一种检测单核苷酸多态性的CRISPR试剂盒

本发明属于核酸检测，尤其涉及一种检测单核苷酸多态性的crispr试剂盒。

背景技术：

1、近年来细菌的耐药性问题愈加严重，新的耐药菌株不断出现，研究表明，其出现不仅与菌株长期接触的环境含有多种抗菌药物有关，还与其自身毒力基因的纵向和水平传播存在一定关系。其中基因的单核苷酸多态性会使得细菌的表达产物空间构型和理化性质发生变化，最终使药物不能识别而产生耐药性。喹诺酮类抗菌素主要是通过对dna拓扑异构酶ⅱ（又称旋转酶，包括gyra）和拓扑异构酶ⅳ（parc和pare）的结合和抑制而导致耐药。dna拓扑异构酶ⅱ由gyra和gyrb2个亚基组成， gyra的点突变一般在革兰氏阴性菌株耐喹诺酮类药物的机制中占主导地位。 gyra的突变会因微生物的不同而有所差异。在沙门氏菌中， gyra的喹诺酮耐药决定区（qrdr）位于gyra蛋白第67（ala）和106（gln）氨基酸残基之间（第199～318个碱基），最常发生突变在ser-83，该位置通常突变为phe、tyr或ala，在asp-87位置常突变为gly、asn或tyr，使沙门氏菌产生对于喹诺酮类和氟喹诺酮类抗菌素的耐药性。在结核分枝杆菌中，氟喹诺酮类药物耐药基因 gyra基因突变主要发生在结核分枝杆菌的耐药基因决定区，多数位于基因保守区67～106位点。铜绿假单胞菌，也是一类常见的条件致病病菌，其耐氟喹诺酮类药物的耐药机制比较复杂, 其中dna旋转酶a亚单位基因 ( gyra) 和拓扑异构酶ⅳ的c亚单位基因 ( parc) 发生突变是其产生耐药性的重要途径。

2、但是，现有的检测snp方法耗时耗力、灵敏度低且特异性受到局限，并且检测过程容易出现交叉污染和假阳性等问题。突变阻滞扩增系统（arms）也被称为等位基因特异性扩增法（asa）,其通常与pcr技术相结合。在进行扩增反应时若3'端碱基对形成错配，根据3'端错配原则, 链延伸反应就会因3',5'-磷酸二酯键形成的障碍而受阻。而只有特定等位基因的模板链存在条件下，链延伸才会正常进行。但是该技术存在局限性，该技术所需试剂较多，其检测流程较为复杂，检测过程易产生非特异性扩增造成假阳性。规律间隔成簇短回文重复序列（crispr）被广泛应用于核酸检测领域。但是现有的基于核酸的检测方法较少应用于单核苷酸突变的检测，此外，为了提高检测效果，通常需要昂贵且大型的设备，检测成本较高且不便现场检测。

3、目前尚未见到arms-pcr与crispr/12a系统结合的用于检测单核苷酸突变沙门氏菌耐药株的技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有单核苷酸多态性检测方法的不足，提供一种检测snp编码的耐药细菌的crispr试剂盒，该方法灵敏度和特异性较高，可准确检测snp。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种检测单核苷酸突变耐药细菌的方法，包括arms-pcr过程和激活cas12a报告过程，其特征在于，所需引物如seq id no:1~12所示。其中，seq id no 1~3为设计的arms-pcr前引物序列，seq id no 4为arms-pcr后引物序列，seq id no 5~9为设计的grna序列，seqid no 10报告探针序列，seq id no 11~12为沙门氏菌耐药株和标准株的基因序列，包括了单核苷酸突变位点以及和grna的结合位点。

4、检测单核苷酸突变耐药细菌方法包括如下步骤：

5、步骤一、对含有单核苷酸多态性（snp）的目标dna区域进行arms-pcr扩增，用于扩增的反应体系中含有识别snp的特异引物；

6、步骤二、将步骤一的pcr扩增产物加入到cripsr反应体系中进行反应，该crispr体系包括cas12a效应蛋白、grna、报告探针；

7、步骤三、读取crispr体系反应的荧光强度的变化，通过标准曲线判定待测样品中是否存在含有snp的目标dna。

8、根据本发明，扩增所需特异性引物arms-f和arms-r的序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

9、根据本发明，扩增所需特异性引物arms-f的3’末端第2~7位人为引入了错配。

10、根据本发明，所述arms-pcr扩增反应体系为20μl，包括5~20μm特异引物对，0.01~50ng/μl的目标dna，1~3×pcr反应混合液。

11、根据本发明，arms-pcr扩增的反应程序为：90~95℃预变性5~10min；90~95℃孵育10~20s，58~63℃孵育15~25s，68~73℃孵育30~60s，10~40个循环。

12、根据本发明，crispr反应体系为40μl，包括cas12a缓冲溶液、arms-pcr扩增产物、0.5~5μm grna、5~15μm cas12a蛋白、0.1~10μm 报告探针。

13、进一步的，用于crispr反应的grna的序列如seq id no.5所示；前述grna可通过体外转录得到。

14、作为本发明的另一个方面，一种用于检测snp编码的耐药细菌的crispr试剂盒，包括扩增含有目标单核苷酸多态性dna成分的特异性arms-pcr引物对、grna、报告探针、目标dna和cas12a蛋白。

15、进一步的，扩增目标dna的arms-pcr引物对核苷酸序列分别如seq id no.1~4所示，所述grna、报告探针、目标dna的序列分别如seq id no.5~9、seq id no.10、seq idno.11所示。

16、作为本发明的第三个方面，一种用于检测snp编码的耐药细菌的crispr试剂盒在检测食品中是否含有snp的 gyra基因编码的耐药沙门氏菌中的应用。

17、本发明的检测单核苷酸突变耐药细菌原理是，通过在喹诺酮类药物耐药决定区的 gyra抗性等位基因特异性正向引物3'端引入人为错配来增强鉴定低丰度单核苷酸多态性的特异性，进行arms-pcr扩增反应。pcr扩增产物被特异性识别并在非等位基因位点与cas12a-grna结合，激活cas12a报告过程。使用酶标仪检测其荧光强度，根据其荧光强度的变化检测出单核苷酸突变耐药细菌。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、1、检测灵敏度高，能够超灵敏检测丰度低至0.5%的单核苷酸多态性（snp）。

20、2、检测特异性高，通过等位基因的特异性和crispr/cas12a结合的双重识别过程赋予本方法对snp检测的高特异性。

21、3、设备成本较低，不需要配置凝胶电泳成像设备或qpcr仪。

22、4、响应时间较短，通常在1.5小时内即可完成反应和对样品的鉴定，不需要对扩增产物进行测序，也不需要进行电泳实验。

23、5、本发明是crispr技术在食品安全领域方面的技术创新和应用。

24、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

25、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。