实现了丙酮酸的发酵合成，例如大肠杆菌(escherichia coli)(yihui zhu，mark a eiteman，ronnialtman，elliot altman.high glycolytic flux improves pyruvate production by ametabolically engineered escherichia coli strain.appl environ microbiol.2008，74(21)：6649-55.)、产酸克雷伯氏菌(klebsiella oxytoca)(高超，曹梦豪，马翠卿，许平.一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法.山东大学，cn202010441899.6.)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(李亿，王青艳，秦艳，朱婧，梁戈，彭龙云，潘丽霞.一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法.广西科学院，cn201910358778.2.)、光滑球拟酵母(candida glabrata)(zhengshan luo，weizhu zeng，guocheng du，jian chen，jingwen zhou.enhancement of pyruvic acid production incandida glabrata by engineering hypoxia-inducible factor 1.bioresourtechnol.2020，295：122248.)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)(krzysztofcybulski，ludwika tomaszewska-hetman，magdalena rakicka，piotr juszczyk，anitaproduction of pyruvic acid from glycerol by yarrowialipolytica.folia microbiol.2019，64(6)：809-820.)等等。但是利用这些微生物发酵生产丙酮酸的周期长，产酸速率低，例如生长速率较快的大肠杆菌发酵周期也达到44h(yihuizhu，mark a eiteman，ronni altman，elliot altman.high glycolytic flux improvespyruvate production by a metabolically engineered escherichia colistrain.appl environ microbiol.2008，74(21)：6649-55.)，产酸克雷伯氏菌的发酵周期为42h(高超，曹梦豪，马翠卿，许平.一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法.山东大学，cn 202010441899.6.)，而酿酒酵母的发酵周期长达76h(李亿，王青艳，秦艳，朱婧，梁戈，彭龙云，潘丽霞.一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法.广西科学院，cn 201910358778.2.)。菌种的发酵周期长，导致丙酮酸的生产成本较高。

4、需钠弧菌(vibrio natriegens)是一种生长十分快速的海洋细菌，繁殖一代最快只需9.4min，属于兼性厌氧型的革兰氏阴性菌。需钠弧菌具有底物利用速率快、底物谱广、对人体无致病性危害等优点，是近几年发展起来的一种应用于合成生物学领域的新型底盘细胞。目前，利用代谢工程技术改造需钠弧菌，通过发酵生产丙酮酸的方法尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法。

2、本发明提供了一种需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法，包括对出发需钠弧菌进行如下改造，获得所述需钠弧菌基因工程重组菌株：

3、a8、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。

4、可选地，根据上述的构建方法，还包括对出发需钠弧菌进行如下至少一种改造：

5、a1、抑制或降低噬菌体基因簇vpn2表达；

6、a2、抑制或降低噬菌体基因簇vpn1表达；

7、a3、抑制或降低丙酮酸甲酸裂解酶pflb基因表达或降低丙酮酸甲酸裂解酶的含量或抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性；

8、a4、抑制或降低l-乳酸脱氢酶lldh基因表达或降低l-乳酸脱氢酶的含量或抑制l-乳酸脱氢酶的活性；

9、a5、抑制或降低d-乳酸脱氢酶dldh基因表达或降低d-乳酸脱氢酶的含量或抑制d-乳酸脱氢酶的活性；

10、a6、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸合酶的活性；

11、a7、抑制或降低丙酮酸脱氢酶复合体基因表达或降低丙酮酸脱氢酶复合体的含量或抑制丙酮酸脱氢酶复合体的活性；

12、可选地，根据上述的构建方法，

13、a1通过敲除基因组上的vpn2实现；

14、a2通过敲除基因组上的vpn1实现；

15、a3通过敲除pflb基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸甲酸裂解酶失活实现；

16、a4，通过敲除lldh基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致l-乳酸脱氢酶失活实现；

17、a5通过敲除dldh基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致d-乳酸脱氢酶失活实现；

18、a6通过单敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因中的pps1基因或pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变，或通过双敲除pps1基因和pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸合酶失活实现；

19、a7通过在丙酮酸脱氢酶复合体e1亚基acee基因起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件而下调acee基因的表达，和/或将acee基因起始密码子替换为稀有起始密码子导致丙酮酸脱氢酶复合体的表达水平或酶活力降低，和/或敲除acee基因全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸脱氢酶复合体失活实现；

20、a8、通过在ppc基因起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件而下调ppc基因的表达，和/或将ppc基因起始密码子替换为稀有起始密码子导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达水平或酶活力降低，和/或敲除ppc基因全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶失活实现。

