利用Crispr技术检测BRAF基因突变的试剂盒及应用的制作方法

利用crispr技术检测braf基因突变的试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及crispr技术用于临床braf基因突变检测的应用及检测试剂盒。


背景技术：

2.braf基因是人类重要的原癌基因，位于7号染色体含有15个外显子，主要作用是调控细胞生长、发育和凋亡。braf基因v600e细胞突变与疾病诊断、靶向用药有密切相关，可辅助诊断甲状腺癌、黑色素瘤等疾病，还能为大肠癌、肺癌等肿瘤患者选择药物提供参考，因此突变位点的精准检测有助于医学诊疗。
3.目前braf突变检测主要是利用荧光定量pcr技术，以患者石蜡包埋病理切片组织中提取的dna为检测样本。而以荧光定量pcr技术为基础的braf突变检测存在以下缺点：1.标本取样，核酸提取质量对检测结果的准确性有较大影响；2.荧光定量pcr技术操作较为复杂，检测耗时长；3.braf突变探针及扩增试剂盒的仪器通用性差，仪器购买和使用成本较高。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于crispr/cas12a的braf v600e突变快速检测体系和检测试剂盒，所述检测体系包含：针对braf v600e突变型的特异性crrna、高效等温扩增引物组合、cas12a蛋白和ssdna报告系统。本发明基于crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统开发的基因编辑工具为核酸突变位点的快速检测提供了极具潜力的新方向。crispr-cas12蛋白可以在针对靶序列设计的crrna的引导下特异性识别和切割靶序列，同时发挥强大的反式酶切活性切割非特异性单链dna(ssdna)。本发明的检测体系和检测试剂盒能够快捷且可视化地对braf v600e突变进行检测，具有高灵敏度、高特异性的特点。
5.本发明的目的之一是提供一种用于braf v600e突变的检测体系，所述检测体系包括切口酶或其编码基因(或编码核苷酸)，靶向突变位点的引导rna或其编码基因(或编码核苷酸)，荧光报告系统；所述切口酶具有核酸内切酶活性。
6.本发明的另一目的是提供一种用于braf v600e突变位点检测产品，所述检测产品包含如上所述的检测体系。
7.本发明的另一目的是提供一种如上所述的检测体系或检测产品在用于检测用于braf v600e突变位点检测中的用途，优选用于braf v600e基因突变位点检测中的用途。
8.本发明的另一目的是提供切口酶和/或引导rna或包含两者的crispr体系在制备用于braf v600e突变位点的检测产品中的用途；所述切口酶、crrna分别如上所述的检测体系中所述。
9.本发明的另一目的是提供一种用于braf v600e基因突变位点的快速检测方法，
10.对于血液样本，所述方法包括以下步骤：
11.步骤a：利用红细胞裂解液处理血液样本，离心获得富集的白细胞；
12.步骤b：利用核酸快速释放剂释放白细胞中的核酸；
13.步骤c：利用等温扩增技术扩增待测样本中的核酸：将覆盖braf v600e区域的特异性引物rpa-f2和rpa-r3，和步骤b获得的产物加入到rpa等温扩增体系中，进行扩增反应；
14.步骤d：将步骤c的产物加入到如上所述的检测体系中，进行荧光检测反应；
15.步骤e：利用酶标仪读数或在荧光灯下肉眼观察判读结果。
16.对于组织样本，所述方法包括以下步骤：
17.步骤a：取组织样本，包括新鲜组织和/或石蜡和冰冻切片；
18.步骤b：利用dna快速提取试剂处理样本，获取基因组dna；
19.步骤c：利用等温扩增技术扩增待测样本中的核酸：将覆盖braf v600e区域的特异性引物rpa-f2和rpa-r3，和步骤b获得的产物加入到rpa等温扩增体系中，进行扩增反应；
20.步骤d：将步骤c的产物加入到如上所述的检测体系中，进行荧光检测反应；
21.步骤e：利用酶标仪读数或在荧光灯下肉眼观察判读结果。
22.与现有检测技术相比，本发明的有益效果是：
23.(1)本发明提供了一种灵敏、特异、快速且可视化的基于crispr/cas12a的braf v600e突变检测技术。为了保证检测的特异性，所设计的crrna已经过ncbi核酸数据库检索，确定与包括人、动植物和微生物等在内的基因组无高同源性匹配。为了提高crrna对突变型和野生型的区分度，在所设计的crrna上人为引入一个错配碱基，进一步摒除crrna与野生型结合产生的杂信号。
24.(2)本发明涉及的快速检测技术，其检测结果可在荧光灯下进行肉眼直接判读，方便快捷，适合用于床旁检测和推广到基层实验室。
