OsHLS1在获得半矮化水稻中的应用

oshls1在获得半矮化水稻中的应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体来说涉及oshls1在获得半矮化水稻中的应用。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.)是世界上最重要的粮食作物之一,约有一半人口以其为主食。从粮食安全较角度来说，水稻的产量具有重要的战略意义。株高发育状况对于产量的影响有着举足轻重的地位。水稻的株高过高会限制水稻的结实率以及发生易倒伏等问题，这些问题也限制了对水稻产量进一步挖掘的能力(李荣田等.水稻倒伏对产量影响及倒伏和株高关系的研究[j].黑龙江农业科学,1996(01):13-17.)。
[0003]
培育半矮化的水稻品种是促进水稻高产的一种重要途径。传统的育种方式是在自然条件下选育出自然矮化的水稻或者通过杂交的方式选育出矮杆高产的株系。然而，一方面在自然条件下可供选育的矮化水稻极为有限；另一方面，通过自然条件和杂交选育的方式选育矮化水稻需要大量的人力、物力以及时间；再者，传统的育种方式很大程度上会造成水稻矮化株系单一，可能会造成新的问题产生。因此，亟需新的技术手段培育半矮化高产水稻品种。
[0004]
矮化育种在水稻育种史上是一个重大突破，上世纪50年代末水稻半矮秆基因sd-1的应用掀起了农业生产的第一次“绿色革命”，其产量几乎增加了1倍。在后来的研究当中陆续鉴定出大量有关水稻株高的基因，但是真正能得到广泛推广和利用的少之又少。利用sd-1半矮秆株系与植株明显偏高的株系或其它常规株系及不育系杂交，可育得正常株高的水稻株系品种。常规的育种方式也相继得到一批携带半矮杆基因的水稻品种，如：20世纪60年代的“绿色革命”以矮秆高产良种ir8为标志[hedden p et al.揭示赤霉素代谢相关基因的新见解。植物科学的趋势。2000年12月；5(12):523-30(hedden p et al.gibberellin metabolism:new insights revealed by the genes.trends plant sci.2000dec；5(12):523-30)]，其产量有一定层度的提高。传统的水稻育种方式使得其矮化基因遗传单一的问题越来越突出，已严重影响了水稻产量的持续提高。所以，发掘和鉴定控制水稻株高的基因，开展相应的基因定位、克隆和作用机理等方面的研究，寻找优良性状水稻新资源，实现水稻株高的合理定向的遗传改良具有重要意义。
[0005]
近年来，随着生物技术的逐步发展，现代分子生物学技术在水稻育种方面有着举足轻重的作用。利用crispr/cas9技术可以对目标基因进行精准的定向编辑。crispr/cas9技术可以在dna靶位点产生dna双链断裂，从而对dna双链进行插入、缺失、点突变等，实现对dna双链进行编辑获得相应突变株系。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的oshls1在获得矮化水稻中的应用，利用crispr/cas9技术对该基因进行定点编辑造成双链断裂，对dna双链进行插入、缺失、点突
变，从而获得通过对基因定点编辑的突变类型，并得到一定程度矮化的水稻株系，从而培育半矮化水稻品种。
[0007]
本发明采用以下技术方案。
[0008]
本发明的oshls1在获得矮化水稻中的应用，oshls1的核苷酸序列如seq id no.3如示，所编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
[0009]
上述的oshls1在获得矮化水稻中的应用，使用crispr/cas9基因编辑技术对oshls1进行定点编辑的靶点为：sgrna靶点1序列的选择：序列为5
′‑
caagactttgcccgcctgattgg-3
′
(seqid no.1)。
[0010]
上述的oshls1在获得矮化水稻中的应用，使用crispr/cas9基因编辑技术对oshls1进行定点编辑的靶点为：sgrna靶点2序列的选择：序列为5
′‑
tcttcttctcagcctgcttctgg3
′
(seqid no.2)。
[0011]
上述的oshls1在获得矮化水稻中的应用，利用水稻控制株高相关蛋白oshls1的编码基因oshls1的crispr/cas9的载体构建。
[0012]
本发明利用crispr-cas9系统功能敲除oshls1获得矮化水稻的方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)oshls1的获得：以日本晴的cdna为模板，用如下引物oshls1-f和oshls1-r进行pcr扩增获得目的基因，其中下划线部分为酶切位点；
[0014]
oshls1-f：catatgatggaaaaggccgcgg
[0015]
oshls1-r：gaattcttatatctctctgtaaaggttgagc
[0016]
将扩增产物回收后，连接进入t载体pclone007中，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆后，进行测序；
[0017]