21、可选地，所述出发菌株需钠弧菌为cicc 10908(同atcc 14048、nbrc 15636、dsm759、cgmcc 1.8729)。该菌株可通过自中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，是需钠弧菌模式菌株。

22、所述vpn2核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016345.1(更新时间2016年7月1日)region：1377202-1416553序列所示。

23、所述vpn1核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016345.1 region：1939907-1965683序列所示。

24、所述pflb基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016345.1 ba890_04895的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq12121.1的序列。

25、所述lldh基因核苷酸可如ncbi上登录号为cp016346.1(更新时间2016年7月1日)ba890_20645的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq15126.1的序列。

26、所述dldh基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016346.1 ba890_20630的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq15124.1的序列。

27、所述pps1基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016346.1 ba890_21310的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq15250.1的序列。

28、所述pps2基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016346.1 ba890_16635的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq14383.1的序列。

29、所述人工合成调控元件可为命名为p2和/或p6和/或p10的人工合成调控元件，所述p2核苷酸序列如seq id no：29所示，所述p6核苷酸序列如seq id no：30所示，所述p10核苷酸序列如seq id no：31所示。

30、所述稀有起始密码子可为gtg或ttg。

31、所述acee基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016345.1 ba890_11935的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示，其编码蛋白如ncbi上登录号为anq13452.1的序列。

32、所述ppc基因核苷酸序列可如ncbi上登录号为cp016345.1 ba890_13260的序列或与其同源性大于90％的其他登录号序列所示其编码蛋白如ncbi上登录号为anq13668.1的序列。

33、本发明还提供了上述的构建方法构建的需钠弧菌基因工程重组菌株。

34、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr01的菌株，所述pyr01通过对所述出发需钠弧菌进行a1改造获得的菌株。

35、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr01的构建是通过敲除需钠弧菌cp016345.1基因组上的噬菌体基因簇vpn2，降低发酵过程中内源溶原性噬菌体爆发的风险。

36、示例性地，利用同源重组方法敲除vpn2。例如，敲除vpn2所用同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：1至seq id no：4所示。

37、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr02的菌株，所述pyr02通过对所述出发需钠弧菌进行a1和a2改造获得的菌株。

38、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr02的构建是在pyr01菌株基础上，通过敲除需钠弧菌cp016345.1基因组上的噬菌体基因簇vpn1，降低发酵过程中内源溶原性噬菌体爆发的风险。

39、示例性地，利用同源重组方法敲除vpn1。例如，敲除vpn1所用同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：5至seq id no：8所示。

40、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr06的菌株，所述pyr06通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2和a3改造获得的菌株。

41、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr06的构建是在pyr02菌株基础上，通过敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflb)的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸甲酸裂解酶失活，从而阻断代谢副产物甲酸合成途径。

42、示例性地，利用同源重组方法敲除pflb全部或部分编码框序列或对其进行移码突变。例如，采用敲除pflb全部编码框序列的方式，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：9至seq id no：12所示。

43、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr07的菌株，所述pyr07通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2、a3和a4改造获得的菌株。

44、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr07的构建是在pyr06菌株基础上，通过敲除l-乳酸脱氢酶基因(lldh)的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸甲酸裂解酶失活，从而阻断代谢副产物l-乳酸合成途径。

45、示例性地，利用同源重组方法敲除lldh全部或部分编码框序列或对其进行移码突变。例如，采用敲除lldh全部编码框序列的方式，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：13至seq id no：16所示。

46、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr08的菌株，所述pyr08通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2、a3、a4和a5改造获得的菌株。

47、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr08的构建是在pyr07菌株基础上，通过敲除d-乳酸脱氢酶基因(dldh)的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸甲酸裂解酶失活，从而阻断代谢副产物d-乳酸合成途径。

48、示例性地，利用同源重组方法敲除dldh全部或部分编码框序列或对其进行移码突变。例如，采用敲除dldh全部编码框序列的方式，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：17至seq id no：20所示。

49、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr11的菌株，所述pyr11通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2、a3、a4、a5和a6改造获得的菌株。

50、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr11的构建是在pyr08菌株基础上，通过单敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因中的pps1基因或pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变，或通过双敲除pps1基因和pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸合酶失活，从而避免丙酮酸逆向合成磷酸烯醇式丙酮酸。

51、示例性地，利用同源重组方法敲除pps1全部或部分编码框序列或对其进行移码突变。例如，采用敲除pps1全部编码框序列的方式，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：21至seq id no：24所示。

