烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应用的制作方法

烟草腺毛启动子pntggpps2a及其应用
技术领域
1.本技术涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及烟草腺毛启动子pntggpps2a及其应用。


背景技术：

2.腺毛是植物表皮细胞分化形成的特殊结构。腺毛能合成、储存和分泌一系列次生代谢物(如生物碱、尼古丁和萜烯等)来保护植物免受食草动物和昆虫的侵害，此外，腺毛又被称为代谢物合成的“小型工厂”，一些特殊的代谢物已成为具有重要商业价值的杀虫剂、食品添加剂、香料或药物成分等，如黄花蒿(artemisia annua)中的青蒿素、薄荷(mentha spicata)中的薄荷醇、大麻(cannabis sativa)中的大麻素等代谢物都主要在腺毛中合成和储存。
3.烟草(nicotiana tabacum l.)是一种重要的经济作物，烟草腺毛分泌物主要为西柏烷二萜、糖酯、烷烃以及挥发性的醛、酮、酸等组成的混合物，约占鲜烟叶重的0.5～10％，其中大部分成分对烟叶香气有重要贡献。研究表明，西柏烷二萜合成途径中的二个关键酶基因cbts、cyp71d16均在腺毛中特异表达。
4.启动子是位于基因5'端上游的一段dna序列，它能被rna聚合酶识别并结合，调控目的基因在特定的时间或空间表达。
5.来自花椰菜花叶病毒的camv35s是目前植物基因工程中常用的组成性表达启动子，它可驱动目的基因在植物的任何发育阶段及组织部位中表达，但如果应用于生产次生代谢物时，这种组成性表达往往会使目的产物在整个植物体内积累，从而使植物生长出现异常。