测序结果表明，该基因长度为672bp，序列如seq id no.3所示的核苷酸序列，命名为oshls1；oshls1编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.4所示，将该蛋白命名为oshls1；
[0018]
(2)oshls1 sgrna位点crispr/cas9载体构建：
[0019]
以bsai酶切crpspr/cas9载体pegcas9pubi-h，回收线性化17kb大小的片段，命名为pegcas9pubi-h-bsai；
[0020]
(3)人工合成引物：
[0021]
sgrna1-f：caagactttgcccgcctgattgg
[0022]
sgrna1-r：ccaatcaggcgggcaaagtcttg
[0023]
将sgrna1-f与sgrna1-r稀释到10pmol，于pcr管中各加入1μl，后加入8μl ddh2o；95℃10min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10min，完成退火；得到sgrna模板；
[0024]
(4)第一轮重叠pcr和巢式pcr扩增sgrna表达盒：
[0025]
osu6启动子的扩增
[0026]
以u-f:ctccgttttacctgtggaatcg；osu6at1:atcaggcgggcaaagtcttgcggcagccaagccagca；osu6bt2:gaagcaggctgagaagaagacaacacaagcggcagc为引物osu6为模板，扩增osu6启动子；
[0027]
sgrna表达盒扩增
[0028]
以grt1:caagactttgcccgcctgatgttttagagctagaaat；grna-r::cggaggaaaattccatccac为引物，sgrna为模板，扩增sgrna表达盒；
[0029]
(5)第二轮pcr扩增sgrna表达盒
[0030]
以pps-r:ttcagaggtctctaccgactagtatggaatcggcagcaaagg；
[0031]
pgs-l:agcgtgggtctcgctcgacgcgtatccatccactccaagctc为引物，第一轮osu6启动子产物和第一轮sgrna产物为模板，扩增sgrna表达盒；
[0032]
(6)pegcas9pubi-h-bsai载体与sgrna表达盒的连接
[0033]
取pegcas9pubi-h-bsai载体7μl，sgrna表达盒1μl，t4连接酶(t4ligase)1μl，t4连接酶缓冲液(t4 ligase buffer)1μl，16℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆后，进行测序；
[0034]
(7)oshls1基因编辑的转基因水稻株系的制备：
[0035]
将crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2通过冻融法转化进入根癌农杆菌eha105(购于上海唯地生物技术有限公司)，得到含有crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2的重组根癌农杆菌eha105；以此重组根癌农杆菌eha105介导转化日本晴，将500μl含有crispr/cas9-sgrna1或crisp r/cas9-sgrna2重组质粒的农杆菌eha105种子液接种至50ml yep液体培养基中，控制温度为26℃培养12h,收集菌液,并用yep液体培养基进行稀释,至含有crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2重组质粒的农杆菌的菌液浓度为od
600
≈0.5，将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤1的稀释菌液混合侵染30min，采用滤纸吸干菌液后转入n6固体共培养培养基中，在24℃共培养3d，得到共培养处理后的愈伤组织；
[0036]
将上述的共培养处理后的愈伤组织接种在含有质量浓度为150mg/l潮霉素的n6固体筛选培养基，向n6固体培养基中加入潮霉素得到n6固体筛选培养基，n6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为150mg/l，进行第一次筛选；再以200mg/l的浓度的潮霉素进行第二次筛选，再以150mg/l潮霉素的分化培养基上继续培养得到crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2的t0代株系。
[0037]
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明对基因oshls1进行定点编辑，oshls1基因编码的oshls1蛋白是调控水稻株高的关键蛋白之一，定点编辑oshls1基因后，使该基因不能翻译出正常功能的oshls1蛋白，从而实现水稻植株半矮化的目的。本发明使用crispr/cas9基因编辑技术对oshls1进行定点编辑的靶点为：sgrna靶点1序列的选择：序列为5
′‑
caagactttgcccgcctgattgg-3
′
(seq id no.1)。sgrna靶点2序列的选择：序列为5
′‑
tcttcttctcagcctgcttctgg3
