一种植物乳杆菌YG06菌株及其应用的制作方法

一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体为一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用。


背景技术：

2.近年来，肥胖症的患病率迅速上升，不但人群分布广泛，而且严重危害身体健康，医学研究已经表明，对于心血管疾病、二型糖尿病、炎症、脂肪肝和高血压等许多成年发病的慢性疾病来说，肥胖是公认的主要危险因素；此外，肥胖还可能引发一些心理及社会适应方面的问题，如记忆力减退、认知受损、社会适应力减弱等，因此，预防肥胖的发生是降低相关代谢性疾病发病率与死亡率的重要举措之一。
3.肠道菌群指的是寄居在人体肠道内的微生物，肠道菌群之间相互依存、相互制约，形成动态平衡体系，与宿主之间形成互作，影响机体的营养与健康，大量的研究已经揭示了几种肠道菌与肥胖和代谢紊乱联系起来的机制，其中包括(1)影响机体膳食能量的获取；(2)调控机体脂质代谢；(3)调控食欲中枢神经系统；(4)诱发全身性系统炎症。
4.益生菌指活的微生物通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经过论证的功能性健康益处的一类微生物的总称(who，2011)。目前，益生菌已广泛应用于生物工程、农业、食品安全及生命健康领域，其中益生乳酸菌的应用最为广泛。
5.综上，旨在发现一株可以减重、改善血糖和认知损伤的益生菌，将对人类的生活和健康产生深远影响。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.(二)技术方案
9.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用，所述植物乳杆菌yg06已于2022年3月6日在广东省微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼 5楼，保藏号为gdmcc no.62277。
10.优选的，所述植物乳杆菌yg06应用在制备制备药物、食品、食品添加剂或保健品中。
11.优选的，所述药物、食品、食品添加剂或保健品用于减低体重、改善血糖和改善肥胖引起的认知损伤。
12.优选的，所述食品包含植物乳杆菌yg06菌株，以及食品学上可接受的添加剂；优选地，所述食品为植物乳杆菌发酵酸牛乳。
13.优选的，所述植物乳杆菌yg06菌株发酵酸牛乳是由植物乳杆菌粉、奶粉以及发酵剂制备获得的；
14.所述发酵剂包括保加利亚乳杆菌粉以及嗜热乳杆菌粉；
15.所述植物乳杆菌粉中植物乳杆菌yg06的含量为1.0
×
109cfu/g；
16.基于所述植物乳杆菌发酵酸牛乳的总重量，所述保加利亚乳杆菌粉和所述嗜热乳杆菌粉的总重量为0.4％；
17.基于所述植物乳杆菌发酵酸牛乳的总重量，所述植物乳杆菌粉的总重量为1％。
18.优选的，所述植物乳杆菌发酵酸牛乳，其制备方式如下：
19.(1)将所述奶粉与水进行第一混合、均质、灭菌以及第一冷却处理，其中，所述灭菌是在121℃的条件下进行300s，所述第一冷却处理后的温度为 42℃；
20.(2)向第一冷却处理产物中加入活化好的所述发酵剂进行发酵处理，其中，所述发酵处理是在42℃的条件下进行10h；
21.(3)将发酵处理产物进行第二冷却处理，并将第二冷却处理产物与所述植物乳杆菌粉进行第二混合处理，以便获得所述植物乳杆菌发酵酸牛乳。
22.优选的，所述药物包含植物乳杆菌yg06；以及医药用无毒载体。
23.优选的，所述药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种；优选的，所述药物为益生菌片剂。
24.优选的，所述植物乳杆菌片剂包括：植物乳杆菌冻干粉、膳食纤维、山梨糖醇、以及硬脂酸镁；
25.所述植物乳杆菌冻干粉中所述植物乳杆菌的含量为1.0
×
109cfu/g；
26.所述植物乳杆菌冻干粉中所述膳食纤维为低聚半乳糖；
27.所述植物乳杆菌冻干粉为25重量份，所述膳食纤维为60重量份；
28.所述山梨糖醇为10重量份，所述硬脂酸镁为5重量份。
29.(三)有益效果
30.与现有技术相比，本发明提供了一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用，具备以下有益效果：