25.(3)本发明系首次采用cas12a荧光法检测braf v600e基因突变，具有灵敏度高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势。
附图说明
26.图1基于cas12a快速检测braf v600e基因突变的方法示意图。
27.图2braf v600e突变的不同crrna筛选柱状图。
28.图3不同crrna检测突变体和野生型的荧光比值。
29.图4不同rpa引物组合扩增等量质粒所得产物的荧光值。
30.图5cas12a荧光检测braf v600e突变质粒的灵敏度(酶标仪检测)。
31.图6cas12a荧光检测braf v600e突变质粒的灵敏度(肉眼判读)。
32.图7cas12a荧光检测不同突变率质粒的特异性(酶标仪检测)。
33.图8cas12a荧光检测不同突变率质粒的特异性(肉眼判读)。
34.图9cas12a荧光检测甲状腺癌患者组织样本及患者一代测序峰(肉眼判读)。
具体实施方式
35.下面结合附图和具体实例对本发明作进一步的描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要
求书所限定的范围。
36.基于cas12a的上述特性，本发明开发了一种精准快速的检测方法，用于临床血液和组织样本中braf v600e基因突变的检测。首先，对临床血液样本进行红细胞裂解和离心处理，得到富集的白细胞，使用核酸释放剂释放基因组dna；对组织样本(可以使用新鲜组织样本或者石蜡切片样本)同样使用核酸释放剂释放基因组dna；然后利用重组酶聚合酶扩增(rpa)技术对包含braf v600e位点的dna片段进行扩增；最后，cas12a-crrna复合物特异性地结合v600e突变型双链dna(dsdna)，激活其非特异性酶切活性，切割与荧光报告分子偶联的单链dna(ssdna)，释放荧光信号。该方法快速、准确且易于操作，无需大型仪器，有潜力成为新型的肿瘤基因突变筛查和床旁检测技术。
37.本发明一方面提供了一种用于braf v600e基因突变的检测体系，所述检测体系包括切口酶，靶向突变位点的引导rna，荧光报告系统；所述切口酶具有核酸内切酶活性。
38.本发明所述检测体系中，所述切口酶如cas蛋白本身并不表现活性，需要在crrna识别v600e突变序列后，才能被激活，然后非特异性识别切割反应体系中的荧光探针；即所述切口酶和引导rna形成切口酶-引导rna复合体，所述复合体特异性结合含突变位点的靶向序列，激活切口酶非特异性地切割荧光报告系统，释放出荧光基团。反应机理为：crispr反应体系对braf v600e的snp检测的作用主要体现在特异性上，即crispr体系的特异性碱基识别特性赋予了其进行snp检测的能力。本发明提供的crrna能够有效识别braf v600e突变序列并激活对应的cas蛋白，切割周围的荧光报告探针，显示v600e突变检测阳性。而该crrna在检测不含突变的原始序列时，因为碱基错配无法激活对应的cas蛋白从而显示v600e突变检测阴性。
39.本发明所述检测体系中，所述核酸选自dna、cdna、rna、sirna、反义寡核苷酸、核酶、适体(aptamer)核酸类似物、肽-核酸嵌合体中的一种或其任意组合。优选地，所述核酸为dna。进一步优选地，所述核酸突变位点是指braf v600e基因突变。
40.本发明所述检测体系中，所述切口酶为crispr/cas效应蛋白或其变体；优选地，所述cas蛋白选自cas12、cas14家族蛋白的任意一种或几种组合；更优选地，所述cas12家族蛋白选自cas12a、cas12i、cas12j、cas12b、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h中的一种或其任意组合；更优选地，所述cas12家族蛋白选自cas12a。
41.所述cas12a蛋白的制备方法包括：对cas12a蛋白核酸序列的原核密码子进行优化获得，将其构建到pet28a表达载体上，通过低温诱导可溶蛋白表达，然后经过亲和纯化及分子筛纯化即获得目的蛋白。
42.本发明所述检测体系中，可以包含所述切口酶的表达载体，进一步地，所述检测体系为适于切口酶表达的体系，在检测体系中，所述表达载体表达切口酶，与引导rna形成复合体，进而用于荧光检测反应。
