作为RAS信号通路调控剂的杂环化合物的制作方法

作为ras信号通路调控剂的杂环化合物
技术领域
1.本发明属于化学医药领域，特别是涉及作为ras信号通路调控剂的杂环化合物，及其制备方法及其应用。


背景技术：

2.ras家族包括kras、nras和hras。ras蛋白严格调控正常细胞和非正常细胞(包括癌症)中的细胞增殖、分化、衰老、凋亡等等。ras蛋白被上游信号激活，包括受体酪氨酸激酶(rtk)，并将信号转导到几个下游信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶(mapk)/细胞外信号调节激酶(erk)通路和pi3k-akt-mtor信号通路。由于ras基因或ras通路中的其他基因的突变或改变，在癌症中经常观察到ras信号的过度激活。抑制ras和ras信号传导通路的策略可用于癌症或者ras调节的其他疾病的治疗。
3.ras家族蛋白是小gtp酶，它们以gdp结合(非活性)或gtp结合(活性)状态存在于细胞中。ras蛋白的活性受称为gtp酶激活蛋白(gap)或鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)的调节。ras家族蛋白具有较弱的内在gtp酶活性和缓慢的核苷酸交换率。gtpase激活蛋白(gap)如nf1的结合会增加ras家族蛋白的gtpase活性。sos1(sonofsevenless1)等鸟嘌呤核苷酸交换因子(gef)的结合促进了ras家族蛋白中gdp的释放，从而实现了gtp结合。当处于gtp结合状态时，ras家族蛋白是活跃的，持续激活下游信号通路。
4.sos家族包括sos1和sos2，这些蛋白质具有大约70%的序列同一性。由于sos2的快速降解，sos1似乎比sos2活跃得多。小鼠sos2敲除是可行的，而sos1敲除是胚胎致死的。已发表的数据表明sos1在突变kras激活和癌症中的致癌信号传导中具有重要作用。消耗sos1水平会降低携带kras突变的肿瘤细胞的增殖率和存活率，而在kras野生型细胞系中未观察到任何影响。sos1缺失的影响无法通过引入催化位点突变的sos1来挽救，这证明了sos1gef活性在kras突变癌细胞中的重要作用。在noonan综合征和几种癌症中发现sos1突变，包括肺腺癌、胚胎性横纹肌肉瘤、睾丸支持细胞瘤和皮肤gtp酶激活蛋白(gap)的颗粒细胞瘤。
5.因此，阻断sos1和ras家族成员之间相互作用的本发明化合物可以阻止kras再循环成活性gtp结合形式，因此可以为多种癌症的治疗提供益处，特别是ras家族成员相关癌症。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种结构新颖的ras信号通路调控剂。
7.本发明的第一方面，提供了一种如式i所示的化合物，或其药学上可接受的盐，
x选自n或cra；ra选自下组：氢、卤素、c
1-6
烷基或c
1-6
烷氧基；l选自下组：-(ch2)
m-或-o-，其中m为0或1；r1选自下组：c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、4-8元饱和或部分不饱和杂环基、苯基、5-6元杂芳基；且所述的r1可任选地被一个或多个rb取代基取代，所述的rb选自下组：氢、卤素、一个或多个r
b1
取代的c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、-c(=o)-r
b2
、或一个或多个r
b3
取代的5-6元杂芳基，其中：r
b1
选自下组：氢、卤素、氨基或羧基；r
b2
选自下组：氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
3-6
环烷基或-(ch2)
q-n(r
b1arb1b
)；r
b3
选自氢、卤素或c
1-3
烷基；q为0、1、2或3；r
b1a
、r
b1b
为氢或c
1-3
烷基；上述的各个环烷基、杂环基上的一个或多个作为环骨架的亚甲基可以各自独立地被羰基或s(=o)2替换；各个所述杂环基或杂芳基各自独立地含有1-3个选自n、o、s的杂原子，杂原子个数为1到3；r2任选自c
1-3
烷基、c
1-3
卤代烷基或环丙烷；r3可以相同或不同，各自独立地任选自卤素、氨基、c
1-3
烷基或c
1-3
卤代烷基；n为1、2或3。
8.在另一优选例中，所述的r3选自下组：氨基、c
1-3
卤代烷基。
9.在另一优选例中，所述的r3选自下组：氨基、三氟甲基。
10.在另一优选例中，所述的式i化合物具有如下式ii所示的结构：
。
11.在另一优选例中，ra选自下组：氢、卤素、c
1-4
烷基或c
1-4
烷氧基。
12.在另一优选例中，ra选自下组：氢、卤素、甲基或甲氧基。
13.在另一优选例中，l选自下组：-(ch2)
m-或-o-，其中m为0。
14.在另一优选例中，r2任选自c
1-3
烷基。
15.在另一优选例中，r1选自下组：c
1-4
烷基、c
3-6
环烷基、5-8元饱和或部分不饱和杂环基；其中，所述的r1可任选地被一个或多个rb取代基取代，所述的rb选自下组：氢、卤素、一个或多个r
b1
取代的c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、-c(=o)-r
b2
、或一个或多个r
b3
取代的5-6元杂芳基，其中：r
b1
选自下组：氢、卤素、或羧基；r
b2
选自下组：氢、c
1-4
烷基、c
1-4
烷氧基、c
3-6
环烷基或-(ch2)
q-n(r
b1arb1b
)；r
b3
选自氢、卤素或c
1-3
烷基；q为0或1；r
b1a
、r
b1b
为氢或c
1-3
烷基。
16.在另一优选例中，r1选自下组：c
1-4
烷基、或选自下组的基团：；所述的r1可任选地被一个或多个rb取代基取代，所述的rb定义如上文中所述。
17.在另一优选例中，所述的式i化合物选自下组：
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：如本发明第一方面所述的式i化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂、佐剂、辅料和/或稀释剂。
18.本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的式i化合物，或其药学上可接受的盐的用途，其用于制备治疗或预防与sos1相关或由sos1调节的疾病的药物组合物。
19.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
20.本发明人经过长期而深入的研究，发现了一类具有ras信号通路调控剂的小分子
化合物，所述的化合物结构新颖，且具有与现有技术中同类化合物相当或更为优异的激动活性。基于上述发现，发明人完成了本发明。
21.术语在本发明中，所述卤素为f、cl、br或i。
22.在本发明中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。
23.在本发明中，术语“c
1-c6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和已基等；优选乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
24.在本发明中，术语“c
1-c6烷氧基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷氧基，非限制性地包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和丁氧基等。
25.在本发明中，术语“c
3-c6环烷基”是指在环上具有3至6个碳原子的环状烷基，非限制性地包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。术语“c
5-c6环烷基”具有类似的含义。
26.在本发明中，术语“芳环”或“芳基”具有相同的含义，优选地“芳基”为“c
6-c
12
芳基”或“c
6-c
10
芳基”。术语“c
6-c
12
芳基”是指在环上不含杂原子的具有6至12个碳原子的芳香族环基，如苯基、萘基等。术语“c
6-c
10
芳基”具有类似的含义。
27.在本发明中，术语“芳香杂环”或“杂芳基”具有相同的含义，指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。
28.在本发明中，术语“c
3-6
环烷基”是指饱和的3-6元环基，其环骨架结构仅包括碳原子，例如环戊基、环己基等。
29.在本发明中，术语“4-8元杂环基”是指在环上含有1~3个选自氧、硫和氮中的杂原子的饱和或不饱和(非芳香性环，包括单环，并环，螺环，桥环等形式)的4-8元环基，例如二氧杂环戊基等。术语“5-8元杂环基”具有类似的含义。
30.在本发明中，术语“取代”指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基。除非特别说明，某个取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。环状取代基，例如杂环烷基，可以与另一个环相连，例如环烷基，从而形成螺二环系，例如，两个环具有一个共用碳原子。本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。所述取代基例如(但并不限于)：c
1-8
烷基、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
3-8
环烷基、3-至12-元杂环基，芳基、杂芳基、卤素、羟基、羧基(-cooh)、c
1-8
醛基、c
2-10
酰基、c
2-10
酯基、氨基、烷氧基、c
1-10
磺酰基等。
31.作为ras信号通路调控剂的式i化合物本发明提供了一种如式i所示的化合物，或其药学上可接受的盐，
x选自n或cra；ra选自下组：氢、卤素、c
1-6
烷基或c
1-6
烷氧基；l选自下组：-(ch2)
m-或-o-，其中m为0或1；r1选自下组：c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、4-8元饱和或部分不饱和杂环基、苯基、5-6元杂芳基；且所述的r1可任选地被一个或多个rb取代基取代，所述的rb选自下组：氢、卤素、一个或多个r
b1
取代的c
1-3
烷基、c
1-3
烷氧基、-c(=o)-r
b2
、或一个或多个r
b3
取代的5-6元杂芳基，其中：r
b1
选自下组：氢、卤素、氨基或羧基；r
b2
选自下组：氢、c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、c
3-6
环烷基或-(ch2)
q-n(r
b1arb1b
)；r
b3
选自氢、卤素或c
1-3
烷基；q为0、1、2或3；r
b1a
、r
b1b
为氢或c
1-3
烷基；上述的各个环烷基、杂环基上的一个或多个作为环骨架的亚甲基可以各自独立地被羰基或s(=o)2替换；各个所述杂环基或杂芳基各自独立地含有1-3个选自n、o、s的杂原子，杂原子个数为1到3；r2任选自c
1-3
烷基、c
1-3
卤代烷基或环丙烷；r3可以相同或不同，各自独立地任选自卤素、氨基、c
1-3
烷基或c
1-3
卤代烷基；n为1、2或3。
32.式i化合物的制备方法本发明还提供了上述的如式i所示的化合物的制备方法，具体地，本发明化合物采用以下流程1进行制备：流程1：
流程1中，起始化合物ii-1经酯化反应和插羰反应得化合物iii；化合物iii再经酸碱缩合反应得化合物iv；化合物iv经脱保护-关环反应得到化合物v；化合物v经氯代取代得到化合物vi；化合物vi经buchwald-hartwig cross coupling reaction或者取代反应得到化合物vii；化合物vii经过去烷基化和取代反应得化合物ix；化合物ix经一步或多步取代反应或suzuki coupling并再经还原反应得到化合物i或者化合物ix经一步或多步取代反应或suzuki coupling直接得到化合物i。
33.q可以是氯，溴或otf。
34.含有活性成分的药物组合物由于本发明化合物具有优异的ras信号通路调控效果，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于预防和/或治疗(稳定、减轻或治愈) sos1和ras家族成员之间异常相互作用相关的疾病或病症，特别是ras家族成员相关癌症。
