甘蓝型油菜千粒重性状的主效QTL位点的SNP分子标记、相关检测引物或探针、及应用的制作方法

甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记、相关检测引物或探针、及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及油菜遗传育种技术领域，特别涉及甘蓝型油菜千粒重性状技术领域，具体是指一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记、相关检测引物或探针、及应用。


背景技术：

2.油菜是我国第一大油料作物，2011年至2020年，我国油菜单产从121.8kg仅增至138.5kg，单产偏低且增长缓慢；突破耐密高产多抗品种的选育是2030年实现油菜产油量倍增新绿色革命的重要举措。粒重是油菜单产的三要素之一,通过提高粒重实现单产倍增的高产品种创制，是突破耐密高产多抗品种选育的重要途径。油菜千粒重是典型的主基因+多基因控制的数量性状，受环境影响大，加性效应是千粒重基因遗传效应的主要成分，是基因聚合提高粒重的重要遗传基础。依靠传统的育种技术方法很难有大的突破，因此结合分子标记技术与数量遗传的方法，为油菜千粒重的遗传育种提供新的分子标记。
3.数量性状位点(qtl)定位已被证明是剖析其复杂遗传基础的有效策略，有助于分子标记辅助选择加速油菜育种。过去的一些研究已经报道了油菜种子产量相关性状的多个qtl，这些性状分布在油菜基因组的所有染色体上。在甘蓝型油菜参考基因组出现之前，qtl定位是通过简单序列重复(ssr)和低密度扩增片段长度多态性(aflp)标记进行的。近年来，随着全基因组测序的完成，分子标记技术的广泛应用，分子标记辅助选择(mas)技术的不断发展，油菜的千粒重性状相关的分子标记和qtl定位的研究成果越来越多。
4.因此，借助分子标记和数量性状位点(qtl)定位，在分子水平对甘蓝型油菜种子千粒重性状进行进一步研究，将有助于提高油菜产量，同时为揭示甘蓝型油菜中千粒重的遗传结构和分子机制奠定基础。
5.因此，希望提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记，其可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记，其可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
7.本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的 snp分子标记，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的 snp分子标记的应用，其可以用于检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
9.本发明的另一目的在于提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的 snp分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
10.本发明的另一目的在于提供一种用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点的snp分子标记的引物或探针，其可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
11.本发明的另一目的在于提供一种用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点的snp分子标记的引物或探针，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
12.本发明的另一目的在于提供一种用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点的snp分子标记的引物或探针的应用，其可以用于检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
13.本发明的另一目的在于提供一种用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点的snp分子标记的引物或探针的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
14.为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记，其特点是，所述snp分子标记与所述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点紧密连锁，所述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效 qtl位点位于甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基～第20310902位碱基之间。
15.较佳地，所述snp分子标记位于所述第20082973位碱基，所述第20082973 位碱基为a或g，该突变导致多态性。
16.较佳地，所述snp分子标记位于所述第20310902位碱基，所述第20310902 位碱基为g或a，该突变导致多态性。
17.在本发明的第二方面，提供上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的 snp分子标记在检测甘蓝型油菜千粒重的大小、预测甘蓝型油菜千粒重的大小、对甘蓝型油菜千粒重的大小进行选择或千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。
18.在本发明的第三方面，提供用于检测上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效 qtl位点的snp分子标记的引物或探针。