43.本发明所述检测体系中，所述引导rna包含crrna，序列分别如seq id no.1～20所示。优选地，所述引导rna为crrna。在一些优选实施方式中，所述crrna长度为23bp，其覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配，选自e600-cr1-3、e600-cr1-4、e600-cr1-6，序列分别如seq id no.4、5和7所示。在一些优选实施方式中，所述crrna包含一处或几处错配碱基。在一些优选实施方式中，所述crrna包含一处错配碱基。在一些更优选实施方式中，所述crrna具有较高的灵敏度和特异性，其为从20条针对braf基因v600e突变位点设计的crrna中筛选
所得，为e600-cr1-6，序列如seq id no.7。
44.作为优选，所述特异性crrna的制备方法包括：在braf基因的v600e位点附近寻找包含cas12a识别序列(pam)tttn的靶向序列，设计23bp长度的覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配的crrna；完成设计后，制备crrna。
45.作为优选，所述crrna的制备可通过构建载体puc57-t7-crrna，经体外转录获得目的crrna；或直接合成crrna序列对应的rna。
46.本发明所述检测体系中，所述荧光报告系统为在ssdna两端分别标记荧光示踪物和荧光淬灭剂的报告系统。
47.作为优选，所述荧光示踪物选自小分子荧光素、荧光蛋白或串联荧光染料；其中，荧光示踪物和荧光淬灭剂的配对原则为荧光示踪物的发射波长为荧光淬灭剂的吸收波长。
48.进一步优选地，所述荧光蛋白选自藻红蛋白、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白以及别藻蓝蛋白中的至少一种。
49.进一步优选地，所述小分子荧光素选自fam、fitc、cy5、cy3、cy5.5、alexa flour系列荧光素、dylight系列荧光素、pacific blue、tritc、tamra以及罗丹明中的至少一种；所述小分子荧光素选自6-羧基荧光素(6-fam)；
50.进一步优选地，所述串联荧光染料为链霉亲和素-藻红蛋白(sape)；
51.进一步优选地，所述荧光淬灭剂选自bhq1、dabcyl、bhq2、qsy7、qsy9、qsy21、qsy35、atto540q、atto580q、atto612q、dyq660和dyq661中的至少一种。
52.在一些优选实施方式中，所述荧光报告系统为ssdna报告系统，ssdna为tttattt，其包含可用酶标仪荧光检测或在荧光灯下肉眼直接判读的ssdna fq reporter，即被6-羧基荧光素(6-fam)和荧光淬灭剂(bhq1)标记的ssdna，标记产物如下：/5 6fam/tttattt/3bhq1/，命名为ssdna fq reporter/56fam/tttattt/3bhq1/。
53.本发明所述检测体系还可包括用于核酸突变位点扩增的引物；所述扩增优选为等温扩增。在一些优选实施方式中，所述高效等温扩增引物组合为经筛选后选择的针对braf基因v600e突变位点的扩增引物对rpa-f2与rpa-r3，序列分别为seq id no.24和seq id no.28。
54.本发明所述检测体系中，所述v600e核酸突变位点可以是任意适合的基因突变位点，包括但不限于是braf v600e；在一些优选实施方式中，所述核酸突变位点是指braf v600e，例如可以是炎症、自身免疫性疾病或肿瘤中的braf v600e，即所述检测体系可以用于炎症、自身免疫性疾病或肿瘤中至少任一的braf基因检测。
55.其中，所述炎症选自皮肤炎症、脉管炎症、变态反应、纤维组织形成、硬皮病或移植物排斥。优选地，所述炎症由传染性病原体引起。进一步优选地，所述炎症由病毒或细菌感染引起，所述病毒包括但不限于流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、或埃可病毒中的一种或几种。所述细菌选自大肠杆菌、干酪乳杆菌、脆弱拟杆菌、鲁氏不动杆菌、具核梭杆菌、乔氏拟杆菌、拟南芥拟杆菌、鼠李糖乳杆菌、马赛拟杆菌、卵形拟杆菌、空肠弯曲菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌、粪副拟杆菌、死亡梭杆菌以及短双歧杆菌中的一种或几种。
56.其中，所述自身免疫性疾病选自风湿关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、类
口眼干燥综合征、多发性肌炎等中的一种或多种或其他。
57.其中，所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；具体选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种；优选地，所述肿瘤为甲状腺癌、结直肠癌、肺癌和/或黑色素细胞瘤等中的一种或几种或其他。
