MdLOG基因启动子缺失片段及其在检测苹果属植物耐盐性中的应用

mdlog基因启动子缺失片段及其在检测苹果属植物耐盐性中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及mdlog基因启动子缺失片段及其在检测苹果属植物耐盐性中的应用。


背景技术：

2.砧木可以影响果树树体发育，果实产量和品质，抵御环境胁迫。选育耐盐性砧木可以使盐渍化立地条件下的苹果生产获得更优的产量和品质。
3.细胞分裂素是促进生长的重要激素，在苹果砧木八棱海棠根系的dna中克隆得到细胞分裂素激活酶mdlog基因，该基因的mrna全长为1963bp，包含7个外显子和6个内含子。该基因编码一个230个氨基酸的多肽，含有一个功能上高度保守的基序pggxgtxxe。log将不活跃的细胞分裂素核苷酸转化为具有生物活性的游离碱基形式，可催化多种嘧啶和嘌呤核苷酸5'-单磷酸的n-糖苷键水解，形成核糖5-磷酸和相应的游离碱。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供mdlog基因启动子缺失片段及其在检测苹果属植物耐盐性中的应用。
5.第一方面，本发明要求保护mdlog基因启动子缺失片段作为分子标记在如下任一中的应用：
6.(a1)检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低，或制备用于检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低的产品；
7.(a2)检测或辅助检测苹果属植物盐害指数高低，或制备用于检测或辅助检测苹果属植物盐害指数高低的产品；
8.(a3)检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐植物，或制备用于检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐植物的产品；
9.(a4)检测或辅助检测待测苹果属植物能否用作耐盐砧木，或制备用于检测或辅助检测待测苹果属植物能否用作耐盐砧木的产品；
10.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段。所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
11.其中，所述砧木耐盐性指相同的果树接穗嫁接于不同的砧木上，在200mm浓度的氯化钠溶液处理30天后，接穗叶片所表现出的性状，用盐害指数进行表示。将盐害指数分为0-4共五个等级：叶片无症状为0级；1/3及以下叶片顶端或边缘焦黄为1级；1/3至2/3(不含端点)叶片顶端或边缘呈褐色为2级；2/3及以上叶片顶端或边缘呈褐色或死亡(尚未整株死亡或枯萎)为3级；整株死亡或枯萎为4级。0-1级定义为耐盐，2-4级定义为不耐盐。下同。
12.所述耐盐指在200mm浓度的氯化钠溶液处理30天后，植物叶片所表现出的性状，用
盐害指数进行表示。将盐害指数分为0-4共五个等级：叶片无症状为0级；1/3及以下叶片顶端或边缘焦黄为1级；1/3至2/3(不含端点)叶片顶端或边缘呈褐色为2级；2/3及以上叶片顶端或边缘呈褐色或死亡(尚未整株死亡或枯萎)为3级；整株死亡或枯萎为4级。0-1级定义为耐盐，2-4级定义为不耐盐。下同。
13.第二方面，本发明要求保护用于检测mdlog基因启动子缺失片段的物质在如下任一中的应用：
14.(a1)检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低，或制备用于检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低的产品；
15.(a2)检测或辅助检测苹果属植物盐害指数高低，或制备用于检测或辅助检测苹果属植物盐害指数高低的产品；
16.(a3)检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐植物，或制备用于检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐植物的产品；
17.(a4)检测或辅助检测待测苹果属植物能否用作耐盐砧木，或制备用于检测或辅助检测待测苹果属植物能否用作耐盐砧木的产品；
18.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段。所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
19.进一步地，所述用于检测mdlog基因启动子缺失片段的物质可为用于扩增所述mdlog基因启动子缺失片段的引物对。
20.更进一步地，所述引物对中的上游引物可根据苹果属植物基因组中位于所述mdlog基因启动子缺失片段上游的序列设计，下游引物可根据苹果属植物基因组中位于所述mdlog基因启动子缺失片段下游的序列设计。
21.在本发明的具体实施方式中，所述引物对由seq id no.4所示的单链dna分子和seq id no.5所述的单链dna分子组成。
22.第三方面，本发明要求保护如下任一方法：
23.方法1：一种检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低的方法，包括如下步骤(b1)和(b2)：
24.(b1)检测待测苹果属植物的基因组中是否含有mdlog基因启动子缺失片段；
25.(b2)根据(b1)结果，按照如下确定所述待测苹果属植物的砧木耐盐性高低：基因组中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的待测苹果属植物的砧木耐盐性高于或候选高于基因组中含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的待测苹果属植物的砧木耐盐性；
26.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段。所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
