一种利用米曲霉制备L-色氨酸-L-丙氨酸环二肽的方法

一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种利用米曲霉大规模制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法。


背景技术：

2.l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽(cyclo(l-trp-l-ala))，是一种含有吲哚环和2,5-二酮哌嗪环的小分子化合物，是生物碱类天然产物的重要结构单元。以l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽为结构骨架的化合物往往具有重要的生物活性，在临床药物开发方面具有潜在的应用价值。
3.尽管，目前l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽已有商品化，其cas登记号：17079-37-7，但是其价格极其昂贵。价格高昂的主要原因是其来源有限所致，一方面，因其结构的特殊性，l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的化学合成困难；另一方面，虽然可以从aspergillus属和eurotium属相关真菌的代谢产物中获取，但是发酵不稳定、产率低以及提取纯化等一系列问题严重限制其微生物生产的来源。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决上述技术问题，而提供一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法。
5.一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法，按以下步骤进行：
6.步骤s1：表达质粒pma-cric的构建；
7.以泾渭茯茶共生菌(eurotium cristatum)的基因组dna为模版，以p1f为正向引物、p1r为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段一，然后以p2f为正向引物、p2r为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段二；再以泾渭茯茶共生菌(eurotium cristatum)的基因组dna为模版，以pma质粒经kpni酶切线性化处理的片段为载体，将环二肽合酶编码基因cric的片段一和片段二插入pma质粒的限制性位点kpni，获得表达质粒pma-cric；
8.引物p1f的序列为aattcgagctcggtaccatgtgaagctgatattcattc，引物p1r的序列为gaccaaggtagcgtaggtaattgaatgtgaccctttttg，引物p2f的序列为ttacctacgctaccttggtccaatatgca，引物p2r的序列为tactacagatccccgggtaccctataccaccgttagatactgtcgcg；
9.步骤s2：携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的获得；
10.取米曲霉(aspergillus oryzae)的孢子保存液接入dpy培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体；然后加入细胞壁溶解液，温和振荡2～3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液ii和缓冲液iii，再加入表达质粒pma-cric，混匀后冰浴18～20min，向混合体系加入缓冲液iii，室温孵育18～20min，然后加入缓冲液ii，混匀后离心8～10min，除去上清液后加入缓冲液ii，混匀后转移到改良的察氏培养基平板
上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；待上述培养基长出菌丝后，利用pcr对其验证，阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株；
11.所述的缓冲液ii由1.2m山梨糖醇、50mm氯化钙溶液、50mm氯化钠溶液和10mm氨基丁三醇组成，且ph调至7.5；所述的缓冲液iii由40％聚乙二醇-4000、50mm氯化钙溶液和50mm氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200ml改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基、9.3g nacl、1.8g(nh4)2so4、20mg腺嘌呤、300mg甲硫氨酸和3g琼脂粉；
12.步骤s3：l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的制备；
13.将携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的菌丝接种于灭菌后的填装有大米的培养基中，对培养基萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过高效液相色谱仪制备，得到l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽。
14.本发明的有益效果：
15.第一，本发明以米曲霉(aspergillus oryzae)为宿主，宿主细胞具有强大的氨基酸合成能力，能够提供丰富的l-色氨酸和l-丙氨酸；第二，本发明所用的表达质粒pma-cric上携带pamyb淀粉酶启动子，以大米为培养基时可以高效驱动环二肽合酶编码基因cric的高效表达；第三，本发明高产菌株aspergillus oryzae/pma-cric以大米培为培养基，成本低廉、操作简单、培养周期短、分离纯化简单易行。