35.本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物及药学上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.01-99.99%重量百分比的本发明化合物/剂，更佳地，含有0.1-99.9%本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
[0036]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上
可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温
®
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0037]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)。
[0038]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a) 填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b) 粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c) 保湿剂，例如，甘油；(d) 崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e) 缓溶剂，例如石蜡；(f) 吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g) 润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h) 吸附剂，例如，高岭土；和(i) 润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0039]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0040]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0041]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0042]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0043]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0044]
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。
[0045]
联合给药时，所述药物组合物还包括与一种或多种(2种，3种，4种，或更多种)其他药学上可接受的化合物。该其他药学上可接受的化合物中的一种或多种(2种，3种，4种，或更多种)可与本发明的化合物同时、分开或顺序地用于预防和/或治疗ras家族成员相关癌症。
[0046]
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0047]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0048]
以下实施例中，化合物的结构是通过核磁共振(nmr)或/和质谱(ms)来确定的。nmr位移(δ)以10-6 (ppm)的单位给出。nmr的测定是用bruker avance-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdcl3)、氘代甲醇(cd3od)，内标为四甲基硅烷(tms)。
[0049]
shimadzu lc系统(色谱柱：xselect
®ꢀ
csh
tm prep-c18，19 * 150mm，液体处理机lh-40，泵lc-20ap，检测器spd-20a，系统控制器cbm-20a，溶剂系统：乙腈和0.05％三氟乙酸水溶液)。
[0050]
使用lc/ms (agilent technologies 1200 series)获得化合物的lc/ms光谱。lc/ms条件如下(运行时间为10分钟)：酸性条件：a：0.05％三氟乙酸的水溶液；b：0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；碱性条件：a：0.05％nh3•
h2o的水溶液；b：乙腈中性条件：a：10 mm nh4oac的水溶液；b：乙腈如无特别说明，以下实施例中，中间体和最终化合物使用硅胶柱色谱法纯化、或使用xselect
®ꢀ
csh
tm prep-c18(5μm，obd
tm 19 * 150mm)色谱柱或使用xbridgetm prep phenyl (5μm，obd
tm 30 * 100mm)在反相色谱柱上通过制备性hplc纯化。
[0051]
硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
[0052]
combiflash快速制备仪使用combiflash rf200 (teledyne isco)。
[0053]
薄层色谱法(tlc)硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层层析检测产品使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
[0054]
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自abcr gmbh&co.kg、acros organics、aldrich chemical company、韶远化学科技(accela chembio inc)、达瑞化学品等公司。
[0055]
缩略词：accl：乙酰氯；bbr3: 三溴化硼；bcl3: 三氯化硼；binap：1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦；boc2o：碳酸叔丁氧基羰基叔丁酯；conc.hcl：浓盐酸; cs2co3：碳酸铯；dcm：二氯甲烷；dce：1,2-二氯乙烷；diad：偶氮二甲酸二异丙酯；1，4-dioxane：1,4-二氧六环；diea：n,n-二异丙基乙胺；dmap：4-二甲氨基吡啶；dmf：二甲基甲酰胺；dmso：二甲基亚砜；etoh：乙醇；hatu: 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸酯; hoac；醋酸；h2：氢气；i2：碘；k2co3：碳酸钾；kmno4: 高锰酸钾；k3po4：磷酸钾；lialh4：氢化铝锂；lioh：氢氧化锂；meoh：甲醇；mtbe: 甲基叔丁基醚；nabh4: 硼氢化钠； nah：氢化钠；nahco3：碳酸氢钠；pd(dppf)cl2：[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯；pd(oac)2：醋酸钯；pd/c：钯碳；pd2(dba)3：三(二亚苄基丙酮)二钯；pd(pph3)4：四三苯基膦钯；pocl3：三氯氧磷；pph3：三苯基膦；t-buok：叔丁醇钾；t-buona：叔丁醇钠；tea：三乙胺；tfa：三氟乙酸； thf：四氢呋喃；tlc：薄层层析；tf2o: 三氟甲磺酸酐；ti(oet)4: 钛酸四乙酯；tscl: 对甲苯磺酰氯；ts: 对甲苯磺酰基；xantphos：4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽；xphos pd 克3: (2-二环己基膦-2,4,6-三异丙基-1,1-联苯)[2-(2-胺基-1,1-联苯]甲磺酸钯。
[0056] 制备例
中间体a1:(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯步骤1:2-溴-4-甲氧基苯甲酸异丙酯的制备 (中间体a1-1)将2-溴-4-甲氧基苯甲酸(5.0克，21.70毫摩尔)溶于dmf (40毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入2-碘丙烷(4.4克，26.10毫摩尔) 和k2co
3 (4.5克，32.50毫摩尔)，加完后，将反应混合物在60度继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色油状物2-溴-4-甲氧基苯甲酸异丙酯(5.1克，86.4%)。ms: 273.1&275.1 (m+h)
+
。
[0057]
步骤2: 2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酸的制备 (中间体a1-2)将2-溴-4-甲氧基苯甲酸异丙酯(5.5克，20.40毫摩尔), 草酸(3.67克，40.8毫摩尔), pd(oac)
2 (0.458克，2.040毫摩尔)和xantphos (1.181克，2.040毫摩尔)溶于dmf (20毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入ac2o(4.17克，40.8毫摩尔)和diea (5.27克，40.8毫摩尔)，加完后，将反应混合物在100度继续搅拌2小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色油状物2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酸(2.2克，45.8%)。ms: 239.1 (m+h)
+
。
[0058]
步骤3: 2-(2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酰基)-1-甲基肼-1-羧酸叔丁酯的制备 (中间体 a1-3)将2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酸(2.0 克，8.40 毫摩尔)和1-甲基肼-1-羧酸叔丁酯(1.84 克，12.60毫摩尔)溶于dmf (30毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入hatu (4.80克，12.60毫摩尔)和diea (2.17克，16.80毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌2
小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色油状物2-(2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酰基)-1-甲基肼-1-羧酸叔丁酯(2.82克，91.2%)。ms: 366.2 (m+h)
+
。
[0059]
步骤4: 6-甲氧基-2-甲基-2,3-二氢邻苯二甲嗪-1,4-二酮的制备 (中间体a1-4)将2-(2-(异丙氧羰基)-5-甲氧基苯甲酰基)-1-甲基肼-1-羧酸叔丁酯(2.82克，7.65毫摩尔)的tfa (20毫升)溶液在70度搅拌反应12小时，然后浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到白色固体6-甲氧基-2-甲基-2,3-二氢邻苯二甲嗪-1,4-二酮(1.4克，88.6%)。ms: 207.1 (m+h)
+
。
[0060]
步骤5: 4-氯-6-甲氧基-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体a1-5)将6-甲氧基-2-甲基-2,3-二氢邻苯二甲嗪-1,4-二酮(500毫克，2.42毫摩尔)的pocl
3 (5毫升)溶液在110度搅拌反应1小时，然后浓缩得到粗产物，粗产物溶于乙酸乙酯并用冰水淬灭，有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，经硅胶柱层析纯化得到白色固体4-氯-6-甲氧基-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮(250毫克，45.9%)。ms: 225.1 (m+h)