′
(seq id no.2)。本发明通过编辑oshls1的结构可以不同程度的降低水稻株高，以防止水稻倒伏，实现高产或稳产，t0代经过后代分离后，可以选育出不含有转基因成分的株系。这些株系可以作为杂交亲本进行生产应用，解决农业生产中杂交f1代株高过高容易倒伏的不良现象。为利用oshls1培养优良的半矮化水稻品种提供了一种新的分子育种途径，其应用前景广阔。
附图说明
[0038]
图1：oshls1基因结构及编辑靶位点示意图(sgrna1和sgrna2)；
[0039]
图2：两个靶位点sgrna1(t1)和sgrna2(t2)在载体中的插入位点示意图；
[0040]
图3：突变体oshls1目标基因序列测序结果；
[0041]
图4：野生型(wt)和突变体(oshls1)在幼苗期的株高表型；
[0042]
图5：野生型(wt)和突变体(oshls1)在抽穗期(左)和成熟期(右)的株高表型。
具体实施方式
[0043]
在本发明种所涉及的引物合成和dna测序分析均由北京擎科生物科技有限公司完成。
[0044]
实施例1：
[0045]
利用crispr-cas9系统敲除oshls1获得矮化水稻的方法，包括以下步骤：
[0046]
(1)oshls1的获得
[0047]
以日本晴的cdna为模板，用如下引物oshls1-f和oshls1-r进行pcr扩增获得目的基因。其中下划线部分为酶切位点；
[0048]
oshls1-f：catatgatggaaaaggccgcgg
[0049]
oshls1-r：gaattcttatatctctctgtaaaggttgagc
[0050]
将扩增产物回收后，连接进入t载体pclone007(购自北京擎科生物科技有限公司)中，转化dh5α感受态细胞(购自北京擎科生物科技有限公司)，挑选阳性克隆后，进行测序；测序结果表明，该基因长度为672bp，序列如seq id no.3所示的核苷酸序列，命名为oshls1；oshls1编码的蛋白质氨基酸序列如seq id no.4所示，将该蛋白命名为oshls1；
[0051]
(2)oshls1基因sgrna位点crispr/cas9载体构建：
[0052]
以bsai(购自neb公司)酶切crpspr/cas9载体pegcas9pubi-h，回收线性化17kb大小的片段，命名为pegcas9pubi-h-bsai。
[0053]
(3)人工合成引物：
[0054]
在(templatedoesnotexist at/targetdesign/primer/)网站中对oshls1基因设计crpspr/cas9的基因敲除靶点，分别得到sgrna靶点1和sgrna靶点2(图1)。
[0055]
sgrna1-f：caagactttgcccgcctgattgg
[0056]
sgrna1-r：ccaatcaggcgggcaaagtcttg
[0057]
将sgrna1-f与sgrna1-r稀释到10pmol，于pcr管中各加入1μl，后加入8μl ddh2o；95℃10min，0.1℃/s退火至15℃，15℃保持10min，完成退火；得到sgrna模板。
[0058]
(4)第一轮重叠pcr和巢式pcr扩增sgrna表达盒：
[0059]
osu6启动子的扩增
[0060]
以u-f:ctccgttttacctgtggaatcg；osu6at1:atcaggcgggcaaagtcttgcggcagccaagccagca；osu6bt2:gaagcaggctgagaagaagacaacacaagcggcagc为引物osu6为模板，扩增osu6启动子。
[0061]
按照一下体系和反应程序进行扩增(该体系酶购自vazyme)：
[0062]
[0063]
预变性95℃2min；变性95℃15sec；退火60℃15sec；延伸72℃20sec；终延伸72℃5min。20个循环
[0064]
sgrna表达盒扩增
[0065]
以grt1:caagactttgcccgcctgatgttttagagctagaaat；grna-r:cggaggaaaattccatccac为引物，sgrna为模板，扩增sgrna表达盒。
[0066]
按照一下体系和反应程序进行扩增(该体系酶购自vazyme)：
[0067][0068]
预变性95℃2min；变性95℃15sec；退火60℃15sec；延伸72℃20sec；终延伸72℃5min。20个循环。
[0069]
(5)第二轮pcr扩增sgrna表达盒
[0070]
以pps-r:ttcagaggtctctaccgactagtatggaatcggcagcaaagg；
[0071]
pgs-l:agcgtgggtctcgctcgacgcgtatccatccactccaagctc为引物，第一轮osu6启动子产物和第一轮sgrna产物为模板，扩增sgrna表达盒。
[0072]
按照一下体系和反应程序进行扩增(该体系酶购自诺唯赞(vazyme))：
[0073][0074]
预变性95℃2min；变性95℃15sec；退火55℃30sec；延伸72℃30sec；终延伸72℃5min。30个循环。将500-600bp的电泳目的片段进行切胶回收。
[0075]
(6)pegcas9pubi-h-bsai载体与sgrna表达盒的连接(该连接酶购自宝生物(takara))将两个表达盒分别插入pegcas9pubi-h载体中的t1和t2的位置中(图2)，此步骤以sgrna靶点1的表达盒为例。