52、示例性地，利用同源重组方法敲除pps2全部或部分编码框序列或对其进行移码突变。例如，采用敲除pps2全部编码框序列的方式，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：25至seq id no：28所示。

53、示例性地，利用同源重组方法双敲除pps1和pps2，可以先敲除pps1再敲除pps2，或者互换先后顺序。例如，采用在敲除pps1基础上敲除pps2。

54、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr15的菌株，所述pyr15通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2、a3、a4、a5、a6和a7改造获得的菌株。

55、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr15的构建是在pyr11菌株基础上，通过在丙酮酸脱氢酶复合体e1亚基编码基因(acee)起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件p2而下调acee的表达，同时将acee起始密码子替换为稀有起始密码子，导致丙酮酸脱氢酶复合体的表达水平或酶活力降低；或通过敲除acee全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸脱氢酶复合体失活，最终促使细胞积累大量丙酮酸。

56、示例性地，采用下调表达acee，结合改变acee起始密码子的方式降低丙酮酸脱氢酶复合体的酶活。例如，在acee起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2和/或p6和/或p10，所用调控元件序列如seq id no：29至seq id no：31所示。又例如，将acee原有起始密码子atg替换为稀有起始密码子gtg或ttg。

57、在本发明的一个具体实施例中，在acee起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2和/或p6和/或p10，每种调控元件可与不同的稀有起始密码子ttg或gtg进行组合，共同调控acee的转录和翻译过程，从而改变丙酮酸脱氢酶复合体的酶活。示例性地，利用同源重组方法进行菌株构建。例如，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：32至seqid no：38所示。

58、具体地，所述pyr15可为将pyr11的1号染色体基因组中acee起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2，同时将acee起始密码子atg替换为稀有起始密码子ttg而获得到的重组菌株。

59、上述需钠弧菌基因工程重组菌株可为命名pyr32的菌株，所述pyr32通过对所述出发需钠弧菌进行a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7和a8改造获得的菌株。

60、在一种实施方式中，所述重组菌株pyr32的构建是在pyr15菌株基础上，通过在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件而改变ppc的表达量，同时将ppc起始密码子替换为稀有起始密码子或不替换，导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活力改变；或通过敲除ppc全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶失活，从而改变磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸的代谢流。

61、示例性地，采用调控ppc的表达量，结合改变起始密码子的方式调控磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活。例如，在ppc起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2和/或p6和/或p10，所用调控元件序列如seq id no：29至seq id no：31所示。又例如，将ppc原有起始密码子atg替换为稀有起始密码子gtg或ttg或不替换。

62、在本发明的一个具体实施例中，在ppc起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2和/或p6和/或p10，每种调控元件可与不同起始密码子atg或gtg或ttg进行组合，共同调控ppc的转录和翻译过程，从而改变磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活。示例性地，利用同源重组方法进行菌株构建，例如，所需同源重组片段的pcr扩增引物序列如seq id no：34至seq id no：35和seq id no：39至seq id no：44所示。

63、具体地，所述pyr32可为将pyr15的1号染色体基因组中ppc起始密码子atg上游插入人工合成调控元件p2，同时将并保持ppc起始密码子atg不变而获得到的重组菌株。

64、示例性地，所述重组菌株pyr32已于2021年12月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，菌种保藏编号为cgmcc no.24052，分类命名为需钠弧菌vibrio natriegens。

65、本发明还提供了包含上述的菌株的混合物、培养物或其加工物。

66、可选地，所述混合物为包含上述重组菌株pyr01、重组菌株pyr02、重组菌株pyr06、重组菌株pyr07、重组菌株pyr08、重组菌株pyr11、重组菌株pyr15、重组菌株pyr32、cicc10908组成的组。

67、可选地，所述培养物或其加工物由上述的菌株传代而产生的重组菌株培养物或其加工物，例如发酵液、培养基、冻干粉，也可为上述菌株与其他菌株混合培养的发酵液、培养基、冻干粉等。

68、本发明还提供了上述重组菌株或对其进行基因工程改造而获得的重组菌在生产丙酮酸或其衍生物或制备生产丙酮酸或其衍生物产品中的应用。

69、本发明还提供了一种提高需钠弧菌丙酮酸产量的方法，包括对需钠弧菌进行如下至少一种改造，实现丙酮酸产量的提高，

70、a1、抑制或降低噬菌体基因簇vpn2表达；

71、a2、抑制或降低噬菌体基因簇vpn1表达；

72、a3、抑制或降低丙酮酸甲酸裂解酶pflb基因表达或降低丙酮酸甲酸裂解酶的含量或抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性；