+
。
[0061]
步骤6:(r)-6-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体a1-6)将4-氯-6-甲氧基-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮(500毫克，2.226毫摩尔)和(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-胺(中间体b1, 625毫克，2.67毫摩尔)溶于1,4-二氧六环 (10毫升)中。在搅拌下缓慢加入叔丁醇钠(642毫克，6.68毫摩尔)和xphos pd 克3 (186毫克，0.22毫摩尔)，加完后，将反应混合物在80度继续搅拌2小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-6-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(650毫克，69.1%)。ms: 423.1 (m+h)
+
。
[0062]
步骤 7:(r)-6-羟基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮的制备(中间体a1-7)将(r)-6-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(150毫克，0.355 毫摩尔)溶于dcm (2 毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入1.0 m的三溴化硼二氯甲烷溶液(1 毫升)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-6-羟基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(120毫克，83%)。ms: 409.1 (m+h)
+
。
[0063]
步骤 8:(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯的制备(中间体a1)将(r)-6-羟基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(1.0 克，2.449 毫摩尔)溶于dcm (15 毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入tea (0.743 克，7.35 毫摩尔)和三氟甲磺酸酐(1.382 克，4.90 毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度
继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯(700毫克，52.9%)。ms: 541.1 (m+h)
+
。
[0064]
中间体a2:(r)-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧基-1,2-二氢邻苯二嗪-6-基三氟甲基磺酸酯步骤1: 2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲醛的制备 (中间体a2-1)将2-溴-4-羟基-5-甲氧基苯甲醛(63.5克，220毫摩尔)溶于dmf(200毫升)中。在搅拌下缓慢加入k2co
3 (30.4克，220毫摩尔)和2-碘丙烷(112克，659毫摩尔)，加完后，将反应混合物在50度继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到橙色油状物2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲醛(60克，82%)。ms: 273.2 (m+h)
+
。
[0065]
步骤2: 2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲酸的制备 (中间体a2-2)
将2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲醛(60克，220毫摩尔)溶于dmf (200毫升)中。在搅拌下缓慢加入氢氧化钠(17.57克，439毫摩尔)，然后加入高锰酸钾(69.4克，439毫摩尔)的dmf(300毫升)溶液，反应完毕后，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到白色固体2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲酸(63.5克，100%)。ms: 289.1 (m+h)
+
。
[0066]
步骤3: 6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基-2,3-二氢邻苯二甲嗪-1,4-二酮的制备 (中间体a2-6)中间体a2-6的合成参考中间体a1-4，通过使用(2-溴-4-异丙氧基-5-甲氧基苯甲酸(中间体a2-2)代替2-溴-4-甲氧基苯甲酸制备得到中间体a2-6。ms: 265.4 (m+h)
+
。
[0067]
步骤4: 4-氯-6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体a2-7)将6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基-2,3-二氢邻苯二甲嗪-1,4-二酮(6.7克，25.4毫摩尔)和五氯化磷(7.92克，38.0毫摩尔)的pocl
3 (30毫升)溶液在110度搅拌反应1小时，然后浓缩得到粗产物，粗产物溶于乙酸乙酯并用冰水淬灭，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，经硅胶柱层析纯化得到白色固体4-氯-6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮(4.3克，60%)。ms: 283.1 (m+h)
+
。
[0068]
步骤5:(r)-6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮的制备(中间体a2-8)中间体a2-8的合成参考中间体a1-6，通过使用中间体a2-7代替中间体a1-5制备得到中间体a2-8。ms: 481.2 (m+h)
+
。
[0069]
步骤6:(r)-6-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮的制备(中间体a2-9)将(r)-6-异丙氧基-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮(120毫克，0.250毫摩尔)溶于dcm(5毫升)中。在-78度搅拌下缓慢加入三氯化硼(344毫克，0.500毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌5小时，然后加入氯化铵的冰水溶液淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到黄色固体(r)-6-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(110毫克)。ms: 439.2 (m+h)
+
。
[0070]
步骤 7:(r)-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧基-1,2-二氢邻苯二嗪-6-基三氟甲基磺酸酯的制备(中间体a2)中间体a2的合成参考中间体a1，通过使用中间体a2-9代替中间体a1-7制备得到中间体a2。ms: 570.0 (m+h)
+
。
[0071]
中间体a3:(r)-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-4-氧代-3,4-二氢吡啶[3,4-d]哒嗪-7-三氟甲烷磺酸酯
步骤1: 5-溴-2-甲氧基异烟酸甲酯的制备(中间体a3-1)将5-溴-2-甲氧基异烟醛(21.6克，100毫摩尔)溶于meoh (100毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入碘(33.0克，130毫摩尔)的甲醇(75毫升)溶液和氢氧化钾(14.59克，260毫摩尔)的甲醇(75毫升)溶液，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌2小时，然后加入nahso3水溶液淬灭反应，搅拌，过滤，干燥固体得到白色固体5-溴-2-甲氧基异烟酸甲酯 (21克，85%)。ms: 247.1 & 249.1 (m+h)
+
。
[0072]
步骤2: 5-(2-(叔丁氧羰基)-1-甲基肼-1-羰基)-2-甲氧基异烟酸甲酯的制备 (中间体a3-3)中间体a3-3的合成参考中间体a1-3，通过使用中间体a3-1代替中间体a1-1和2-甲基肼-1-羧酸叔丁酯代替1-甲基肼-1-羧酸叔丁酯制备得到中间体a3-3。ms: 340.1 (m+h)
+
。
[0073]
步骤3: 7-甲氧基-3-甲基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮的制备 (中间体 a3-4)将5-(2-(叔丁氧羰基)-1-甲基肼-1-羰基)-2-甲氧基异烟酸甲酯(11克，32.4毫摩尔)的tfa(24毫升)溶液溶液在20度搅拌反应12小时。然后将反应液浓缩蒸干得到白色固体7-甲氧基-3-甲基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮(4.6克，68.5%)。ms: 208.1 (m+h)
+
。
[0074]
步骤4: 1-氯-7-甲氧基-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮的制备 (中间体a3-5)将7-甲氧基-3-甲基-2,3-二氢吡啶并[3,4-d]哒嗪-1,4-二酮(4.6克，22.20毫摩尔), diea(4.30克，33.3毫摩尔)和五氯化磷(6.93克，33.3毫摩尔)的pocl3(30毫升)溶液在100度搅拌反应1小时，然后冷却反应液，析出黄色固体，过滤并用二氯甲烷洗涤滤饼，滤
饼干燥得到黄色固体1-氯-7-甲氧基-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(2.8克，55.9 %)。ms: 226.1 (m+h)
+
。
[0075]
步骤5:(r)-7-甲氧基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮的制备(中间体a3-6)将叔丁醇钠(10.5毫摩尔)，1-氯-7-甲氧基-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(1.6克，7.09毫摩尔)，(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-胺(1.919克，7.09毫摩尔)和甲磺酸(2-二环己基膦-2'',4'',6''-三异丙基-1,1''-联苯基)(2''-甲氨-1,1''-联苯-2-基)钯(ii)(0.600 克，0.709毫摩尔)的甲苯(50毫升)溶液在90度搅拌反应12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-7-甲氧基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(1.0克，33.3%)。ms: 424.1 (m+h)
+
。
[0076]