58.针对核酸突变位点braf v600e，优选地，所述切口酶为cas12a；所述cas12a的识别的pam序列为tttn。所述crrna长度为23bp，其覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配，且包含一个或多个人为引入的错配碱基；进一步优选地，所述crrna为覆盖braf v600e突变位点且包含一个引入的错配碱基，命名为braf e600-cr1-6，序列如seq id no.7所示。所述荧光报告系统为/56fam/tttattt/3bhq1/。所述扩增引物对为rpa-f2与rpa-r3，序列分别为seq id no.24和seq id no.28所示。
59.本发明所述检测体系中，所述样本包括但不限于是血液、组织、血细胞、骨髓、腹水、细针活检样本、含有细胞的体液、游离漂浮核酸、痰液、唾液、尿液、脑脊液腹膜液、胸膜液、粪便、淋巴、皮肤拭子、口服拭子、鼻拭子或灌洗物；优选地，所述样本为血液样本或组织样本中的至少一种。在一些实施方案中，生物样本包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。
60.本发明还提供了一种核酸突变位点检测产品，所述检测产品包含如上任一项所述的检测体系。所述检测产品可以是任何适宜的形式，如试剂盒、芯片或膜条等。
61.在一些优选实施方式中，本发明提供了一种基于crispr/cas12a的用于braf v600e突变检测试剂盒，所述检测试剂盒包含特异性检测braf v600e突变型dna的cas12a荧光检测体系；所述检测体系内包含：cas12a蛋白、针对braf v600e突变型的特异性crrna、高效等温扩增引物组合和ssdna报告系统。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。
62.作为优选，所述crrna长度为23bp，其覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配。在一些优选实施方式中，所述crrna包含一处或几处错配碱基。在一些优选实施方式中，所述crrna包含一处错配碱基。在一些更优选实施方式中，所述crrna具有较高的灵敏度和特异性，其为从20条针对braf基因v600e突变位点设计的crrna中筛选所得，为e600-cr1-6，其覆盖braf v600e突变位点且包含一个引入的错配碱基，序列如seq id no.7。所述crrna的制备可通过构建载体puc57-t7-crrna，经体外转录获得；或通过直接合成方法获得。
63.作为优选，所述ssdna报告系统包含可用酶标仪荧光检测或荧光灯下肉眼直接判读的ssdna fq reporter，即被6-羧基荧光素(6-fam)和荧光淬灭剂(bhq1)标记的ssdna，标记产物如下：/5 6fam/tttattt/3bhq1/，命名为ssdna fq reporter/56fam/tttattt/
fq reporter，释放出激活荧光基团，利用酶标仪可检测到上升的荧光读数，或肉眼可观察到荧光灯下的绿色反应。相反地，若检测样本中不存在braf v600e突变，将不会产生上升的荧光读数，肉眼也不会观察到绿色反应。
103.本发明还提供了一种组合物，其包含如上任一项所述的检测体系，以及药学上可接受的载体。所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(peg、tween等)、螯合剂(edta等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，peg等)、非离子表面活性剂(吐温80，hco-50)等。
104.如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换使用并以其最广泛的含义使用，是指两个或更多个亚基的氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可以通过肽键连接。在另一方面中，亚基可以通过其他键连接，例如，酯、醚等。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。已知蛋白质和肽具有c-末端和n-末端，所述c-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合羧基的末端，所述n-末端指代在该末端氨基酸上存在未结合氨基的末端。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸，以及d和l光学异构体，氨基酸类似物和肽模拟物。术语“融合”在蛋白质或多肽上下文中是指两个或更多个蛋白质或多肽(或其结构域)末端之间形成融合蛋白的连接。