31.该植物乳杆菌yg06菌株及其应用，本技术的植物乳杆菌yg06菌株，能有效缓解饮食引起的血脂异常，改善高脂饮食诱导的肠道菌群失衡，还具有优异的减重、改善血糖和改善认知损伤的功能，可以广泛应用于各种益生菌类食品或保健品的制备。因此该菌株的应用潜力巨大。
附图说明
32.图1为本发明实施例1中小鼠体重变化；
33.图2为本发明实施例2中gtt和itt曲线下面积；
34.图3为本发明实施例2中血糖相关指标；
35.图4为本发明实施例3中y迷宫实验结果；
36.图5为本发明实施例3中巴恩斯迷宫实验结果；
37.图6为本发明实施例4中小鼠体重变化；
38.图7为本发明实施例4中小鼠血糖相关指标；
39.图8为本发明实施例4中y迷宫实验结果；
40.图9为本发明实施例4中巴恩斯迷宫实验结果。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.参考附图1-3，本发明提供一种技术方案，一种植物乳杆菌yg06菌株及其应用，植物乳杆菌yg06已于2022年3月6日在广东省微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为gdmcc no.62277，生物材料名称为：lactiplantibacillusplantarum。
43.本发明实施例还提供了植物乳杆菌yg06在制备制备药物、食品、食品添加剂或保健品中的应用，“食品”是指广义理解，其可以是任何可被使用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的食品还可以为保健品、饮品、发酵食品等，例如酸奶、乳酸菌饮料、乳酸菌发酵豆制品、奶酪、含发酵酸奶的加工食品或者保健食品等。
44.本实施例中，药物、食品、食品添加剂或保健品用于减低体重、改善血糖和改善肥胖引起的认知损伤，用途用于非诊断目的，如用于科学研究或养生保健等。
45.本实施例中，食品包含植物乳杆菌yg06菌株，以及食品学上可接受的添加剂；优选地，食品为植物乳杆菌发酵酸牛乳。
46.本实施例中，植物乳杆菌yg06菌株发酵酸牛乳是由植物乳杆菌粉、奶粉以及发酵剂制备获得的；
47.发酵剂包括保加利亚乳杆菌粉以及嗜热乳杆菌粉；
48.植物乳杆菌粉中植物乳杆菌yg06的含量为1.0
×
109cfu/g；
49.基于植物乳杆菌发酵酸牛乳的总重量，保加利亚乳杆菌粉和嗜热乳杆菌粉的总重量为0.4％；
50.基于植物乳杆菌发酵酸牛乳的总重量，植物乳杆菌粉的总重量为1％。
51.本实施例中，植物乳杆菌发酵酸牛乳，其制备方式如下：
52.(1)将奶粉与水进行第一混合、均质、灭菌以及第一冷却处理，其中，灭菌是在121℃的条件下进行300s，第一冷却处理后的温度为42℃；
53.(2)向第一冷却处理产物中加入活化好的发酵剂进行发酵处理，其中，发酵处理是在42℃的条件下进行10h；
54.(3)将发酵处理产物进行第二冷却处理，并将第二冷却处理产物与植物乳杆菌粉进行第二混合处理，以便获得植物乳杆菌发酵酸牛乳。
55.本实施例中，药物包含植物乳杆菌yg06；以及医药用无毒载体。
56.药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种；优选的，药物为益生菌片剂。
57.本发明所述的药物中还包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料包括但不限于：药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂。所述载体包括但不限于淀粉或其衍生物、乳糖、聚乙二醇；所述稀释剂包括但不限于淀粉或其衍生物、乳糖、蔗糖、植物油、蜡、脂肪酸；填充剂包括但不限于滑石粉；所述辅料还可以包括如防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂、保湿剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、缓冲剂、ph值调节剂。上述物质根据
需要帮助配方的稳定性或有助于提高活性或生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
58.本实施例中，植物乳杆菌片剂包括：植物乳杆菌冻干粉、膳食纤维、山梨糖醇、以及硬脂酸镁；
59.植物乳杆菌冻干粉中植物乳杆菌的含量为1.0
×
109cfu/g；
60.植物乳杆菌冻干粉中膳食纤维为低聚半乳糖；