步骤6:(r)-7-羟基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮的制备(中间体a3-7)将(r)-7-甲氧基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(940毫克，2.220毫摩尔)和nai (998毫克，6.66毫摩尔)溶于乙腈(45毫升)中，在20度搅拌下缓慢加入tmscl (724毫克，6.66毫摩尔), 然后将反应溶液在80度搅拌反应3小时。然后用冰水淬灭反应液，并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠溶液，饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到浅褐色固体(r)-7-羟基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(740毫克，79%)。ms: 410.1 (m+h)
+
。
[0077]
步骤7:(r)-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-4-氧代-3,4-二氢吡啶[3,4-d]哒嗪-7-基三氟甲烷磺酸酯的制备(中间体 a3)将(r)-7-羟基-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮(740毫克，1.808毫摩尔)和吡啶(286毫克，3.62毫摩尔)溶于dcm(45毫升)中，在20度搅拌下缓慢加入tf2o(1020毫克，3.62毫摩尔)，然后将反应溶液在20度搅拌反应2小时。然后用冰水淬灭反应液，并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-3-甲基-1-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-4-氧代-3,4-二氢吡啶[3,4-d]哒嗪-7-基三氟甲烷磺酸酯(310毫克，31.7%)。ms: 542.1 (m+h)
+
。
[0078] 中间体 a4:(r)-7-氟-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯
步骤 1: 2-溴-5-氟-4-甲氧基苯甲酸的制备 (中间体a4-1)将2-溴-4,5-二氟苯甲酸(20克，84毫摩尔)溶于dmf(150毫升)中，在20度搅拌下缓慢加入meona(6.84克，127毫摩尔)，然后将反应溶液在90度搅拌反应12小时。然后用冰水淬灭反应液，并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到白色固体2-溴-5-氟-4-甲氧基苯甲酸(20.0克，95%)。ms: 248.1 & 250.1 (m+h)
+
。
[0079]
步骤2: (r)-7-氟-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯的制备(中间体a4)中间体a4的合成参考中间体a1，通过使用中间体a4-1代替2-溴-4-甲氧基苯甲酸制备得到中间体a4。ms: 559.2 (m+h)
+
。
[0080] 中间体 a5:(r)-2,7-二甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲磺酸酯
中间体a5的合成参考中间体a4，通过使用2-溴-4-氟-5-甲基苯甲酸代替2-溴-4,5-二氟苯甲酸制备得到中间体a5。ms: 555.2 (m+h)
+
。
[0081]
中间体b1:(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-胺
步骤1: 1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-酮的制备(中间体b1-1)将1-溴-3-硝基-5-(三氟甲基)苯(50.0 克，185.18毫摩尔)和三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡烷(80.26克，222.22毫摩尔)溶于1,4-二氧六环(500毫升)中。在搅拌下缓慢加入pd(pph3)2cl
2 (4.07克，9.26毫摩尔)和tea(37.48克，370.36毫升)，加完后，将反应混合物在80度继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物溶于2n的盐酸(200毫升)中，将反应混合物在20度搅拌反应2小时，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色油状物1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-酮(28.0克，64.86%)。
[0082]
步骤2:(r,z)-2-甲基-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)亚乙基)丙烷-2-亚硫酰胺的制备 (中间体b1-2)将1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-酮(28.0克，120.10毫摩尔)溶于thf (300毫升)中。在搅拌下缓慢加入(r)-2-甲基丙烷-2-亚硫酰胺(21.83克，180.14毫摩尔)和ti(oet)4(41.09克，180.14毫摩尔)，加完后，将反应混合物在60度继续搅拌2小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r, z)-2-甲基-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)亚乙基)丙烷-2-亚硫酰胺(25.5克，63.1%)。ms: 337.1 (m+h)
+
。
[0083]
步骤3:(r)-2-甲基-n-((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)丙烷-2-亚硫酰胺的制备(中间体b1-3)将(r,z)-2-甲基-n-(1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)亚乙基)丙烷-2-亚硫酰胺(25.5克，75.82毫摩尔)溶于thf (250毫升)和水(5毫升)中。在-78度搅拌下缓慢加入nabh
4 (3.73克，98.56毫摩尔)，加完后，将反应混合物在-78度继续搅拌2小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-2-甲基-n-((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)丙烷-2-亚硫酰胺(20.1克，78.3%)。ms: 339.1 (m+h)
+
。
[0084]
步骤4:(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-胺的制备(中间体b1)将(r)-2-甲基-n-((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)丙烷-2-亚硫酰胺(20.1克，62.4毫摩尔)溶于4n的氯化氢1,4-二氧六环溶液(20毫升)中。将反应混合物在20度继续搅拌1小时，然后浓缩得到粗产物，粗产物经mtbe洗涤得到白色固体(r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙烷-1-胺(12.5克，89.86%)。ms: 235.1 (m+h)
+
。
[0085]
中间体b2:(r)-四氢呋喃-3-基4-甲苯磺酸酯将(r)-四氢呋喃-3-醇(5.0克，56.7毫摩尔)溶于dcm(60毫升)中。在0度搅拌下缓
6-(叔丁基二苯基硅氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基硝酸酯(18克，80%)。ms: 452.2 (m+na)
+
。
[0089]
步骤2: (3r,3ar,6s,6as)
‑ꢀ
6-((叔丁基二苯基硅基)氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇的制备(中间体b5-2)将(3r,3as,6s,6as)-6-(叔丁基二苯基硅氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基硝酸酯(18克，41.9毫摩尔)溶于甲醇(100毫升)和乙酸乙酯(100毫升)中。在20度搅拌下加入钯碳(5克)，加完后，将反应混合物在20度氢气作用下搅拌反应12小时，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经pre-hplc纯化得到无色油状物(3r,3ar,6s,6as)
‑ꢀ
6-((叔丁基二苯基硅基)氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇(15.0克，93%)。ms: 407.2 (m+na)
+
。
[0090]
步骤 3: 叔丁基(((3s,3as,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)氧基)二苯基硅烷(中间体b5-3)将(3r,3as,6s,6ar)
‑ꢀ
6-((叔丁基二苯基硅基)氧基)六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇(4.0克，10.40毫摩尔)溶于dmf(30毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入nah (0.300克，12.48毫摩尔)，加完后，将反应混合物在0度继续搅拌0.5小时; 然后将碘甲烷 (2.215克，15.60毫摩尔)加入到上述反应液中并在室温继续搅拌2小时。然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到无色油状物叔丁基(((3s,3as,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)氧基)二苯基硅烷(2.8 克，67.5%)。ms: 421.2 (m+na)
+
。
[0091]
步骤 4: (3s,3ar,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇的制备(中间体b5-4)将叔丁基(((3s,3as,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基)氧基)二苯基硅烷(2.8克，7.03毫摩尔)溶于thf(20毫升)中。在20度搅拌下缓慢加入1 m tbaf的thf (10.5毫升)溶液，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌1小时。然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到无色油状物(3s,3ar,6r,6ar)
‑ꢀ
6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇(800毫克，71.1%)。ms: 161.2 (m+h)
+
。
[0092]
步骤5:(3s,3as,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基4-甲基苯磺酸酯的制备(中间体b5)将(3s,3ar,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-醇(300毫克，1.873毫摩尔)溶于dcm(10毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入对甲本磺酰氯(536毫克，2.81毫摩尔), tea (379毫克，3.75毫摩尔)和dmap (22.88毫克，0.187毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌12小时。然后将反应混合液用冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到白色固体(3s,3as,6r,6ar)-6-甲氧基六氢呋喃[3,2-b]呋喃-3-基4-甲基苯磺酸酯(400毫克，67.9%)。ms: 315.1 (m+h)
+
。
[0093] 实施例化合物i-1：4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮
步骤1: 2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮的制备(中间体 i-1-1)将(r)-6-羟基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体a1-7, 120毫克，0.294毫摩尔)和(r)-四氢呋喃-3-基4-甲苯磺酸酯(中间体 b2,107毫克，0.441毫摩尔)溶于dmf (2毫升)中。在搅拌下缓慢加入cs2co
3 (144毫克，0.441毫摩尔)，加完后，将反应混合物在80度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(100毫克，671.1%)。ms: 479.2 (m+h)
+
。
[0094]
步骤2: 4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (化合物 i-1)将2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(100毫克，0.209毫摩尔)溶于甲醇(2毫升)中。在20度搅拌下加入钯碳(30毫克)，加完后，将反应混合物在20度氢气作用下搅拌反应2小时，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经pre-hplc纯化得到白色固体4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(65毫克，69.3%)。ms: 449.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.13 (d, j = 8.8 hz, 1h), 7.72 (s, 1h), 7.42-7.35 (m, 1h), 6.93-6.80 (m, 3h), 6.69 (s, 1h), 5.32-5.26 (m, 1h), 4.92-4.87 (m, 1h), 3.99-3.95 (m, 1h), 3.91-3.76 (m, 5h), 3.41 (s, 3h), 2.35-2.28 (mz, 1h), 2.04-1.95 (m, 1h), 1.49 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0095]
化合物i-2：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-甲氧基-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
化合物i-2的合成参考化合物i-1，通过使用(r)-6-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体a1-6)代替2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体i-1-1)制备得到白色固体化合物i-2。
[0096]
化合物i-2 (35毫克), ms: 393.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.12 (d, j = 8.7 hz, 1h), 7.72 (s, 1h), 7.36 (dd, j = 8.9, 2.2 hz, 1h), 6.97 (d, j = 7.0 hz, 1h), 6.88 (d, j = 9.9 hz, 2h), 6.69 (s, 1h), 4.91 (t, j = 6.9 hz, 1h), 3.95 (s, 3h), 3.41 (s, 3h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0097]
化合物i-3：6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮步骤 1:(s)-3-((2-甲基-4-((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢酞菁-6-基)氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备(中间体 i-3-1)中间体i-3-1的合成参考中间体i-1-1，通过使用(r)-3-(对甲苯磺酰基氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体b3)代替(r)-四氢呋喃-3-基4-甲苯磺酸酯(中间体b2)。ms: 578.2 (m+h)
+
。
[0098]
步骤2: 2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-吡咯烷-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体 i-3-2)将(s)-3-((2-甲基-4-((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢酞菁-6-基)氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(150毫克，0.260毫摩尔) 的tfa(2毫升)反应混合液在20度搅拌反应1小时，然后浓缩得到黄色油状物2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-吡咯烷-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(125毫克)。ms: 478.2 (m+h)
+
。
[0099]
步骤3: 6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体 i-3-3)将2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-吡咯烷-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(125 毫克)溶于dcm (2 毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入乙酰氯 (1.5毫克，0.019 毫摩尔)和tea(3毫克，0.030 毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮 (65毫克，48.2%)。ms: 520.2 (m+h)
+
。
[0100]
步骤4: 6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮的制备 (化合物 i-3)将6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮 (90毫克，0.173毫摩尔) 溶于甲醇(2毫升)中。在20度搅拌下加入钯碳 (45毫克)，加完后，将反应混合物在20度氢气作用下搅拌反应2小时，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经pre-hplc纯化得到白色固体6-(((s)-1-乙酰吡咯烷-3-基)氧基)-4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮 (75毫克，88 %)。ms: 490.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.14 (dd, j = 8.7, 2.4 hz, 1h), 7.76 (d, j = 10.5 hz, 1h), 7.43 (t, j = 9.1 hz, 1h), 6.98-6.90 (m, 3h), 6.75 (s, 1h), 5.38-5.25 (m, 1h), 4.92-4.85 (m, 1h), 3.70-3.53 (m, 3h), 3.41 (s, 3h), 3.38-3.32 (m, 1h), 2.35-2.10 (m, 2h), 1.96 (d, j = 16.3 hz, 3h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0101]
化合物i-4：(r)-6-((1-乙酰哌啶-4-基)氧基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮化合物i-4的合成参考化合物i-3，通过使用4-(对甲苯磺酰基氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(中间体b4)代替(r)-3-(对甲苯磺酰基氧基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体b3)制备
得到白色固体化合物i-4。
[0102]
化合物i-4 (20毫克), ms: 504.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.13 (d, j = 8.8 hz, 1h), 7.77 (s, 1h), 7.47 (d, j = 9.0 hz, 1h), 6.95-6.85(m, 3h), 6.70 (s, 1h), 4.93-4.90 (m, 2h), 3.84-3.64 (m, 2h), 3.44-3.33 (m, 5h), 2.07-2.03 (m, 1h), 2.02 (s, 3h), 1.96-1.91 (m, 1h), 1.72-1.68 (m, 1h), 1.62-1.58 (m, 1h), 1.49 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0103]
化合物i-5：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-((1-(二甲基甘氨酸)哌啶-4-基)氧基)-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮化合物i-5的合成参考化合物i-4，通过使用二甲基甘氨酸酰氯代替乙酰氯制备得到白色固体化合物i-5。
[0104]
化合物i-5 (12毫克),ms: 547.3 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.49 (s, 1h), 8.15 (d, j = 8.8 hz, 1h), 7.78 (s, 1h), 7.48 (d, j = 9.0 hz, 1h), 6.89 (m, 3h), 6.68 (s, 1h), 4.91 (dd, j = 14.8, 8.2 hz, 2h), 4.30 (s, 2h), 3.86-3.82 (m, 1h), 3.55-3.30 (m, 7h), 2.81 (s, 6h), 2.10-1.95 (m, 2h), 1.77-1.65 (m, 2h), 1.49 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0105]
化合物i-6：(r)-2-(4-((4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)氧基)哌啶-1-基)乙酸化合物i-6的合成参考化合物i-4，通过使用2-溴乙酸代替乙酰氯制备得到白色固
体化合物i-6。
[0106]
化合物i-6 (32毫克), ms: 550.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.16 (d, j = 8.9 hz, 1h), 7.76 (s, 1h), 7.48-7.45 (m, 1h), 6.92-6.85 (m, 3h), 6.68 (s, 1h), 4.98-4.86 (m, 2h), 4.20 (s, 2h), 3.45-3.32 (m, 7h), 2.30-2.20 (m, 4h), 1.49 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0107]