技术实现要素：

6.现有技术中，常选用来自花椰菜花叶病毒的camv35s作为植物基因工程中组成性表达启动子，如上所述，camv35s启动子用于植物体内生产次生代谢物时，表达往往会使目的产物在整个植物体内积累，从而使植物生长出现异常，因而不利于提高烟草腺毛分泌产生对烟叶香气有重要作用的成份。
7.有鉴于此，腺毛组织特异性启动子能驱动目的基因在腺毛中特异表达，有效避免了外源基因表达(或内源基因过表达)时，对植物生长发育造成危害。因此，本技术构思在于提供一种烟草腺毛启动子，所述启动子驱动目的基因在烟草腺毛的特异表达。
8.第一方面，本技术实施例公开了一种烟草腺毛启动子pntggpps2a，所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特异表达，所述启动子核苷酸序列为(i)或(ii)的一种：
9.(i)如seq id no.1所示；
10.(ii)与seq id no.1限定的dna序列具有90％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列。
11.第二方面，本技术实施例提供了扩增第一方面所述启动子的引物对，所述引物对
的序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
12.第三方面，本技术实施例提供了第一方面所述启动子的制备方法，其制备方法如下：
13.提取烟草基因组dna；
14.从基因组dna中克隆启动子pntggpps2a；
15.启动子pntggpps2a进行顺式作用元件分析；
16.构建pcambia1391z-pntggpps2a::gus植物表达载体；
17.培养烟草无菌苗，并将pcambia1391z-pntggpps2a::gus载体遗传转化至烟草无菌苗中，获得转基因烟草；
18.对转基因烟草进行gus染色；
19.qrt-pcr检测ntggpps2a基因在烟草腺毛中的相对表达情况。
20.进一步地，所述的遗传转化过程是通过农杆菌介导将重组质粒转化至烟草中。
21.第四方面，本技术实施例提供了第一方面所述启动子在烟草基因工程育种的应用，具体为：
22.所述启动子驱动目的基因在烟草腺毛部位表达，高效生产次生代谢物以定向培育高香气烟草新品种。
23.第五方面，本技术实施例公开了一种核酸分子，所述核酸分子包含第一方面所述启动子的序列。
24.第六方面，本技术实施例公开了包含第五方面的核酸分子的嵌合基因，所述核酸分子嵌合连接至异源核酸分子。
25.在本技术实施例中，所述异源核酸分子编码蛋白或肽。
26.第七方面，本技术实施例公开了包含第五方面的核酸分子的载体。
27.第八方面，本技术实施例公开了包含第七方面的载体的宿主细胞。
28.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
29.本技术为烟草分子育种提供了一种新方法。这种方法包括将启动子pntggpps2a与目标基因连接后转入烟草中，通过该启动子在腺毛组织中驱动目的基因的表达，提高生产次生代谢物的效率，对于烤烟新品种选育、提高烟草的香气品质都具有十分重要的价值。
附图说明
30.图1为本技术实施例提供的启动子pntggpps2a的pcr扩增电泳图。
31.图2为本技术实施例提供的启动子pntggpps2a顺式作用元件分析图。
32.图3为本技术实施例提供的pcambia1391z-pntggpps2a::gus载体构建图。
33.图4为本技术实施例提供的pcambia1391z-pntggpps2a::gus转基因烟草叶片gus染色图。
34.图5为本技术实施例提供的ntggpps2a基因在烟草不同组织中的相对表达量。
具体实施方式
35.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于
限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
36.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本技术的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本技术的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本技术的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本技术实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
37.在本技术中，术语“基因”指表达特定蛋白质或功能rna分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5
′
非编码区)和之后的调节序列(3
′
非编码区)。
38.在本技术中，“天然基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
39.本技术中“元件”是指(upstream promoter elements)包括通常位于-70bp附近的caat盒和gc盒、以及距转录起始点更远的上游元件。
40.在本技术中，“启动子”指能够控制编码序列或功能rna的表达的dna序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3
′
端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的dna片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。
41.在本技术中，术语“表达”指转录和衍生自基因的编码rna(mrna)或功能rna的稳定积聚，也可指将mrna翻译成多肽或蛋白。
42.在本技术中，术语“信使rna(mrna)”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的rna。
43.在本技术中，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
44.在本技术中，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链dna分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链dna或rna的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和dna序列与相应的3
′
末端非翻译序列一起引入细胞中。
45.在本技术中，术语“嵌合连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列嵌合连接。编码序列可以以有义或反义的取向嵌合连接至调节序列。对应的，“嵌合基因”是指经过“嵌合连接”在一起的核酸序列，例如可以是启动子与其能够影响的编码序列“嵌合连接”在一起形
成的。
46.在本技术中，术语“异源”指不天然存在于受关注的位点。例如“异源基因”是指不天然存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。例如存在于嵌合基因中的异源核酸分子是不与嵌合基因中的其他片段一起天然存在的核酸分子，如具有彼此不天然相关联存在的编码区和启动子片段的核酸分子。
47.在本技术中，“核酸分子”是rna或dna的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。dna聚合物形式的核酸分子可由cdna、基因组dna或合成dna的一个或多个区段构成。
48.为了更好地理解本技术而不是限制本技术的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
49.本技术下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
50.本技术揭露了烟草腺毛启动子pntggpps2a及其应用，本技术所涉及的植物基因组dna提取试剂盒购自美国axygen公司；高保真酶2
×