105.本发明中，蛋白的变体为原始蛋白的片段、衍生物和类似物，其可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。根据本发明的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。例如，在一些实施方式中，所述切口酶片段的变体是指与所述切口酶的氨基酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性，且具有所述切口酶相同或相似功能的蛋白。上述75％或75％以上同一性，可为75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性；具体地可为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。上述90％或90％以上同一性，可为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。所述相似功能是指保留原蛋白的75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高的功能。
106.本发明所述检测体系、检测产品、试剂盒、方法、组合物等适用于任何原因引起的疾病中braf v600e的基因突变检测。
107.如本文所用，序列相似性或同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
108.如本文所用，“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
109.如本文所用，术语“核酸”和“核酸组分”可互换使用，其指具有核碱基和酸性部分的化合物，例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物。在一些实施方式中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方式中，“核酸”是指包含三个或更多个单个核苷酸残基的寡核苷酸链。本文中所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指核苷酸的聚合物(例如，一串至少三个核苷酸)。在一些实施方式中，“核酸”包括rna以及单链和/或双链dna。核酸可以是天然产生的或是非天然产生的分子。
110.如本文所用，术语“表达”指多核苷酸转录成mrna的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组dna，则表达可包括真核细胞中mrna的剪接。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品内mrna或蛋白质的量予以确定。
111.除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
112.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
113.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
114.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，
115.附图1为本发明基于cas12a快速检测braf v600e基因突变的方法总流程示意图，包括以下四部分：待测样本预处理、核酸释放、cas12a荧光检测体系构建以及荧光检测。
116.实施例1：筛选针对braf v600e突变体的crrna
117.1.1核酸制备
118.本实施例中采用的braf v600野生型基因片段采用扩增自293t细胞系基因组，将之整合到pgem-t vector上即得到模拟野生型基因组的质粒(braf-v600野生型质粒)，利用携带v600e突变的引物(f:gattttggtctagctacagagaaatc(seq id no.29)，r:ctagaccaaaatcaccta(seq id no.30))扩增质粒全长，再通过自连即可得到模拟突变型基因组的质粒(v600e突变型质粒)。