化合物i-7：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)酞嗪-1(2h)-酮步骤 1:(r)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体i-7-1)将(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯(中间体a1, 100毫克，0.185毫摩尔) 和1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-硼酸频哪醇酯(65.3毫克，0.278毫摩尔) 溶于1,4-dioxane (2毫升)和h2o (0.4毫升) 中。搅拌下缓慢加入pdcl2(dppf)(13.54毫克，0.019毫摩尔)和k2co3(77毫克，0.555毫摩尔)，加完后，将反应混合物在80度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(55毫克，59.5%)。ms: 500.2 (m+h)
+
。
[0108]
步骤2:(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (化合物i-7)化合物i-7的合成参考化合物i-1，通过使用(r)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体i-7-1)代替2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体i-1-1)制备得到白色固体化合物i-7。
[0109]
化合物 i-7 (40 毫克), ms: 470.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.63 (s, 1h), 8.27 (d, j = 8.5 hz, 1h), 8.17-8.13 (m, 1h), 7.91-7.86 (m, 1h), 7.29-7.26 (m, 1h), 7.05 (s, 1h), 6.88 (s, 2h), 6.79-6.75 (m, 1h), 6.69 (s, 1h), 4.95 (t, j = 7.0 hz, 1h), 3.49 (s, 3h), 3.46 (s, 3h), 1.53 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0110]
化合物i-8：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
化合物i-8的合成参考化合物i-7，通过使用6-羟基吡啶-3-硼酸频哪醇酯代替1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-硼酸频哪醇酯制备得到白色固体化合物i-8。
[0111]
化合物i-8 (25毫克), ms: 456.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.41 (s, 1h), 8.21-8.16 (m, 1h), 8.10-8.00 (m, 4h), 7.16-7.11 (m, 1h), 6.96-6.91 (m, 3h), 6.74 (s, 1h), 6.54 (d, j = 9.7 hz, 1h), 4.97-4.94 (m, 1h), 3.44 (s, 3h), 1.53 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0112]
化合物i-9：4-(((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧哌啶-4-基)酞嗪-1(2h)-酮化合物i-9的合成参考化合物i-1，通过使用(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-6-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)酞嗪-1(2h)-酮(化合物i-7)代替2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体i-1-1)制备得到白色固体化合物i-9。
[0113]
化合物 i-9 (20 毫克), ms: 474.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.19 (s, 1h), 8.15 (d, j = 8.2 hz, 1h), 7.74 (d, j = 8.3 hz, 1h), 7.02 (s, 1h), 6.93 (d, j = 13.2 hz, 2h), 6.74 (s, 1h), 4.97-4.93 (m, 1h), 3.48-3.42 (m, 4h), 3.38-3.35 (m, 1h), 3.28-3.25 (m, 1h), 2.88 (s, 3h), 2.59-2.55 (m, 2h), 2.11-1.98 (m, 2h), 1.51 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0114] 化合物 i-10：(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲
基-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸步骤1:(r)-4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯的制备 (中间体i-10-1)将(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基三氟甲基磺酸酯(中间体 a1, 400毫克，0.74毫摩尔)和n-叔丁氧羰基-1,2,5,6-四氢吡啶-4-硼酸频哪醇酯(343毫克，1.110毫摩尔) 溶于1,4-dioxane (5毫升)和h2o(1毫升)中。搅拌下缓慢加入pdcl2(dppf) (54.2毫克，0.074毫摩尔)和k2co
3 (307毫克，2.221毫摩尔)，加完后，将反应混合物在80度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(300毫克，70.7%)。ms: 574.2 (m+h)
+
。
[0115]
步骤2:(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体i-10-2)将(r)-4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-羧酸叔丁酯(300毫克，0.523毫摩尔)的tfa(2毫升)反应混合液在20度搅拌反应1小时，然后浓缩得到黄色固体(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
(230毫克，93%)。ms: 474.2 (m+h)
+
。
[0116]
步骤3:(r)-2-(4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-基)乙酸乙酯的制备 (中间体i-10-3)将(r)-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮(100毫克，0.211毫摩尔)和tea (42.7毫克，0.422毫摩尔)溶于dcm (2毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入2-溴乙酸乙酯 (52.9毫克，0.317毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体(r)-2-(4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-基)乙酸乙酯(85毫克，71.9%)。ms: 560.2 (m+h)
+
。
[0117]
步骤4:(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢酞嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸乙酯的制备 (中间体i-10-4)将(r)-2-(4-(2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)-3,6-二氢吡啶-1(2h)-基)乙酸乙酯(80毫克，0.151毫摩尔)溶于甲醇(2毫升)中。在20度搅拌下加入钯碳(40毫克)，加完后，将反应混合物在20度氢气作用下搅拌反应2小时，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经pre-hplc纯化得到黄色油状物(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢酞嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸乙酯(80毫克)。ms: 532.2 (m+h)
+
。
[0118]
步骤 5:(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸的制备 (化合物i-10)将(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢酞嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸乙酯(80毫克)溶于甲醇(1毫升)和水(1毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入氢氧化锂(30.2毫克，0.75毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌1小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经pre-hplc纯化得到白色固体(r)-2-(4-(4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代-1,2-二氢邻苯二甲嗪-6-基)哌啶-1-基)乙酸(23毫克，28.3%)。ms: 504.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.23 (s, 1h), 8.13 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.70 (d, j = 8.2 hz, 1h), 7.11 (d, j = 7.2 hz, 1h), 6.86 (d, j = 9.2 hz, 2h), 6.66 (s, 1h), 5.48 (s, 2h), 4.95-4.86 (m, 1h), 3.44 (s, 3h), 3.28 (s, 2h), 3.26-3.22 (m, 2h), 2.82-2.75 (m, 1h), 2.62-2.53 (m, 2h), 2.05-1.96 (m, 2h), 1.88-1.82 (m, 2h), 1.50 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0119]
化合物 i-11：(r)-6-(1-乙酰哌啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
化合物i-11的合成参考化合物i-10，通过使用乙酰氯代替2-溴乙酸乙酯制备得到白色固体化合物i-11。
[0120]
化合物i-11(24毫克), ms: 488.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.15-8.11 (m, 2h), 7.70 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.05-7.00 (m, 1h), 6.85 (d, j = 6.7 hz, 2h), 6.66 (s, 1h), 5.48 (s, 2h), 4.86-4.83 (m, 1h), 4.62-4.58 (m, 1h), 3.99-3.96 (m, 1h), 3.43 (s, 3h), 3.20-3.12 (m, 1h), 2.99-2.90 (m, 1h), 2.64-2.55 (m, 1h), 2.04 (s, 3h), 1.90-1.82 (m, 2h), 1.73-1.61 (m, 2h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0121] 化合物 i-12：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(1-(二甲基甘氨酸)哌啶-4-基)-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮化合物i-12的合成参考化合物i-11，通过使用二甲基甘氨酸酰氯代替乙酰氯制备得到白色固体化合物i-12。