transstart kd plus pcr supermix、无缝克隆试剂盒-basic seamless cloning and assembly kit、质粒提取试剂盒easypure plasmid miniprep kit、胶回收试剂盒easypure quick gel extraction kit购自北京全式金生物技术有限公司；烟草遗传转化及筛选相关培养基购自北京酷来搏科技有限公司；gus染色液购自北京百瑞极生物科技有限公司；农杆菌gv3101、大肠杆菌dh5α、质粒pcambia1391z可通过公开市售的商业渠道获得；rna提取试剂盒easypure plant rna kit、cdna反转录试剂盒easyscript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix购自北京全式金生物技术有限公司；qrt-pcr试剂盒tb green premix dimereraser购自takara-宝日医生物技术(北京)有限公司；qrt-pcr实验所用仪器型号为viia7，购自美国applied biosystems公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
51.下面将结合本技术实施例，对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述。
52.启动子pntggpps2a的克隆及pcambia1391z-pntggpps2a::gus载体构建
53.采用植物基因组dna提取试剂盒(axygen，ap-mn-ms-gdna-50)，按照说明书的方法，提取栽培烟草品种“k326”的基因组dna。选取ntggpps2a基因起始密码子atg 5'端上游1.7kb左右的核苷酸序列作为候选启动子区域，设计特异引物进行pcr扩增，引物序列如下：
54.pntggpps2a-f1:如seq id no.2所示；
55.pntggpps2a-r1:如seq id no.3所示。
56.采用高保真酶2
×
transstart kd plus pcr supermix从基因组dna中克隆目的片段，pcr反应体系如表1所示：
57.表1
[0058][0059]
反应条件如表2所示：
[0060]
表2
[0061][0062]
pcr扩增结束后，采用胶回收试剂盒回收目的pcr产物，其pcr产物电泳图如图1所示，产物大小约1.7kb。
[0063]
用无缝克隆试剂盒按说明书操作将回收产物构建到pcambia1391z植物表达载体(经hind iii、bamh i双酶切)，将重组产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，菌液涂布于固体lb(含100mg/l卡那霉素)平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆测序，经过序列比对，将测序正确的启动子序列命名为pntggpps2a，长度为1656bp，序列信息如seq id no.1所示。构建好的载体即为pcambia1391z-pntggpps2a::gus，其结构示意图如图2所示。
[0064]
启动子pntggpps2a顺式作用元件分析
[0065]
采用在线网站plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对获得的启动子序列pntggpps2a进行顺式作用元件预测(如图3所示)，预测发现pntggpps2a除了tata框、caat框等启动子核心序列以外，还有光响应元件ace、box4、g-box、tct-motif；厌氧诱导响应元件are；生长素应答元件auxrr-core；干旱应答元件dre1；乙烯应答元件ere；低温响应元件ltr；参与脂肪酸代谢的转录因子结合元件stre；myc转录因子结合位点tctctta；myb转录因子结合位点taactg；wrky转录因子结合位点ttgacc；以及aagaa-motif等其它功能元件。
[0066]
以上分析结果表明，说明ntggpps2a基因可能处于复杂的调控之下。
[0067]
培养烟草无菌苗
[0068]
在超净工作台中，用75％乙醇将烟草种子表面消毒30s，再用10％(v/v)h2o2浸泡10min，无菌水冲洗5次，在无菌纸上吸干水分，将种子播于ms固体培养基，30d后获得的无菌苗用于遗传转化。
[0069]
pcambia1391z-pntggpps2a::gus遗传转化烟草
[0070]
(1)将上述构建的质粒pcambia1391z-pntggpps2a::gus转化至gv3101农杆菌感受态细胞。
[0071]
(2)将上述培养获得的无菌苗的叶片，在超净工作台内用手术刀切至0.8cm2左右
大小的叶盘，接种到共培养基中预培养2d。
[0072]
(3)用含有质粒pcambia1391z-pntggpps2a::gus的农杆菌按照以下步骤遗传转化烟草叶盘：
[0073]
a.取最佳对数生长期的农杆菌菌液，离心收集菌体后用无菌水稀释，将叶盘置于菌液中侵染10min，取出叶盘，用灭菌的滤纸吸干叶盘表面的菌液，然后转移至共培养基，于25℃暗培养2d。
[0074]
b.用含有160mg/l timentin的无菌水将叶盘清洗3次，吸干水分，转移到含有相应抗生素的筛选培养基，于25℃、16h/d光照条件下筛选培养，每15～20d更换一次培养基。
[0075]
c.将长至1cm以上的抗性芽沿基部切下，转移至含有相应抗生素的1/2ms培养基，小苗生根后炼苗移栽。
[0076]
实验过程中所用的培养基具体为：
[0077]
共培养基：ms培养基+1.5mg/l 6-ba
[0078]
筛选培养基：ms培养+1.5mg/l 6-ba+10mg/l hyg+160mg/l timentin
[0079]
生根培养基：1/2ms培养基+0.1mg/l naa+10mg/l hyg+160mg/l timentin
[0080]
以上培养基配制好后，将ph值调至5.8～5.9，121℃高温高压灭菌20min备用。
[0081]
启动子pntggpps2a驱动gus基因在腺毛细胞特异表达
[0082]
取t0代转基因阳性植株叶片进行gus染色。具体操作如下：
[0083]
将烟草叶片加入预冷的90％(v/v)丙酮固定20min，用ddh2o冲洗丙酮，加入gus染液并使之没过叶片，置于37℃恒温箱中过夜染色。染色后分别用50％、75％、100％乙醇将叶片脱色至溶液为无色，以排除颜色干扰，用体式显微镜观察并进行拍照。
[0084]
gus染色结果如图4所示，gus基因在叶片的分泌型腺毛中表达(图中灰色点状)，而在其它非腺毛组织中均不表达。说明启动子pntggpps2a能驱动目的基因在烟草腺毛组织中特异表达。
[0085]
ntggpps2a基因组织表达特性分析
[0086]
为了进一步确定ntggpps2a基因在叶片腺毛中特异表达情况，选取栽培烟草“k326”的根、茎、叶、花、腺毛及去腺毛叶片组织；腺毛的收集如下：取现蕾期10d的烟草上部叶，采用液氮冻刷法，从叶片表面轻轻刮取腺毛组织，刮除腺毛的叶片即为去腺毛叶片。
[0087]
提取上述各组织的总rna并反转录成cdna，采用β-actin作为内参基因，采用实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr,qrt-pcr)检测ntggpps2a基因在烟草不同组织中的相对表达量。
[0088]
qrt-pcr扩增引物序列如下：
[0089]
ntggpps2a-q-f1:如seq id no.4所示；
[0090]
ntggpps2a-q-r1:如seq id no.5所示；
[0091]
actin-q-f1:如seq id no.6所示；
[0092]
actin-q-r1:如seq id no.7所示。
[0093]
qrt-pcr反应体系如表3所示：
[0094]
表3
[0095]
试剂使用量tb green premix dimereraser(预混液)10μl
rox reference dye ii(参比染料)0.4μl引物16μm引物26μmcdna模板2μlddh2o混合液至20μl
[0096]
反应条件如表4所示：
[0097]
表4
[0098][0099]
通过熔解曲线分析pcr反应产物，结果如图5所示，从图中可以看出以下结论：
[0100]
ntggpps2a基因在叶及花中有少量表达，其次是茎；
[0101]
ntggpps2a基因在根中几乎不表达；
[0102]
ntggpps2a基因在腺毛中大量表达，而在去腺毛叶片中的表达量极低；
[0103]
上述结果表明ntggpps2a基因在烟草叶片腺毛组织中特异表达。
[0104]
综上所述，本技术烟草腺毛启动子pntggpps2a及其应用，所述启动子核苷酸序列为seq id no.1所示或与seq id no.1限定的dna序列具有90％以上同源性，且具有相同的启动子活性的序列；所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特异表达。将启动子pntggpps2a与目的基因连接后转入烟草中，通过该启动子在腺毛组织中驱动目的基因的表达，提高生产次生代谢物的效率，对于烤烟新品种选育、提高烟草的香气品质都具有十分重要的价值。
[0105]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。