119.1.2braf v600e突变体特异性crrna的设计和制备
120.在braf基因的v600位点附近寻找包含cas12a识别序列(pam)tttn的靶向序列，设
计23bp长度的覆盖突变点且与突变型靶向序列匹配的crrna，为了进一步降低wt的杂信号，在crrna上非突变位点处再设计一处错配碱基，共设计20条crrna(表1)；完成设计后，交由南京金斯瑞公司直接合成。
121.表1针对braf v600e突变体的crrna
[0122][0123][0124]
1.3利用pcr产物扩增基因组质粒
[0125]
利用pcr引物(seq id no.21和22，表2)对1.1所构建的野生型基因组和突变型基因组质粒进行扩增，将经axyprep pcr clean-up kit(axygen,ca,usa)纯化的pcr产物用ddh2o稀释调整为1*e10拷贝/μl，取1μl作为检测样品进行cas12a荧光检测反应。
[0126]
表2 pcr引物序列
[0127][0128]
所述cas12a制备步骤包括：对cas12a蛋白核酸序列的原核密码子进行优化，然后构建到pet28a表达载体上，通过低温诱导可溶蛋白表达，然后经过亲和纯化及分子筛纯化即获得目的蛋白。
[0129]
所述ssdna fq reporter由公司合成。
[0130]
1.4cas12a荧光检测体系构建和检测步骤
[0131]
本发明采用20μl检测体系，成分如表3：
[0132]
表3 cas12a荧光检测体系
[0133][0134]
对于每一个crrna，均设计检测样品分别为野生型、突变型和ddh2o(阴性对照)的三个反应管，以检测和比较交叉反应、灵敏度及背景信号。
[0135]
1.5cas12a荧光检测反应及全波长酶标仪检测筛选crrna
[0136]
将上述1.4构建的cas12a荧光检测体系混匀，置于37℃下反应20min。将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应20min时的荧光值。
[0137]
检测结果如图2和图3所示，针对突变体与野生型的比值越大，特异性和灵敏度越高，结果表明braf e600-cr1-6检测的特异性和灵敏度均较好，e600-cr1-3、e600-cr1-4的特异性和灵敏度也较优。因此选择braf e600-cr1-6(seq id no.7)为检测braf v600e突变的最优crrna。
[0138]
实施例2：筛选扩增braf v600e区域的rpa引物
[0139]
2.1rpa引物设计与合成
[0140]
本发明利用等温扩增技术对模拟质粒的braf v600区域进行预扩增，用于后续的cas12a荧光检测反应。根据等温扩增引物设计的要求，设计出3条正向引物(forward引物)与3条反向引物(reverse引物)，序列为seq id no.23～28(表4)，交由南京金斯瑞公司直接合成。将正向引物与反向引物两两搭配，筛选出最高效的引物组合，引物筛选图如图4所示。
[0141]
2.2rpa等温扩增反应
[0142]
本实施例以braf v600e模拟质粒即实施例1中1.1构建的braf v600野生型质粒和braf v600e突变型质粒为模板筛选rpa扩增引物。根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e4拷贝braf v600e模拟质粒的样品。
[0143]
具体操作步骤为：将2.5μl rpa-f(正向引物)，2.5μl rpa-r(反向引物)，1μl模拟质粒样品和42μl反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μl激活剂混匀，得到rpa等温扩增反应体系；混匀后于37℃下反应20min。产物可直接用于下一步检测。
[0144]
表4 braf v600区域的rpa扩增引物序列
[0145][0146][0147]
2.3cas12a荧光检测反应
[0148]
本实施例采用20μl cas12a检测体系，成分如表3，其中样品(sample)为上述2.2扩增反应的产物，取5μl产物用于检测。全波长酶标仪荧光检测结果如图3。结果表明rpa-f2与rpa-r3引物组合的扩增效率最好，因此选择rpa-f2与rpa-r3作为后续病人样品扩增用引物组合。
[0149]
实施例3：braf v600基因片段的检测灵敏度
[0150]