16.本发明非常适合大规模发酵生产，突破传统分离的资源限制，通过采用上述培养基及培养条件进行发酵，对发酵产物的分离，提取以及各种波谱鉴定，米曲霉异源表达株可以大量生产l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽，产量超过100mg/1kg大米，能够有效解决l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的来源问题，能够为含有吲哚骨架和二酮哌嗪结构的天然产物以及相关医药中间体的合成提供充足的原料。
17.本发明提供一种利用米曲霉(aspergillus oryzae)为宿主大规模制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法，每1千克大米发酵可获得超过一百毫克的l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽。
18.本发明可获得一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法。
附图说明
19.图1为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽hplc分析图谱，i表示野生型米曲霉，ii表示含有cric基因的米曲霉。
20.图2为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽lc-ms检测图谱。
21.图3为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽1h核磁共振波谱。
22.图4为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽
13
c核磁共振波谱。
23.图5为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽hsqc核磁共振波谱。
24.图6为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽hmbc核磁共振波谱。
25.图7为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽1h-1
h cosy核磁共振波谱。
26.图8为l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽1h-1
h noesy核磁共振波谱。
具体实施方式
27.具体实施方式一：本实施方式一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法，按以下步骤进行：
28.步骤s1：表达质粒pma-cric的构建；
29.以泾渭茯茶共生菌(eurotium cristatum)的基因组dna为模版，以p1f为正向引物、p1r为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段一，然后以p2f为正向引物、p2r为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段二；再以泾渭茯茶共生菌(eurotium cristatum)的基因组dna为模版，以pma质粒经kpni酶切线性化处理的片段为载体，将环二肽合酶编码基因cric的片段一和片段二插入pma质粒的限制性位点kpni，获得表达质粒pma-cric；
30.引物p1f的序列为aattcgagctcggtaccatgtgaagctgatattcattc，引物p1r的序列为gaccaaggtagcgtaggtaattgaatgtgaccctttttg，引物p2f的序列为ttacctacgctaccttggtccaatatgca，引物p2r的序列为tactacagatccccgggtaccctataccaccgttagatactgtcgcg；
31.步骤s2：携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的获得；
32.取米曲霉(aspergillus oryzae)的孢子保存液接入dpy培养基中，振荡培养2～3天，获得米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体；然后加入细胞壁溶解液，温和振荡2～3小时，获得原生质体；向原生质体内加入缓冲液ii和缓冲液iii，再加入表达质粒pma-cric，混匀后冰浴18～20min，向混合体系加入缓冲液iii，室温孵育18～20min，然后加入缓冲液ii，混匀后离心8～10min，除去上清液后加入缓冲液ii，混匀后转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入覆盖培养基，倒置培养3～7天；待上述培养基长出菌丝后，利用pcr对其验证，阳性转化子进行2次继代培养后，获得携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株；
33.所述的缓冲液ii由1.2m山梨糖醇、50mm氯化钙溶液、50mm氯化钠溶液和10mm氨基丁三醇组成，且ph调至7.5；所述的缓冲液iii由40％聚乙二醇-4000、50mm氯化钙溶液和50mm氨基丁三醇组成；所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200ml改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基、9.3g nacl、1.8g(nh4)2so4、20mg腺嘌呤、300mg甲硫氨酸和3g琼脂粉；
34.步骤s3：l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的制备；
35.将携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的菌丝接种于灭菌后的填装有大米的培养基中，对培养基萃取、浓缩，获得发酵液浸膏；将发酵液浸膏通过高效液相色谱仪制备，得到l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽。