73、a4、抑制或降低l-乳酸脱氢酶lldh基因表达或降低l-乳酸脱氢酶的含量或抑制l-乳酸脱氢酶的活性；

74、a5、抑制或降低d-乳酸脱氢酶dldh基因表达或降低d-乳酸脱氢酶的含量或抑制d-乳酸脱氢酶的活性；

75、a6、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps1和pps2)基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸合酶的活性；

76、a7、抑制或降低丙酮酸脱氢酶复合体e1亚基acee基因表达或降低丙酮酸脱氢酶复合体的含量或抑制丙酮酸脱氢酶复合体的活性；

77、a8、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。

78、本发明还提供了生产丙酮酸的方法，包括发酵上述重组菌株生产丙酮酸。

79、可选地，根据上述生产丙酮酸的方法，所述发酵温度为30-37℃。

80、在本发明的一个具体实施例中，生产丙酮酸的方法包括：

81、(1)一级种子培养：挑取上述重组菌株平板划线单菌落，接种于装有种子培养基的试管中，摇床发酵培养形成一级种子液；

82、(2)二级种子培养：将一级种子液转接到装有种子培养基的摇瓶中，摇床发酵培养形成二级种子液；

83、(3)分批补料发酵培养：将二级种子液转接到装有发酵罐培养基的发酵罐中，通过分批补料发酵培养，得到含有高浓度丙酮酸的发酵液。

84、优选地，在分批补料发酵培养时，起始葡萄糖浓度约为20-30g/l，随着发酵进行，当发酵液中葡萄糖浓度降低至1g/l以下时，开始流动补加补料培养基，控制补料速度使发酵罐中的葡萄糖浓度始终低于5g/l。

85、优选地，发酵罐培养基由以下成分组成：

86、大量元素：初始葡萄糖30g/l，酵母提取物5g/l，k2hpo4·3h2o 7.5g/l，mgso4·7h2o2g/l，(nh4)2so4 1.6g/l，feso4·7h2o 0.075g/l，一水柠檬酸2g/l；

87、微量元素：mnso4·h2o 4.5mg/l，na2so4 20mg/l，znso4·7h2o 6.4mg/l，cocl2·6h2o 4mg/l，cuso4·5h2o 0.6mg/l。

88、本发明一方面提供了生产丙酮酸的需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法，所述方法具体可为首先通过敲除基因组上两个溶原性噬菌体基因簇，降低发酵过程中内源溶原性噬菌体爆发的风险；然后敲除甲酸、l-乳酸、d-乳酸、磷酸烯醇式丙酮酸等代谢副产物合成途径基因，减少发酵过程中代谢副产物的积累；最后下调表达丙酮酸脱氢酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，增强丙酮酸的积累，从而完成高效合成丙酮酸的需钠弧菌基因工程重组菌株的构建(图1)。

89、本发明另一方面提供了发酵生产丙酮酸的需钠弧菌重组菌株，例如重组菌株pyr01、重组菌株pyr02、重组菌株pyr06、重组菌株pyr07、重组菌株pyr08、重组菌株pyr11、重组菌株pyr15和重组菌株pyr32。上述重组菌株均可以利用简单的无机盐培养基发酵生产丙酮酸，发酵周期短，合成速率快、效率高，从而降低了丙酮酸的生产成本。且上述重组菌株均不含质粒，遗传性稳定。本发明提供的生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株具有生产周期短、物料成本低、合成效率高的特点，具有重要的工业应用价值。

90、本发明实施例制备的重组菌株pyr32，其通过敲除基因组上溶原性噬菌体基因簇和甲酸、乳酸等代谢副产物合成途径基因，降低丙酮酸脱氢酶复合体和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活力，进而可生产丙酮酸。该菌株以葡萄糖为碳源，利用简单的无机盐培养基即可高效生产丙酮酸，生长速率和底物转化速率极快，发酵周期仅需14h，生产效率高，从而大大降低了丙酮酸的生产成本。且该重组菌株不含质粒，遗传性稳定。

91、保藏说明

92、菌种名称：需钠弧菌

93、拉丁名：vibrio natriegens

94、菌株编号：pyr32

95、保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

96、保藏机构简称：cgmcc

97、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

98、保藏日期：2021年12月08日

99、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.24052