19.较佳地，所述引物或探针根据甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基的前后各400bp序列的dna片段为模板设计，所述dna片段如seq id no:1所示。
20.较佳地，所述引物或探针根据甘蓝型油菜的a07染色体的第20310902位碱基的前后各400bp序列的dna片段为模板设计，所述dna片段如seq id no:2所示。
21.在本发明的第四方面，提供上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的 snp分子标记的引物或探针在检测甘蓝型油菜千粒重的大小、预测甘蓝型油菜千粒重的大小、对甘蓝型油菜千粒重的大小进行选择或千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。
22.本发明的有益效果主要在于：
23.1、本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记与甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点紧密连锁，甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点位于甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基～第20310902位碱基之间，其可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
24.2、本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记与甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点紧密连锁，甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点位于甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基～第20310902位碱基之间，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
25.3、本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的应用，其可以用于检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
26.4、本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
27.5、本发明的用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针，其可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
28.6、本发明的用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
29.7、本发明的用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针的应用，其可以用于检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以用于对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
30.8、本发明的用于检测甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针的应用，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用。
31.本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、产品和它们的组合得以实现。
附图说明
32.图1是双亲本以及ril群体在多年多点环境下千粒重性状的表型鉴定，其中 a是双亲本在7个环境下的表型差异；b是158个重组自交系在7个环境下的表型分布，其中cs：长顺；tt：塘头；js：金沙；bd：巴东。
33.图2是构建的高密度遗传图谱以及高密度遗传图谱与甘蓝型油菜基因组物理图谱的共线性关系，其中a是遗传连锁图谱，b是遗传连锁图谱与基因组物理图的共线性关系。
34.图3是在单环境和多环境下千粒重性状的qtl鉴定，其中a是在7个环境单环境下鉴定的19个连锁群的qtl，纵坐标代表lod值，横坐标代表19个连锁群，其中cs：长顺；tt：塘头；js：金沙；bd：巴东；b是多环境下在lga07连锁群下的qtl鉴定，纵坐标代表lod值，横坐标代表lga07连锁群；c是lga07 连锁群上qtl的遗传位置，其中me代表多环境，se代表单环境。
35.图4是千粒重性状主效qtl位点的临界snp的效应分析，其中aa和bb分别代表千粒重大和千粒重小亲本临界snp的基因型；cs代表长顺。
具体实施方式
36.本发明人经过深入的研究，首次揭示一种甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点的snp分子标记，利用其可以有效地对甘蓝型油菜产量进行高效改良。
37.本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记与所述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点紧密连锁，所述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点位于甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基～第20310902 位碱基之间。
