一种农产品重金属口腔健康风险的评估方法

1.本发明涉及人体健康风险评估技术领域，特别涉及一种评价农产品中重金属口腔健康风险的方法。


背景技术：

2.经口摄入是人体暴露重金属最主要的途径之一，摄入被重金属污染的农产品尤其是矿区周边的农产品可能对人体产生健康风险。因此，建立一种评价农产品中重金属健康风险评价的方法至关重要。
3.前人采用美国环保局推荐的健康风险评价模型对农产品重金属健康风险评价进行了大量的研究。然而，该模型基于重金属总量进行健康风险评估，并未考虑生物可给态重金属及其对人体组织或细胞的毒性效应，这可能会高估重金属的健康风险，难以准确的评估重金属实际造成的人体健康风险。
4.鉴于此，本发明提供了一种基于生物可给态重金属对人细胞的毒性效应的人体健康风险评价方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种评价人体健康风险的方法，以解决现有技术中导致的上述多项缺陷。
6.为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种农产品重金属口腔健康风险的评估方法，包括如下步骤：
7.1)农产品前处理，取可食部分，自来水清洗干净，再用去离子水洗三次，在75℃下干燥至恒重，然后用陶瓷研钵磨碎，过筛，放入冰箱保存备用；
8.2)重金属总含量和生物可给态重金属含量的测定，用浓hno3和 30％h2o2消解农产品样品，然后用icp-ms进行金属总含量分析；将农产品样品溶解在20ml人工唾液中，进行离心处理，上层清液通过 0.22-μm滤膜分别收集在两个离心管中；其中一管的上清液用 icp-ms分析生物可给态重金属含量，另一管的上清液通过0.22μm 无菌滤膜，保存在无菌管中用于后续实验；
9.3)口腔细胞检测，从细胞活力、细胞凋亡检测、dna损伤检测和基因表达水平检测四个方面判定细胞毒性；
10.4)通过细胞毒性评估农产品重金属的健康风险。
11.优选的，所述步骤2)中，选取的农产品样品为干重0.20g。
12.优选的，所述步骤2)中，生物可给态重金属含量测定时，在150 rpm，37℃条件下振荡离心24小时。
13.优选的，所述步骤3)中，口腔细胞检测包括以下步骤，
14.1)细胞培养、暴露，将人牙龈上皮细胞培养在37℃，5％co2，添加了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的高糖培养基中进行培养，隔天换液；将步骤2)中获得的农产品人工
唾液提取液与高糖培养基以一定比例混合，得到暴露液；将暴露液加入6/24/96孔板，孵育 24h，人工唾液作为空白对照；
15.2)判断细胞形态、活力，将人牙龈上皮细胞以8
×
103细胞/100 μl/孔的密度接种于96孔板中24h，然后用暴露液处理24h后；用倒置显微镜拍下细胞形态，同时，采用细胞计数试剂盒-8检测试剂盒测定细胞活力；
16.3)细胞凋亡检测，将人牙龈上皮细胞接种于6孔板中孵育24小时，其中每孔1
×
106个细胞，然后用暴露液处理24h后；收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液洗涤3次，用500μl pbs结合缓冲液室温避光浸泡15min，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况；
17.4)dna损伤检测，将人牙龈上皮细胞在5
×
104个细胞/孔的24 孔板中孵育24h，然后在37℃下用暴露液处理24小时；之后用磷酸盐缓冲液对细胞进行冲洗，随后，在4℃环境下γ-h2ax孵育过夜；在室温下保持1小时，细胞在磷酸盐缓冲液浸泡5分钟，然后添加山羊孵化anti-rabbit免疫球蛋白(h+l)在室温下静置1小时；最后，细胞在黑暗环境中用dapi染色10分钟，使用倒置显微镜系统观察和拍摄免疫荧光图像；
18.5)基因表达水平检测，暴露后，使用总rna分离试剂盒提取人牙龈上皮细胞总rna，用紫外-可见分光光度计测定rna的浓度和质量，用试剂盒完成从rna到cdna的逆转录过程。
19.优选的，所述细胞培养步骤中，当细胞铺满培养皿底面积的80％时，添加1ml胰蛋白酶消化细胞，并重新接种于6/24/96孔板中24h。
20.优选的，所述细胞凋亡检测和dna损伤检测步骤中，pbs结合缓冲液含5μl annexin v-fitc和5μl pi染色液。
21.优选的，所述细胞用磷酸盐缓冲液冲洗三次,然后用4％多聚甲醛固定30分钟，再用10％triton x-100处理15分钟；之后，再用磷酸盐缓冲液清洗三次后，1％bsa处理60分钟。
22.采用以上技术方案的有益效果是：本发明中，结合化学、细胞生物学、毒理学等学科知识，通过调研、检测、分析等手段，提出了另外一种农产品重金属人体健康评价模型，该模型弥补了前人仅靠数学模型(无生物成分)无法准确的评估人体健康风险的缺点，为人体健康风险评价提供了更科学、准确的评价手段，同时还可以为阻控重金属的危害提供基础数据。
附图说明
23.图1为一种口腔暴露评价模型与人体健康风险评价方法的流程图；
24.图2为野菜中重金属种类及含量分析图；
25.图3为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞形态及活力的变化特征图；
26.图4为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞凋亡特征图；
27.图5为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞dna损伤的情况图；
28.图6为提取液暴露牙龈上皮细胞后，与细胞凋亡和dna损伤相关基因表达情况图
具体实施方式