61.植物乳杆菌冻干粉为25重量份，膳食纤维为60重量份；
62.山梨糖醇为10重量份，硬脂酸镁为5重量份。
63.实施例1减重实验
64.(一)植物乳杆菌yg06培养及制备
65.1、mrs培养基：由酪蛋白胨10g/l，牛肉浸膏10g/l，酵母浸膏5g/l，葡萄糖20g/l，磷酸氢二钾2g/l，吐温80 1g/l，柠檬酸三铵2g/l，醋酸钠5g/l，硫酸镁0.1g/l，硫酸锰0.05g/l，调整ph至6.5，121℃灭菌20min 制得。
66.2、将保存的植物乳杆菌yg06接种至mrs液体培养基于37℃培养24h 后，于4℃、12000r/min条件下离心15min，收集菌泥，加入适量冻干保护剂于-80℃冻干保存待用。
67.(二)灌胃试剂准备
68.药物对照组灌胃试剂：阿伐他汀(降血脂药物)用适量无菌水配制成 1mg/ml，现配现用。
69.yg06菌株组灌胃试剂：将植物乳杆菌yg06菌株冻干粉用适量的无菌水复溶至活菌数为109cfu/ml，现配现用。
70.(三)动物实验验证
71.1、动物模型的建立：45只7周龄c57bl/6系雄性小鼠经适应性喂养一周后，随机分为3组，每组15只，正常组饲喂ain93m标准饲料，模型组、yg06组饲喂60％高脂饲料。经两周高脂饲料诱导后检测每只小鼠的体重水平，剔除体重增长不符合标准的小鼠以确保高模型建立成功，此时记为给药第0周。
72.2、给药处理：yg06组按0.1ml/10g给药，正常组和模型组给予等体积无菌水，每日1次，连续灌胃八周。
73.3、样品收集及检测：每周测一次小鼠的体重，实验结果见图1。
74.(四)实验结果
75.由图1的结果可知，灌胃8周内，高脂组的体重显著高于其它组(p ＜0.05)，yg06组从灌胃第四周开始体重显著低于高脂组(p＜0.05)，表明植物乳杆菌yg06可使高脂小鼠减轻体重。
76.实施例2降血糖实验
77.(一)植物乳杆菌yg06培养及制备、灌胃试剂准备、动物模型的建立、给药处理同实施例1。
78.(二)样品收集及检测：小鼠喂养8周后，禁食不禁水过夜(14h)，小鼠尾部取血，测定空腹血糖(fasting blood glucose，fbg)，之后小鼠体内注射一定量的胰岛素或葡萄糖，检测0、15、30、60、120min时的血糖，从而测定小鼠的葡萄糖耐受性(gtt)、胰岛素敏感性(itt)。采用elisa 法，按照试剂盒步骤操作建立标准曲线并测定空腹胰岛素(fins)和胰升
糖素样肽(glp-1)；计算胰岛素敏感指数(isi)＝i/(fbg*fins)、稳态胰岛抵抗指数(homa-ir)＝fbg*fins/22.5(fbg：空腹血糖；fins：空腹胰岛素)
79.(三)实验结论
80.葡萄糖耐受性(gtt)、胰岛素敏感性(itt)实验结果如图1a和1b所示，其曲面下面积见图2。由此可知，高脂饮食组比其它任意组相比其葡萄糖耐受性均显著升高，胰岛素敏感性显著降低(p＜0.01)。而yg06组与高脂组相比其葡萄糖耐受性显著降低，胰岛素敏感性显著提高(p＜0.01)。
81.空腹血糖、胰岛素抵抗指标homa、glp-和瘦素leptin的结果如图3 所示。yg06组的空腹血糖显和homa著低于高脂组(p＜0.05)。表明植物乳杆菌yg06可以显著降低空腹血糖，并改善胰岛素的抵抗性。
82.胰高血糖素样肽-1(glp-1)是由肠道l细胞产生，具有食欲中枢神经系统的活性，向机体补充glp-1能够减少能量的摄入，缓解肥胖的发生。实验结果显示yg06组的glp-1显著高于高脂组(p＜0.05)，表明植物乳杆菌yg06可以增加glp-1的产生，从而控制食欲，改善血糖情况。
83.综上，植物乳杆菌yg06可以通过改善葡萄糖耐受性、提高胰岛素敏感性，以及降低空腹血糖，抑制食欲从而参与血糖调节。
84.实施例3改善认知实验
85.植物乳杆菌yg06培养及制备、灌胃试剂准备、动物模型的建立、给药处理同实施例1
86.(二)实验方法：
87.1.y迷宫实验
88.为检测小鼠自主活动能力和学习记忆功能，受试小鼠被置于内壁黑暗，连有三叉臂通道(长20cm，宽4cm，高40cm)的y迷宫装置中心，在视频监测装置正下方自由探索，录像装置与相关软件记录其行走路线、速度、总路程与进臂次数等数据。每只受试小鼠被置于设备中央后开始为期8min的计时活动，测试重复3次，间隔时间大于1h。
89.2.巴恩斯迷宫实验
90.1)实验开始前一天，将动物单个从目标洞置于目标箱里内适应4min.