38.所述snp分子标记可以是任何合适的snp分子标记，较佳地，所述snp分子标记位于所述第20082973位碱基，所述第20082973位碱基为a或g，该突变导致多态性。
39.所述snp分子标记可以是任何合适的snp分子标记，较佳地，所述snp分子标记位于所述第20310902位碱基，所述第20310902位碱基为g或a，该突变导致多态性。
40.还提供上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记在检测甘蓝型油菜千粒重的大小、预测甘蓝型油菜千粒重的大小、对甘蓝型油菜千粒重的大小进行选择或千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。
41.还提供用于检测上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针。
42.所述引物或探针可以根据任何合适的dna片段为模板进行设计，较佳地，所述引物或探针根据甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基的前后各400bp 序列的dna片段为模板设计的，所述dna片段如seq id no:1所示。
43.所述引物或探针可以根据任何合适的dna片段为模板进行设计，较佳地，所述引物或探针根据甘蓝型油菜的a07染色体的第20310902位碱基的前后各400bp 序列的dna片段为模板设计的，所述dna片段如seq id no:2所示。
44.还提供上述的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记的引物或探针在检测甘蓝型油菜千粒重的大小、预测甘蓝型油菜千粒重的大小、对甘蓝型油菜千粒重的大小进行选择或千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种中的应用。
45.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条
件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
46.实施例1、甘蓝型油菜双亲本与ril群体的千粒重性状的表型的测定
47.(1)利用甘蓝型油菜darmor与白芥进行远缘杂交，在f2:3中挑选大籽粒株系grg2462，另外选择一小籽粒株系grd328与grg2462进行杂交，并连续自交11代得到的158个株系组成的重组自交系(甘蓝型油菜darmor来自于武汉油料作物种质资源库，白芥和小籽粒株系grd328均购于贵州禾睦福种子有限公司)，在贵州省多年多点(2014-2015年长顺，2016-2017年长顺，2017-2018年长顺，2017-2018年塘头，2017-2018年金沙，2017-2018年巴东，2018-2019年长顺)的千粒重性状进行调查。
48.(2)采用直播定苗,行距33cm,株距15cm，每个小区4行，随机设计三个重复。试验材料田块四周种植保护行。
49.(3)千粒重：每个小区取10株材料的成熟种子1000粒的重量。
50.ril群体的千粒重在多年多点的环境下分布结果表明千粒重性状的分布均呈正态分布，证明千粒重性状属于数量性状且存在主效基因位点，见图1所示。
51.实施例2、ril群体高质量snp数据集的获得
52.采用ctab方法提取叶片总dna，提取ril群体的每份材料的叶片总dna，具体方法为：
53.将幼嫩叶片置10％乙醇中漂洗；然后剪取0.1-0.2g叶片放入碾钵中，利用液氮快速碾磨至粉末状，装入2ml离心管中；加入预热dna提取液700μl；混匀后置65℃水浴锅中1h，每10-15min混匀1次；加入700μl混合液(苯酚：氯仿:异戊醇＝25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀10min；室温下，10 000
×
g离心15min；吸取上清液至新的2ml离心管中；加入等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，颠倒混匀，静置5min，10000
×
g，离心15min，用枪吸取上清液到新的离心管中；加入2倍体积无水乙醇，混匀后在
–
20℃静置1h，10 000
×
g，离心10min，弃上清液；再加入500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，去上清液；经过连续2次洗涤沉淀后，晾干；加入含有2％rnase a溶液100μl，在37℃静置1h后4℃过夜；用等体积混合液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)再次抽提dna溶液，颠倒混匀，静置 10min，10 000
×
g，离心15或20min，去除rnase a，吸取上清液(约60μl)，再次离心，1min；利用琼脂糖凝胶电泳(0.8％)和紫外分光光度计检测dna浓度、质量及完整性；确定所有dna样品的吸光度260/280比值在1.8-2.0之间。然后将dna样品干冰运输至测序公司(华大基因科技有限公司)，每个材料测序深度大约为7
×
。
54.根据上文描述获得高质量dna后，测序公司(华大基因科技有限公司)进行 7
×
覆盖深度的测序后返回的数据，先使用fastqc软件进行测序质量评估，然后对测序序列进行adapter和低质量reads过滤。得到每个材料的双端测序的cleandata，然后使用bwa软件进行mapping以及gatk软件进行变异检测，得到ril 群体总的snp数据集后，根据最小等位基因频率≥0.05，缺失率≤0.1和杂合率≤0.15进行snp数据集质量过滤，最终得到高质量的群体snp数据集用于后续分析。
55.实施例3、高密度遗传图谱的构建