36.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤s1中将环二肽合酶编码基因cric的片段一和片段二及经kpni酶切线性化处理的pma质粒片段按照1:1:2的摩尔比混合，利用多片段连接试剂盒进行连接，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌dh5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过pcr验证和酶切验证后，获得表达质粒pma-cric。
37.其他步骤与具体实施方式一相同。
38.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：步骤s2中基于表达质粒pma-cric的l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的培养的步骤如下：取米曲霉(aspergillus oryzae)的孢子保存液接入到含有100ml的dpy培养基中，在28～30℃下、以
180～200rpm的转速振荡培养2～3天，获得米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体；将米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体过滤收集后用无菌水洗涤3～5次，然后加入20ml细胞壁溶解液，并在25～28℃的温度条件下，温和振荡2～3小时，获得原生质体；利用灭菌过的0.8m nacl溶液洗涤将原生质洗涤2次，加入缓冲液ii和缓冲液iii，再加入10μg表达质粒pma-cric，混匀后冰浴18～20min，向混合体系加入1ml缓冲液iii，室温孵育20分钟，然后加入10ml缓冲液ii，混匀后，在2～4℃下以600～800rpm的转速离心8～10min，除去上清液后加入1ml缓冲液ii，混匀后移取200μl混匀液转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入5ml、45～50℃的覆盖培养基，待覆盖培养基凝固后封平板，倒置培养3～7天；待含有pma-cric转化子长出菌丝后，利用pcr对其验证，阳性转化子进行2次继代培养后，获得l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株。
39.其他步骤与具体实施方式一或二相同。
40.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：所述的dpy培养基按以下步骤制备：2g糊精、1g聚蛋白胨、0.5g酵母粉、10mg腺嘌呤、925mg硫酸铵、150mg甲硫氨酸和60mg精氨酸，加水定量至100ml；覆盖培养基由1.2m山梨糖醇和0.5％琼脂粉组成。
41.其他步骤与具体实施方式一至三相同。
42.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：所述的细胞壁溶解液由1.0％亚糖酶溶于溶液i中制成；所述的溶液i由0.8m氯化钠溶液和10mm磷酸二氢钠溶液组成。
43.其他步骤与具体实施方式一至四相同。
44.具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤s3中将携带l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的菌丝接种于灭菌后的填装有大米的培养基中，并在25～28℃下静置培养两周；利用乙酸乙酯对培养基萃取3～5次，浓缩获得发酵液浸膏；利用正相色谱对发酵液浸膏进行粗分，然后利用反相色谱进行细分，再通过高效液相色谱仪制备，得到l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽。
45.其他步骤与具体实施方式一至五相同。
46.具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤s1中以pma质粒经kpni酶切线性化处理的片段为载体，利用非连接酶依赖型的多片段一步克隆试剂盒，将环二肽合酶编码基因cric的片段一和片段二插入pma质粒的限制性位点kpni，获得表达质粒pma-cric；pma质粒的质量与kpni的体积的比为1μg：1μl。
47.其他步骤与具体实施方式一至六相同。
48.具体实施方式八：本实施方式一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法获得的表达质粒pma-cric，其核苷酸序列如序列表seq id no.1所示。
49.采用以下实施例验证本发明的有益效果：
50.实施例1：一种利用米曲霉制备l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的方法，按以下步骤进行：
51.步骤s1：表达质粒pma-cric的构建；
52.泾渭茯茶共生菌(eurotium cristatum)是一种能够产生具有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽骨架化合物的丝状真菌，其its的ncbi登录号为om276864。以该菌dna为模版，以p1f
(aattcgagctcggtaccatgtgaagctgatattcattc)为正向引物、p1r(gaccaaggtagcgtaggtaattgaatgtgaccctttttg)为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段一，然后以p2f(ttacctacgctaccttggtccaatatgca)为正向引物、p2r(tactacagatccccgggtaccctataccaccgttagatactgtcgcg)为反向引物，扩增获得环二肽合酶编码基因cric的片段二；再以pma质粒经kpni酶切线性化处理的片段为载体，将环二肽合酶编码基因cric的片段一和片段二及上述载体pma质粒按照1:1:2的摩尔比混合，利用多片段连接试剂盒(clonexpress multis one step cloning kit)进行连接将cric插入pma质粒的限制性位点kpni，连接完成后将连接体系转化到大肠杆菌dh5α，过夜培养后获得阳性克隆子，最后经过pcr验证和酶切验证后，获得表达质粒pma-cric，其示意图如图1所示。