91.2)将动物置于迷宫中央的塑料圆筒(直径20cm高27cm)内限制活动5s.
92.3)移开圆筒，启动软件。动物四肢均进入目标箱，则计为一次逃离，并让动物在箱里停留30s。每一只动物一次最多观察4min。在此期间如果动物仍然找不到目标箱，则将动物从迷宫移开，放入目标箱停留30s。利用这一间隙清洁迷宫。动物每天训练1次，连续4天。
93.4)从第二次训练开始，每次训练之前将迷宫转动一至数个洞的位置，但目标箱始终固定在同一方向。这样做的目的是防止动物依靠气味，而凭借记忆来确定目标箱的位置。记录到达目标箱的潜伏期和每只动物的错误次数等。
94.5)第五天撤去目标箱，让小鼠自由探索120s，记录下探究任何一个洞的次数，在目标箱附近停留时间，以及首次找到目标箱的时间。
95.(三)试验结果及分析
96.利用巴恩斯迷宫与y迷宫评价小鼠的认知功能损伤情况，结果如图4、5所示，在巴恩斯迷宫中，yg06组小鼠在训练第二天的潜伏期显著降低，在测试天中，yg06组小鼠在在目
标箱探究次数与目标箱停留时间显著提高，首次到达目标箱时间降低；在y迷宫中，交替成功百分比上升。表明植物乳杆菌yg06 缓解了hfd小鼠认知功能损伤。
97.实施例4食品及药品的制备
98.本实施例分别将植物乳杆菌yg06制成常用的食品和药品，具体如下：
99.(1)植物乳杆菌发酵酸牛乳
100.将奶粉和水进行混合，均质，以121℃超高温灭菌300s杀菌，冷却到42℃，接入活化好的发酵剂：保加利亚乳杆菌和嗜热乳杆菌菌粉总共接入量为重量份0.4％。在42℃下发酵10h，冷却后加入重量份1％cfu为109cfu/g 的植物乳杆菌yg06，搅拌，灌装即可。
101.其中，奶粉为酸奶制备中常规使用的奶粉。
102.(2)植物乳杆菌片剂
103.配方：109cfu/g的植物乳杆菌yg06的冻干粉25％、低聚半乳糖60％、山梨糖醇10％、硬脂酸镁5％；以上组分均为重量份，将各组分混合均匀后，压片制成片剂。其中，植物乳杆菌yg06的冻干粉为采用冻干机将其菌悬液在无菌环境下冷冻抽真空干燥而成。
104.(3)以上食品及药品的药效试验
105.实验方案：同实施例1、2、3，其中灌胃的样品改为以上植物乳杆菌发酵酸牛乳和植物乳杆菌片剂捣碎后加无菌水制成的悬浊液，调整菌数约为2.0
×
109cfu/ml。
106.由图6可知，在灌胃期间，高脂组体重显著高于其它任意组(p＜0.05)，灌服植物乳杆菌发酵酸牛乳组和植物乳杆菌片剂组的体重均显著低于高脂组 (p＜0.05)，因此本发明的植物乳杆菌发酵酸牛乳和植物乳杆菌片剂具有使高脂小鼠减轻体重的功效。
107.由图7可知，与高脂组相比，灌服植物乳杆菌发酵酸牛乳组和植物乳杆菌片剂组的空腹血糖和homa指数均显著降低(p＜0.05)，glp-1含量显著增高。因此本发明的植物乳杆菌发酵酸牛乳和植物乳杆菌片剂具有降低空腹血糖，改善胰岛素抵抗性，抑制食欲的作用。
108.利用巴恩斯迷宫与y迷宫评价小鼠的认知功能损伤情况，结果如图8、 9所示，在巴恩斯迷宫中，植物乳杆菌发酵酸牛乳组和植物乳杆菌片剂组小鼠在训练第二天的潜伏期显著降低，在测试天中，植物乳杆菌发酵酸牛乳组和植物乳杆菌片剂小鼠在目标箱探究次数与目标箱停留时间显著提高，首次到达目标箱时间降低；在y迷宫中，交替成功百分比上升。表明植物乳杆菌发酵酸牛乳和植物乳杆菌片剂缓解了hfd小鼠认知功能损伤。
[0109][0110][0111][0112][0113]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。