[0122]
化合物i-12(26毫克), ms: 531.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.16-8.10 (m, 2h), 7.70 (d, j = 8.3 hz, 1h), 7.05-7.01 (m, 1h), 6.85 (d, j = 7.5 hz, 2h), 6.66 (s, 1h), 5.48 (s, 2h), 4.90 (t, j = 7.0 hz, 1h), 4.60-4.54 (m, 1h), 4.24-4.18 (m, 1h), 3.43 (s, 3h), 3.10 (s, 3h), 2.99-2.92 (m, 1h), 2.68-2.60 (m, 1h), 2.19 (s, 6h), 1.91-1.84 (m, 2h), 1.70-1.61 (m, 2h), 1.50 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
6.1 hz, 4h), 3.88 (s, 3h), 3.42 (s, 3h), 1.51 (d, j = 7.0 hz, 3h), 1.35 (t, j = 5.7 hz, 6h)。
[0127] 化合物 i-15：(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6,7-二甲氧基-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮步骤1:(r)-6,7-二甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮的制备 (中间体i-15-1)将(r)-6-羟基-7-甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体a2-9, 60毫克，0.137毫摩尔)溶于乙腈(5毫升)中。在0度搅拌下缓慢加入k2co3(56.7毫克，0.411毫摩尔)和碘甲烷(58.3毫克，0.411毫摩尔)，加完后，将反应混合物在20度继续搅拌12小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到黄色固体(r)-6,7-二甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(62毫克，100%)。ms: 453.1 (m+h)
+
。
[0128]
步骤2:(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6,7-二甲氧基-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮的制备 (化合物 i-15)化合物 i-15的合成参考化合物 i-1，通过使用((r)-6,7-二甲氧基-2-甲基-4-((1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体i-15-1)代替2-甲基-4-(((r)-1-(3-硝基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-6-(((s)-四氢呋喃-3-基)氧基)酞嗪-1(2h)-酮(中间体 i-1-1)制备得到白色固体化合物 i-15。
[0129]
化合物 i-15(15.68毫克), ms: 423.0 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 7.68 (s, 1h), 7.56 (d, j = 1.9 hz, 1h), 6.95 (d, j = 13.8 hz, 3h), 6.76 (s, 1h), 4.93 (d, j = 7.3 hz, 2h), 3.97 (s, 3h), 3.89 (d, j = 1.9 hz, 3h), 3.42 (d, j = 1.9 hz, 3h), 1.51 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0130] 化合物 i-16：(r)-6-(1-乙酰哌啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-甲氧基-2-甲基酞嗪-1(2h)-酮
1h), 4.90 (s, 1h), 3.93 (s, 3h), 3.47 (s, 3h), 3.45 (s, 3h), 1.47 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0138] 化合物 i-20:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-甲氧基-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-20的合成参考化合物 i-2，通过使用中间体a3-6代替中间体a1-6制备得到白色固体化合物 i-20。
[0139]
化合物 i-20 (17毫克)，ms: 394.2 (m+h)
+
。
[0140] 化合物 i-21:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-3-甲基-7-(1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-21的合成参考化合物 i-7，通过使用中间体a3代替中间体a1制备得到白色固体化合物 i-21。
[0141]
化合物 i-21 (27毫克)，ms: 471.0 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.44 (s, 1h), 8.80 (s, 1h), 7.90 (d, j = 7.1 hz, 1h), 7.50
ꢀ–ꢀ
7.34 (m, 2h), 7.12
ꢀ–ꢀ
6.95 (m, 3h), 6.82 (s, 1h), 4.94 (t, j = 6.8 hz, 1h), 3.50 (s, 3h), 3.45 (s, 3h), 1.54 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0142] 化合物 i-22:(r)-6-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-甲氧基-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
6.62 (d, j = 9.6 hz, 1h), 4.97
ꢀ–ꢀ
4.88 (m, 1h), 3.58 (s, 3h), 3.44 (s, 3h), 1.54 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0145] 化合物 i-24:(r)-7-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-24的合成参考化合物 i-22，通过使用中间体a3代替中间体a2制备得到白色固体化合物 i-24。
[0146]
化合物 i-24 (33毫克), ms: 487.1 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.32 (s, 1h), 8.27 (d, j = 10.5 hz, 1h), 7.33 (d, j = 7.0 hz, 1h), 7.02 (s, 1h), 6.88 (d, j = 7.1 hz, 2h), 6.71 (s, 1h), 4.91 (t, j = 6.9 hz, 1h), 4.28 (s, 1h), 4.23 (s, 1h), 3.43 (s, 3h), 2.70 (d, j = 40.4 hz, 2h), 2.07 (d, j = 15.5 hz, 3h), 1.51 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0147] 化合物 i-25:(r)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-氟-2-甲基-6-(1-甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)邻苯二甲嗪-1(2h)-酮化合物 i-25的合成参考化合物 i-13，通过使用中间体a4代替中间体a1制备得到白色固体化合物i-25。
[0148]
化合物i-25 (8毫克), ms: 488.2 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.43 (d, j = 7.1 hz, 1h), 8.18 (d, j = 2.6 hz, 1h), 7.93 (d, j = 10.8 hz, 1h), 7.81 (d, j = 9.5 hz, 1h), 7.11 (d, j = 7.0 hz, 1h), 6.89 (d, j = 7.7 hz, 2h), 6.71 (s, 1h), 6.59 (d, j = 9.4 hz, 1h), 4.95-4.87 (m, 1h), 3.55 (s, 3h), 3.45 (s, 3h), 1.50 (d, j = 7.0 hz, 3h)。
[0149] 化合物 i-26:(r)-6-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-氟-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮化合物 i-26的合成参考化合物 i-24，通过使用中间体a4代替中间体a3制备得到白色固体化合物i-26。
[0150]
化合物i-26 (7.3毫克), ms: 504.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.30 (d, j = 6.8 hz, 1h), 7.84 (d, j = 10.9 hz, 1h), 7.13 (d, j = 7.0 hz, 1h), 6.89 (d, j = 8.8 hz, 2h), 6.71 (s, 1h), 6.21 (s, 1h), 4.93-4.88 (m, 1h), 4.22-4.15 (m, 2h), 3.69-3.64 (m, 2h), 3.43 (s, 3h), 2.66-2.52 (m, 2h), 2.07 (d, j = 13.3 hz, 3h), 1.49 (d, j = 6.9 hz, 3h)。
[0151] 化合物 i-27:(r)-6-(1-乙酰基-2,5-二氢-1h-吡咯-3-基)-4-(1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-氟-2-甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
3h)。
[0159] 化合物 i-31:(r)-7-(1-乙酰哌啶-4-基)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-31的合成参考化合物 i-16，通过使用中间体i-24-3代替中间体i-16-3制备得到白色固体化合物i-31。
[0160]
化合物i-31 (21毫克), ms: 489.1 (m+h)
+
。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 9.31 (s, 1h), 8.09 (s, 1h), 7.24 (d, j = 7.0 hz, 1h), 6.89 (d, j = 11.5 hz, 2h), 6.72 (s, 1h), 4.88 (t, j = 6.9 hz, 1h), 4.56 (d, j = 13.0 hz, 1h), 3.96 (d, j = 13.6 hz, 1h), 3.43 (s, 3h), 3.16 (m, 2h), 2.66 (t, j = 12.7 hz, 1h), 2.04 (s, 6h), 1.78