53.表达质粒pma-cric的核苷酸序列：
54.atgggctccatcgaatccgactctgtcctctctttcttcagtcaacagtgttttcaacacccagacaacactgctattgacgatgggccaaacggcaacctctcctacagccagctcgaccaacagtcttccacactcgcccattgcctacggcaaaatggcatcaaggcaggtcaggtggttccgctcctgacaacctcccgtctggaaatggtcattgcggttttggggattcttaaagccggcggcgtctatgtgcccgttgatattgatcaatggcctgcggaccgcattaactatgtgttgggccgtacatgttcgggccttgtggtctatacaggtgaccatatcccctccggtataaatctcgaggaaaagtgtcgcgttgtccaggttcagattcggcttgaaaacgaactcaaagcacaatacgagcccaatccaaggccccggttgatgtgtatcatcttcacctctggcactaccgacaaaccaaaaggcgtcatggttccacatacctctgttgctcggtttgtcacatcaccgggcttcaactatgatatagtgccgggagaccgggtcttgttggtactttcggtagcattcgatggtatgttcgaatagcccgttctcattgaaatggcgaaactaatacggaatcgttagcatgcatgggtaccttgttcaacacgatttgtaacggaggaacagtgatcctggccaacagattaaactttcaggaacggtctcggcaatgcacggtccttgtcatgacgccgtcgattctggatgtgttgagccctcctcaatctccatcagactacccccaacttgagcgtattttccttggtggagagactccgtcacagcaattgctggaggcatggtcagctttcaacgacgtggctctgtggattgcctatggtccgaccgaagctacctgtgcagtgttgtgtggtcgtctacaagcatccagtgagactggccaattccatcccacgaggctagggcacagcatccccggctcgagtgtgctattgctcaccgagagaatggaaacaatccaagacagcaacatggaaggggaaatatgcatcgaaggcccatgtttgacggatgggtattggcaggatgaggaacgcacgaaggaccgattcatagaatatcacggacgacgtgtctaccgcactggcgacctcggtcgatttgtgaccacggaagataacgagaccgccatagaattttgtggacggcgtgatagggttaccaaaatccgagggtttttggttaatctagagttggacgtcgacgctggtcttcgacgtcttgatccgaatattaccgccgttttctccattctgctcgatagaaagctatgcacagcagtcgtgccatcgtcagttgattgtcgcaatctacaggcagcttggcggctggtggccccgccctacctcgtgcctgataagatggttgccctcgatggcctcccgctgacggcaaatggaaaattcgatcctcggcaagttatcagcattttgcgggatgcattgcaaaaagacgcgaccatgcagaatggtacatcgcacaataatggtgccgccaatgatcgaaagcagtacaactggcgttcaggccctttaacgattgaccagacgatcatcaaaggtcttcaacaggtcttaggaatctctcagtccgaaatcaatatgaaggactctgccgtgttccagggcgtacattcattggctgcagctagattgtcgacattttgccggcaccatggatacaatgtctctgtcgagagcatcctcacggagccatcccttcacgccttagttgagaaaaatcgccacgagacagagaatcgaccagatagctcggcatttgccacaagaacgccggaagaaagctctatgcccacccaaggaccagtgacgcccttgcagaagcggatggtcctcgacagtatagtggaggatcctagggccaattgcctccagcatatctcttggtataagacggaagacattggaaggctccgagaggcctggaaaacggtggtaacccatgagcccattttccagactacttttgagctggacgagacacaagagccatctcagagactcatcggtgctggactcttcatatgggaagagacaactgttaccacacacgcagccattaaagaaagcctcaaatctctccctgccgccaccggtcta
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55.步骤s2：携带有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株的获得；