56.根据上述实施例2得到高质量的群体snp数据集，利用madmapper (http://cgpdb.ucdavis.edu/xlinkage/madmapper/)和highmap软件 (http://highmap.biomarker.com.cn/)构建ril群体的高密度snp遗传连锁图谱。为了提高运算的速
度，首先利用madmapper软件中recbit程序去除冗余snp(两个或两个以上snp在群体内表现共分离)、在158个株系中数据缺失比例≥25％snp 及在群体内等位基因型分离比例＜0.33的snp；然后将余下的snp根据相互之间的重组率分配到各个连锁群；再利用highmap软件中的kosambi mapping功能将各连锁群上snp间的重组值转化为遗传距离cm；最后，利用highmap对构建的每个连锁群进行可视化检验。此外，也使用highmap对各连锁群上snp偏分离进行显著性检测(p《0.05)。ril群体遗传连锁群绘制完成后，采用国际统一命名标准，将甘蓝型油菜19条连锁群按其二倍体祖先来源分别命名为lga01-lga10和 lgc01-lgc09，如图2所示。
57.实施例4、单环境与多环境下的千粒重性状的qtl位点鉴定
58.同一环境下，以各株系所有区组的观测值的平均值作为表型值，用于qtl分析。采用windows qtl cartographer 2.5软件 (https://brcwebportal.cos.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm)中的复合区间作图法 (composite interval mapping,cim)对ril群体千粒重性状进行全基因组的qtl 扫描。参数设置时，选择向后回归的方法筛选协因子(cofactor)，背景标记数目设为5，扫描步长为1cm，窗口大小为10cm。在p＝0.05的概率条件下，采用1000 次的排布检验(permutation test)来确定每个环境下lod值的阀值。将lod值大于或等于阈值的qtl称为显著性qtl。通过分析，在单环境下千粒重性状的主效 qtl位点均在a07染色体上，见图3a所示。
59.多环境下，利用icimapping v4.1软件(https://isbreeding.caas.cn/rj/qtllcmapping/294445.htm)中的icim-add定位方法鉴定qtl 与环境的互作效应，lod的阈值与显著性分析均与单环境下一致。通过分析发现千粒重性状在多环境下的qtl同样在a07染色体上，见图3b所示。结合单环境下的qtl结果，千粒重性状的主效qtl位点在甘蓝型油菜a07染色体的第20082973位碱基～第20310902位碱基之间。
60.实施例5、千粒重性状的主效qtl位点在ril群体中的效应
61.根据在单环境下检测到的主效qtl位点，分析主效qtl位点临界snp在ril 群体中的单体型效应，通过分析，千粒重性状的主效qtl位点临界snp在158份 ril群体株系中表现出显著性的差异，见图4所示。
62.根据甘蓝型油菜的参考基因组序列 (https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)，包含chra07_20082973(a/g) 的前后各400bp序列(共801bp)如seq id no:1所示，包含chra07_20310902 (g/a)的前后各400bp序列(共801bp)如seq id no:2所示。
63.本领域技术人员可以采用常规方法根据上述已知序列设计检测snp位点的特异性引物或探针，所述引物或探针还可通过本领的常规技术标记有荧光基团，如 fam、hex、vic、rox等，以及淬灭基团如bhq1或tamra，从而可以通过本领域的常规方法如测序或pcr等方法检测上述snp位点的基因型，由此可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，预测甘蓝型油菜千粒重的大小，进而对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，用于千粒重的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程。
64.因此，本发明通过千粒重性状的表型分析和全基因组重测序，然后进行qtl 定位分析，在甘蓝型油菜a07染色体上检测到甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl 位点。该甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点分别位于甘蓝型油菜的a07染色体的第20082973位碱基～
第20310902位碱基之间和a07染色体的第11378925位碱基～第11559658位碱基之间。本发明的甘蓝型油菜种子千粒重的主效qtl位点对甘蓝型油菜千粒重的调控起着关键作用，可用作图位克隆和分子标记辅助选择。根据与上述主效qtl位点紧密连锁的snp分子标记，可以用于检测甘蓝型油菜千粒重的大小，预测甘蓝型油菜千粒重的大小，进而对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，用于千粒重的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程。
65.通过本发明公布的snp分子标记进行分子标记辅助选择，鉴定方法简单，选择效率高，可预测甘蓝型油菜千粒重。选择目标明确，不受环境的影响。可在甘蓝型油菜生育早期鉴定出千粒重大的甘蓝型油菜单株，淘汰其它单株。
66.综上，本发明的甘蓝型油菜千粒重性状的主效qtl位点的snp分子标记可以检测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以预测甘蓝型油菜千粒重的大小，可以对甘蓝型油菜千粒重的大小进行有效选择，还可以用于千粒重大的甘蓝型油菜的分子标记辅助育种，加速甘蓝型油菜千粒重育种的进程，适于大规模推广应用。
67.由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
68.69.