[0076]
取pegcas9pubi-h-bsai载体7μl，sgrna表达盒1μl，t4连接酶(t4ligase)1μl，t4连接酶缓冲液(t4 ligase buffer)1μl，16℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，涂于kanr固体lb抗性培养基上。使用
[0077]
sp-l：gcggtgtcatctatgttactag；sp-r：tgcaataacttcgtataggc这对引物进行菌落pcr检测，条带大小约1400bp；检测阳性菌斑，进行挑取摇菌提取质粒并测序。测序结果序列
与目的片段序列比对一致，即为sgrna1位点的crispr/cas9载体表达载体构建成功。以同样的方法得到sgrna2位点的crispr/cas9载体。
[0078]
试验例1：培育oshls1被编辑的转基因株系日本晴的测序鉴定
[0079]
1.培育oshls1被编辑的转基因株系
[0080]
(1)将crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2通过冻融法转化进入根癌农杆菌eha105(购于上海唯地生物技术有限公司)，得到含有crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2的重组根癌农杆菌eha105。
[0081]
(2)将500μl含有crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2重组质粒的农杆菌eha105种子液接种至50ml yep液体培养基中，控制温度为26℃培养12h,收集菌液,并用yep液体培养基进行稀释,至含有crispr/cas9-sgrna1或crispr/cas9-sgrna2重组质粒的农杆菌的菌液浓度为od
600
≈0.5。以此重组根癌农杆菌eha105介导转化日本晴。
[0082]
(3)将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述的稀释菌液混合侵染30min，采用滤纸吸干菌液后转入n6固体共培养培养基中，在24℃共培养3d，得到共培养处理后的愈伤组织。
[0083]
(4)将步骤(3)的共培养处理后的愈伤组织接种在含有质量浓度为150mg/l潮霉素(购自罗氏(roche))的n6(上海生工)固体筛选培养基(向n6固体培养基中加入潮霉素得到n6固体筛选培养基，n6固体筛选培养基中潮霉素的质量浓度为150mg/l)上进行第一次筛选。
[0084]
(5)在第一次筛选开始的第16天挑取健康愈伤组织转入含有质量浓度为200mg/l潮霉素的n6固体筛选培养基上进行第二次筛选，每15天继代一次，共继代1次。
[0085]
(6)挑取抗性愈伤组织转入含有质量浓度为150mg/l潮霉素的分化培养基上(分化培养基：6-ba 2mg,naa 0.2mg,n6 4g,水解酪蛋白1g,肌醇0.1g，蔗糖25g,山梨醇2.4g,琼脂粉7g，去离子水1l)进行分化，在24℃培养45d。(该分化培养基试剂均购自上海生工)
[0086]
(7)炼苗：使用长镊子小心取出试管苗，避免损坏根系，并用自来水彻底清洗干净根部培养基(因为残留的蔗糖和营养会成为潜在的致病微生物的生长培养基，洗不干净容易引起移栽苗烂根死亡)；用自来水浸没试管苗根部，室温过度2-3天后可直接移栽，也可以用0.1％-0.3％的多菌灵溶液浸泡10-30分钟后移栽，移载后灌足定根水。炼苗应在塑料薄膜温室内或遮荫网室内进行，使用温室或温棚时应注意设置通风口，防止浇水后高温引起萎蔫及高湿引起烂苗。至此即为转crispr/cas9-sgrna1植株(t0代)。
[0087]
2.oshls1基因编辑的转基因株系的测序鉴定
[0088]
提取crispr/cas9-sgrna1株系(t0代)幼苗的基因组dna，使用检测引物(目的条带：512bp)oshls1(det+):agacctgagtgggtgtagcatc；
[0089]
oshls1(det-):ccacggcgaaatcaaaaccagc进行检测测序分析，并于野生型日本晴作为参照。发现序列出现差异，导致该基因的表达失活(参见图3所示)。crispr/cas9-sgrna2的转基因株系鉴定方法同crispr/cas9-sgrna1。
[0090]
试验例2：oshls1基因编辑的转基因株系的表型鉴定
[0091]
分别将上述步骤所得的crispr/cas9-sgrna1转基因水稻株系和受体亲本水稻日本晴种植在贵州大学生命科学学院试验田，观察整个生长周期内crispr/cas9-sgrna1水稻株系和受体亲本日本晴水稻株系的表型差异。观察结果如图4和图5所示。
[0092]
与受体亲本水稻日本晴株系相比，crispr/cas9-sgrna1植株出现了株高降低的表型。从而证明了oshls1基因参与控制水稻的株高。并且，采用grna2的导入植株也取得类似的结果。从图4和图5的结果可以看出，本发明设计的grna具有较好的编辑效率以及编辑效果。
[0093]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。