56.取米曲霉(aspergillus oryzae)的孢子均匀涂抹在pda(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基，30℃培养一周即可获得大量米曲霉(aspergillus oryzae)孢子；取适量米曲霉(aspergillus oryzae)的孢子保存液接入到含有100ml的dpy培养基中，在30℃下、以200rpm的转速振荡培养2～3天，获得生长状态良好的米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体；在无菌环境中，利用已灭菌滤孔直径5mm的漏斗过滤收集菌体，将米曲霉(aspergillus oryzae)的菌体过滤收集后用无菌水洗涤3～5次，以清除菌体表面残留的培养基，获得干净的菌体，在漏斗中反复挤压除去水分。然后将菌体转移到50ml的灭菌离心管中，加入20ml细胞壁溶解液(由1.0％亚糖酶(takara shuzo)溶于溶液i中制成)，并在28℃的温度条件下，温和振荡2～3小时，获得原生质体，酶解过程中可以用显微镜观察原生质体化程度。
57.利用已灭菌的用miracloth滤布(merck germany)将酶解溶液过滤到50ml的灭菌离心管中，然后在4℃下以800rpm的转速离心10分钟，在超净台中轻轻倒出上层液体，底部沉淀为米曲霉(aspergillus oryzae)的原生质体，利用灭菌过的0.8m nacl溶液将原生质洗涤2次，按4:1比例配置适量的缓冲液ii和缓冲液iii的混合溶液，借助显微镜用混合溶液将原生质体浓度调成2
×
108cells/ml，取200ml的浓度调好的原生质体溶液到新的50ml的离心管中，再加入10μg表达质粒pma-cric，用移液枪轻轻吹打使混合体系充分混匀后进行20分钟冰浴，向混合体系加入1ml缓冲液iii，室温孵育20分钟，然后加入10ml缓冲液ii，混匀后，在4℃下以800rpm的转速离心10min，除去上清液后加入1ml缓冲液ii并用移液枪轻轻吹打混匀，混匀后移取200μl混匀液转移到改良的察氏培养基平板上，然后加入5ml、50℃的液体状态的覆盖培养基，加入覆盖培养基后轻晃摇匀使覆盖培养基与200μl混匀液混合均
匀，并均匀地覆盖在改良的察氏培养基平板表面，待覆盖培养基凝固后封平板，倒置培养3～7天。
58.待含有pma-cric的米曲霉转化子会在改良的察氏培养基平板表面长出菌丝后，并不断长大形成菌落。挑取适量菌丝到50μlte缓冲液(1m tris,0.5m edta,ph8.0)中，震荡混匀后取1μl为模版，以p1f和p1r为模版进行pcr验证，阳性转化子在相同的改良的察氏培养基平板进行2次继代培养，获得遗传稳定l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株(a.oryzae/pma-cric)。
59.所述的dpy培养基按以下步骤制备：2g糊精(dextrin)、1g聚蛋白胨(polypeptone)、0.5g酵母粉(yeast extract)、10mg腺嘌呤(adenine)、925mg硫酸铵、150mg甲硫氨酸(methionine)和60mg精氨酸(arginine)，加水定量至100ml。
60.所述的改良的察氏培养基按以下步骤制备：每200ml改良的察氏培养基含有7.0g察氏培养基(czapek-dox)、9.3g nacl、1.8g(nh4)2so4、20mg腺嘌呤(adenine)、300mg甲硫氨酸(methionine)和3g琼脂粉(agar)。
61.所述的覆盖培养基由1.2m山梨糖醇(sorbitol)和0.5％琼脂粉(agar)组成。
62.所述的溶液i由0.8m氯化钠溶液和10mm磷酸二氢钠溶液组成。
63.所述的溶液ii由1.2m山梨糖醇(sorbitol)、50mm氯化钙溶液、50mm氯化钠溶液和10mm氨基丁三醇(tris)组成，且ph调至7.5。
64.所述的溶液iii由40％聚乙二醇-4000(peg-4000)、50mm氯化钙溶液和50mm氨基丁三醇(tris)组成。
65.步骤s3：l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的制备；
66.将携带l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株(aspergillus oryzae/pma-cric)的菌丝接种于灭菌后的填装有大米(每个500ml三角瓶含50克大米和30ml水，大米浸泡三个小时后灭菌)的培养基中，并在28℃下静置培养两周；待菌丝覆盖培养基表面并产生大量孢子，菌体合成的l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽分泌在培养基中。宿主菌(aspergillus oryzae)与l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的高产菌株(aspergillus oryzae/pma-cric)代谢产物的乙酸乙酯粗提物的hplc分析如图2所示，l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的质谱特征和光谱特征如图3所示。
67.利用等量的乙酸乙酯对上述含有菌丝的培养基萃取3次，合并萃取液后低压浓缩获得发酵液浸膏。利用硅胶填料的正相色谱对发酵液浸膏进行粗分划段，利用tlc初步判断l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽分布的段，将含有l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的划段合并，然后利用c18填料的反相色谱进行细分，在利用tlc判断l-色氨酸-l-丙氨酸环二肽的所在位置，最后借助安捷伦hplc1260 infinity ii液相色谱仪，在275nm波长检测下进行制备，获得纯品(纯度》98％)。借助400m核磁仪确认了其结构，其结构数据(溶剂为氘代甲醇)如下；
68.[0069][0070]
上述分离制备过程用到的正相色谱填料为200-300目硅胶，反相色谱填料为c18色谱填料，制备所用的高效液相色谱仪为安捷伦1260infinity ii，色谱柱为安捷伦zorbax rx-c18，9.4
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250mm，检测波长为275nm。