29.本发明的具体方法如下，一种农产品重金属口腔健康风险的评估方法，包括如下步骤：
30.1)农产品前处理，取可食部分，自来水清洗干净，再用去离子水洗三次，在75℃下干燥至恒重，然后用陶瓷研钵磨碎，过筛，放入冰箱保存备用；
31.2)重金属总含量和生物可给态重金属含量的测定，重金属总含量参照美国环保署3050b方法测定，用浓hno3和30％h2o2消解农产品样品(选取的农产品样品为干重0.20g)，然后用icp-ms进行金属总含量分析。采用人工唾液提取农产品中生物可给态重金属，将农产品样品(选取的农产品样品为干重0.20g)溶解在20ml人工唾液中，在150rpm，37℃条件下振荡离心24小时。进行离心处理，上层清液通过0.22-μm滤膜分别收集在两个离心管中；其中一管的上清液用icp-ms分析生物可给态重金属含量，另一管的上清液通过 0.22μm无菌滤膜，保存在无菌管中用于后续实验；
32.3)口腔细胞检测，从细胞活力、细胞凋亡检测、dna损伤检测和基因表达水平检测四个方面判定细胞毒性；口腔细胞检测包括以下步骤，
33.1)细胞培养、暴露，将人牙龈上皮细胞培养在37℃，5％co2，添加了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的高糖培养基中进行培养，隔天换液，当细胞铺满培养皿底面积的80％时，添加1ml胰蛋白酶消化细胞，并重新接种于6/24/96孔板中24h；将步骤2)中获得的农产品人工唾液提取液与高糖培养基以一定比例混合，得到暴露液，这个比例不一定完全一样，得去尝试。根据暴露液的毒性，如果毒性太强，比例就低一些，因为毒性太高，细胞都死了，没有办法进行基因水平的检测；将暴露液加入6/24/96孔板，孵育24h，人工唾液作为空白对照；
34.2)判断细胞形态、活力，将人牙龈上皮细胞以8
×
103细胞/100 μl/孔的密度接种于96孔板中24h，然后用暴露液处理24h后；用倒置显微镜拍下细胞形态，同时，采用细胞计数试剂盒-8检测试剂盒测定细胞活力；
35.3)细胞凋亡检测，将人牙龈上皮细胞接种于6孔板中孵育24小时，其中每孔1
×
106个细胞，然后用暴露液处理24h后；收集细胞，用冷磷酸盐缓冲液洗涤3次，用500μl pbs结合缓冲液室温避光浸泡15min，使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，该pbs结合缓冲液含5μl annexin v-fitc和5μl pi染色液；
36.4)dna损伤检测，将人牙龈上皮细胞在5
×
104个细胞/孔的24 孔板中孵育24h，然后在37℃下用暴露液处理24小时；细胞用磷酸盐缓冲液冲洗三次,然后用4％多聚甲醛固定30分钟，再用10％triton x-100处理15分钟；之后，再用磷酸盐缓冲液清洗三次后，1％bsa 处理60分钟，随后，在4℃环境下γ-h2ax孵育过夜；在室温下保持 1小时，让它复温到室温，细胞在磷酸盐缓冲液浸泡5分钟，然后添加山羊孵化anti-rabbit免疫球蛋白(h+l)在室温下静置1小时；最后，细胞在黑暗环境中用dapi染色10分钟，使用倒置显微镜系统观察和拍摄免疫荧光图像；
37.5)基因表达水平检测，暴露后，使用总rna分离试剂盒提取人牙龈上皮细胞总rna，用紫外-可见分光光度计测定rna的浓度和质量，用试剂盒完成从rna到cdna的逆转录过程。
38.4)通过细胞毒性评估农产品重金属的健康风险。
39.下面详细说明本发明的优选实施方式。
40.参考附图描述本技术实施例的农产品重金属口腔健康风险的评估方法。具体的方法流程如图1所示，该农产品重金属口腔健康风险的评估方法包括以下步骤：
41.步骤(1)，野菜中重金属种类及含量分析。结果如图2所示，pam、 pal、cal、tmm代表
不同的野菜种类。
42.步骤(2)，建立口腔暴露评价模型。
43.步骤(3)，基于野菜中重金属种类及含量特征，使用体外模拟结合口腔细胞模型实现野菜中生物可给态重金属通过经口摄入途径暴露造成的健康风险。
44.结果如图3、4、5、6所示，图3为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞形态及活力的变化特征，ck为实验对照，可以看出，与ck相比，除了pal外，细胞形态发生了明显的变化；而细胞活力则都有不同程度的降低，说明不同野菜提取液对牙龈上皮细胞产生了不同程度的毒性。图4为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞凋亡特征，从图4可以看出，除了pal外，其他野菜提取液暴露后细胞均发生了明显的凋亡。图5为提取液暴露牙龈上皮细胞后，细胞dna损伤的情况，图中dapi 和γ-h2ax组合图(merge)中白色圆点越多，则说明dna损伤越严重。从图中可以看出，除了pal外，其他野菜提取液暴露后细胞均发生了明显的dna损伤。图6为提取液暴露牙龈上皮细胞后，与细胞凋亡和dna损伤相关基因表达情况，可以看出，pam暴露细胞后， caspase-3、-8、-9、gadd45α均发生了显著的上调，说明pam有很可能是通过改变caspase-3、-8、-9、gadd45α基因的表达，造成了dna损伤，进一步诱导了细胞凋亡。
45.根据上述数据可以得出，野菜提取液暴露细胞后，各项细胞毒性指标均发生了明显的变化，这说明食用重金属含量高的野菜可能会对人体口腔造成危害，存在潜在的健康风险。
46.本发明提供了一种基于体外模拟结合细胞模型的方法来评估农产品中重金属的人体健康风险，相比传统的健康风险评价模型，更准确的评估了重金属的健康风险。
47.以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。