本实施例中，为测定本方法对braf v600e的检测灵敏度，根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对实施例1中1.1构建的v600e突变型质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e7、1*e6、1*e5、1*e4、1*e3、1*e2、1*e1和1*e0拷贝数(copy/μl)的测试样(分别对应图4的e7、e6、e5、e4、e3、e2、e1、nc)。
[0151]
利用如实施例2中所述的荧光检测方法，对上述梯度稀释样品进行检测。操作如下：将2.5μl rpa-f2，2.5μl rpa-r3，1μl样品(作为模板)和42μl反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μl激活剂混匀，得到50μl rpa等温扩增反应体系；混匀后于37℃下反应20min。
[0152]
取5μl产物，加入到20μl cas12a检测体系(表3)中，于37℃下反应20min后进行荧光结果判读。
[0153]
本实施例中，采用酶标仪检测，结果如图5所示，由图5可知，本发明方法可实现对1*e1拷贝质粒的高灵敏度检出。肉眼直接判读荧光反应时，将37℃下反应20min后的检测体系置于485nm激发光下，肉眼直接观察荧光反应，阳性结果为反应产物发出绿色荧光，阴性结果为无色，如图6所示，可知本发明方法可实现对1*e1拷贝质粒的高灵敏度检出。
[0154]
实施例4：braf v600基因片段的检测特异性
[0155]
本实施例中，为测定本方法对braf v600e的检测特异性，根据质粒大小和分子量计算拷贝数，分别获得每微升含有1*e4拷贝数(copy/μl)braf v600野生型质粒和v600e突变型质粒的样品，将二者以不同比例混合得到突变率分别为100％、50％、25％、10％、1％、0.1％、0％的测试样品。
[0156]
利用如实施例3中所述的荧光检测方法，对上述梯度稀释样品分别进行检测。操作如下：将2.5μl rpa-f2，2.5μl rpa-r3，1μl样品(作为模板)和42μl反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μl激活剂混匀，得到50μl rpa等温扩增反应体系；于37℃下反应20min。
[0157]
取5μl产物，加入到20μl cas12a检测体系(表3)中，于37℃下反应20min后进行荧光结果判读。
[0158]
本实施例中，当模板的总拷贝数为1*e4时，采用酶标仪检测，结果如图7所示，本发明方法可实现对1％突变率样品的检出。采用肉眼直接观察荧光反应，结果如图8所示，本发明方法可实现对1％突变率样品的检出。
[0159]
实施例5：利用cas12a荧光检测法快速检测病人样本
[0160]
本实施例中所用的甲状腺癌患者血液，穿刺样本和石蜡切片样本均为按照相关法律法规合格操作获得。
[0161]
首先将200～500μl外周血样本与800μl红细胞裂解液混合，颠倒数次充分裂解红细胞，然后13000rpm离心30s得到富集的白细胞沉淀。向沉淀中加入150μl核酸快速释放剂，于95℃下孵育3min，得到核酸释放剂处理产物。
[0162]
取穿刺样本30-50mg或石蜡切片(5-10μm厚，1
×
1cm2大小)5-8张，加入500μl pbs(10mm，ph7.4)涡旋振荡混匀12000rpm(～13400
×
g)室温离心1min，弃上清，重复3次。向沉淀中加入150μl核酸快速释放剂，于95℃下孵育3min，得到核酸释放剂处理产物。
[0163]
取1μl孵育产物用于后续rpa和cas12a荧光检测，步骤同前述实施例，步骤如下：取1μl核酸释放剂处理产物加入50μl rpa反应体系中，即将2.5μlrpa-f2，2.5μl rpa-r3，1μl核酸释放剂处理产物(作为模板)和42μl反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μl激活剂混匀，得到50μl rpa等温扩增反应体系；混匀后于37℃下反应20min。
[0164]
取5μl rpa反应产物加入到cas12a荧光检测体系(表3)中，使总体积为20μl，混匀后于37℃下反应20min。
[0165]
图9为cas12a荧光检测braf v600e甲状腺癌患者组织样本的肉眼结果及患者一代测序峰图，在本实施例中，15例患者样本(分别编号为p1～p15)在荧光灯下的肉眼判读结果与一代测序和二代测序结果吻合，即14例为野生型，1例为25％突变率的braf v600e突变型(图9)。
[0166]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。