ꢀ–ꢀ
1.60 (m, 2h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 4h)。
[0161]
化合物 i-32: 6-(1-乙酰吡咯烷-3-基)-4-((r)-1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2,7-二甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮化合物 i-32的合成参考化合物 i-29，通过使用中间体a5代替中间体a4制备得到白色固体化合物i-32。
[0162]
化合物i-32 (19.3毫克), ms: 488.2 (m+h)
+
,1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.22-8.14 (m, 1h), 8.00 (d, j = 4.2 hz, 1h), 7.10-6.93 (m, 1h), 6.87 (d, j = 9.4 hz, 2h), 6.69 (s, 1h), 4.95-4.87 (m, 1h), 3.98-3.85 (m, 1h), 3.78-3.72 (m, 1h), 3.64-3.55 (m, 1h), 3.45-3.31 (m, 5h), 2.52 (d, j = 8.9 hz, 3h), 2.37-2.13 (m, 2h), 2.00-1.96 (m, 3h), 1.50 (dd, j = 7.3, 2.7 hz, 3h).化合物 i-33:(r)-6-(1-乙酰基-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2,7-二甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮
化合物 i-33的合成参考化合物 i-26，通过使用中间体a5代替中间体a4制备得到白色固体化合物i-33。
[0163]
化合物i-33 (7.9毫克), ms: 500.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.02 (s, 2h), 7.02 (s, 1h), 6.92 (d, j = 16.0 hz, 2h), 6.73 (s, 1h), 5.74 (s, 1h), 4.89 (s, 1h), 4.16-4.11 (m, 2 h), 3.72
ꢀ‑ꢀ
3.66 (m, 2h), 3.42 (s, 3h), 2.53 (s, 1h), 2.45 (s, 1h), 2.41 (s, 3h), 2.09
ꢀ–ꢀ
2.05 (m, 4h), 1.47 (d, j = 7.0 hz, 3h).化合物 i-34:(r)-6-(1-乙酰哌啶-4-基)-4-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-2,7-二甲基邻苯二甲嗪-1(2h)-酮化合物 i-34的合成参考化合物 i-31，通过使用中间体i-33-3代替中间体i-24-3制备得到白色固体化合物i-34。
[0164]
化合物i-34 (9毫克), ms: 502.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.03 (d, j = 2.5 hz, 1h), 7.98 (s, 1h), 7.06 (d, j = 7.7 hz, 1h), 6.89 (d, j = 11.9 hz, 2h), 6.71 (s, 1h), 4.95
ꢀ–ꢀ
4.84 (m, 1h), 4.62 (d, j = 13.1 hz, 1h), 3.98 (d, j = 13.7 hz, 2h), 3.40 (s, 3h), 3.23
ꢀ–ꢀ
3.12 (m, 2h), 2.70
ꢀ–ꢀ
2.59 (m, 1h), 2.52 (d, j = 10.8 hz, 3h), 2.07 (s, 1h), 2.05 (s, 3h), 1.74 (s, 3h), 1.50 (d, j = 7.1 hz, 3h). 化合物 i-35:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-(1,1-二氧基硫代吗啉)-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮步骤1：中间体i-35-1的制备将中间体a3 (705毫克，1.304毫摩尔), 1,1-二氧代-4-硫代吗啉(353毫克，2.61
毫摩尔)和k2co
3 (541毫克，3.91毫摩尔)的dmf(5毫升)反应混合物在100度继续搅拌11小时，然后加入冰水淬灭反应，并用乙酸乙酯稀释萃取。有机相用饱和盐水洗涤，无水干燥硫酸钠干燥，然后过滤，浓缩得到粗产物，粗产物经硅胶柱层析纯化得到黄色固体中间体i-35-1 (460毫克，67.1%)。ms: 527.2 (m+h)
+
。
[0165]
步骤2：(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-(1,1-二氧基硫代吗啉)-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮的制备(化合物i-35)化合物 i-35的合成参考化合物 i-26，通过使用中间体i-35-1代替中间体i-26-3制备得到白色固体化合物i-35。
[0166]
化合物i-35 (17.9毫克), ms: 497.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.96 (s,1h),7.44 (s, 1h), 7.02 (d, j = 7.0 hz, 1h), 6.88 (d, j = 8.1 hz, 2h), 6.73 (s, 1h), 4.90 (t, j = 6.9 hz, 1h), 4.24 (s, 2h), 3.36-3.33 (m, 4h), 3.25-3.22 (m, 5h), 3.18 (s, 1h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 3h).化合物 i-36:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-3-甲基-7-吗啉吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-36的合成参考化合物 i-35，通过使用吗啡啉代替1,1-二氧代-4-硫代吗啉制备得到白色固体化合物i-36。ms: 497.2 (m+h)
+
。
[0167]
化合物 i-37:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-3-甲基-7-(4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)哌嗪-1-基)吡啶并[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮
化合物 i-37的合成参考化合物 i-35，通过使用1-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)哌嗪代替1,1-二氧代-4-硫代吗啉制备得到白色固体化合物i-37。
[0168]
化合物i-37 (11.1毫克), ms: 528.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.93 (s,1h), 7.38 (s, 1h), 7.33 (s, 1h), 7.26 (s, 1h), 7.09
ꢀ–ꢀ
7.00 (m, 1h), 6.89 (d, j = 9.2 hz, 2h), 6.74 (s, 1h), 4.94
ꢀ–ꢀ
4.81 (m, 2h), 3.85 (t, j = 4.8 hz, 4h), 3.73 (d, j = 1.4 hz, 3h), 3.34 (s, 3h), 3.01 (t, j = 5.0 hz, 4h), 1.50 (d, j = 6.9 hz, 3h).化合物 i-38:(r)-1-((1-(3-氨基-5-(三氟甲基)苯基)乙基)氨基)-7-(4-(环丙烷羰基)哌嗪-1-基)-3-甲基吡啶[3,4-d]哒嗪-4(3h)-酮化合物 i-38的合成参考化合物 i-35，通过使用环丙基(哌嗪-1-基)甲酮代替1,1-二氧代-4-硫代吗啉制备得到白色固体化合物i-38。
[0169]
化合物i-38 (19毫克), ms: 516.2 (m+h)
+
, 1
h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.92 (s,1h)，7.37 (s, 1h), 7.35
ꢀ–ꢀ
7.32 (m, 1h), 7.25
ꢀ–ꢀ
7.20 (m, 2h), 7.11
ꢀ–ꢀ
7.10 (m, 1h), 4.93 (d, j = 7.2 hz, 2h), 3.84 (s, 4h), 3.74
ꢀ‑ꢀ
3.64(m, 4h), 3.33 (s, 3h), 2.06
ꢀ‑ꢀ
2.01 (m, 1h), 1.54 (d, j = 7.0 hz, 3h), 0.78
ꢀ–ꢀ
0.71 (m, 4h). 细胞水平药效评价本实验旨在验证本发明化合物对ras信号通路激活的nci-h358人非小细胞肺癌细胞的增殖抑制效果。
[0170]
主要实验材料和仪器：rpmi 1640细胞培养基+ l-glutamine (invitrogen)，胎牛血清(corning)，二甲基亚砜dmso (sigma)，青霉素链霉素 (gibico)，杜氏磷酸盐缓冲液dpbs (corning)，胰酶trypletm express (gibco)，collagen type i rat tail (corning)，96孔u型底细胞培养板 (thermofisher)，cell titer glo
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(promega)，tc-20细胞计数仪(bio-rad)，多功能酶标仪bio synergy neo2 (bio-tek)。
[0171]
人非小细胞肺癌细胞nci-h358 (atcc) 培养于10%胎牛血清、100u青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi 1640培养基中。
[0172]
实验步骤：将化合物用dmso按照半对数稀释的方法进行稀释 (即稀释倍数为3.16倍)，共设7个浓度梯度 (使化合物的起始浓度为6mm)，并设dmso对照孔。然后用培养液将上
述稀释的化合物进行100倍稀释，并取80μl用培液稀释好的化合物加入96孔u型板。
[0173]
然后将处于对数生长期的nci-h358细胞用胰酶进行消化，并用bio-rad tc20
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细胞计数仪进行细胞计数，用含collagen i (1:125稀释)的培养液将细胞进行稀释，取80μl细胞混悬液接种于上述含80μl已经稀释好化合物的96孔板，使化合物的最大作用浓度为30μm，细胞的密度约为每孔2400个细胞。250g离心5分钟使细胞形成球体。在37℃下，5% co2培养箱中培养7天。取出细胞培养板，室温平衡30分钟。每孔加入80μl的celltiter glo 试剂。在摇床上350rpm振动20分钟，使细胞充分裂解。酶标仪测定不同细胞数量下的化学发光值，根据dmso对照和培养基对照计算待测化合物的细胞毒性百分比，以化合物的浓度为横坐标，以化合物细胞毒力的百分比(cytotoxicity%)为纵坐标，利用graphpad prism，按照四参数法拟合(fit)药物半数抑制浓度ic
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。
[0174]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。