27.方法2：一种检测或辅助检测苹果属植物盐害指数高低的方法，包括如下步骤(c1)和(c2)：
28.(c1)检测待测苹果属植物的基因组中是否含有mdlog基因启动子缺失片段；
29.(c2)根据(c1)结果，按照如下确定所述待测苹果属植物盐害指数高低：基因组中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的待测苹果属植物的盐害指数低于或候选低于基因组中含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的待测苹果属植物的盐害指数；
30.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段；所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
31.方法3：一种检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐植物的方法，包括如下步骤(d1)和(d2)：
32.(d1)检测待测苹果属植物的基因组中是否含有mdlog基因启动子缺失片段；
33.(d2)根据(d1)结果，按照如下确定所述待测苹果属植物是否为耐盐植物：若待测苹果属植物的基因组中不含有mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)，则所述待测苹果属植物为或候选为耐盐植物；若待测苹果属植物的基因组中含有mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)，则所述待测苹果属植物不为或候选不为耐盐植物；
34.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段；所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
35.方法4：一种检测或辅助检测待测苹果属植物能否用作耐盐砧木的方法，包括如下步骤(e1)和(e2)：
36.(e1)检测待测苹果属植物的基因组中是否含有mdlog基因启动子缺失片段；
37.(e2)根据(e1)结果，按照如下确定所述待测苹果属植物能否用作耐盐砧木：若待测苹果属植物的基因组中不含有mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)，则所述待测苹果属植物能或候选能用作耐盐砧木；若待测苹果属植物的基因组中含有mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)，则所述待测苹果属植物不能或候选不能用作耐盐砧木；
38.所述mdlog基因启动子缺失片段为seq id no.3所示dna片段。所述mdlog基因启动子缺失片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位。
39.在上述各方法中，检测所述待测苹果属植物的基因组中是否含有所述mdlog基因启动子缺失片段的方法可为如下(f1)或(f2)：
40.(f1)直接测序(即直接对所述待测苹果属植物的基因组进行测序)；
41.(f2)以所述待测苹果属植物的基因组为模板，用前文所述的引物对进行pcr扩增，根据扩增结果确定所述待测苹果属植物的基因组中是否含有所述mdlog基因启动子缺失片段。
42.如果扩增产物中含有所述mdlog基因启动子缺失片段，则所述待测苹果属植物的
基因组中含有所述mdlog基因启动子缺失片段；如果扩增产物中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段，则所述待测苹果属植物的基因组中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段。
43.当所述待测苹果属植物为杂合体时，若扩增产物经电泳后显示2条带，则所述待测苹果属植物的基因组中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)；若扩增产物经电泳后显示1条带，则所述待测苹果属植物的基因组中含有mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)。
44.当所述待测苹果属植物为纯合体时，无论所述待测苹果属植物的基因组中是否含有所述mdlog基因启动子缺失片段，扩增产物均为一条带。如果扩增产物为相对较小的一条带，则所述待测苹果属植物的基因组中不含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)；如果扩增产物为相对较大的一条带，则所述待测苹果属植物的基因组中含有所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)。
45.当然，不论所述待测苹果属植物是杂合体还是纯合体，均可在进行pcr扩增后，通过将扩增产物进行测序的方式获知所述待测苹果属植物的基因组中是否含有所述mdlog基因启动子缺失片段。
46.在上述各方面中，所述待测苹果属植物均可为耐盐性苹果属植物、非耐盐性苹果属植物，或者耐盐性苹果属植物和非耐盐性苹果属植物的杂交后代。
47.在本发明的具体实施方式中，所述待测苹果属植物具体为耐盐性苹果属植物八棱海棠和非耐盐性苹果属植物m9的杂交后代(如f1代)。
48.第四方面，本发明要求保护如下任一方法：
49.方法5：一种培育耐盐苹果属植物或者培育用作耐盐砧木苹果属植物的方法，包括如下步骤：培育基因组中不含有前文所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列缺失了所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的苹果属植物；
50.方法6：一种培育非耐盐苹果属植物或者培育用作非耐盐砧木苹果属植物的方法，包括如下步骤：培育基因组中含有前文所述mdlog基因启动子缺失片段(即基因组中mdlog基因启动子序列没有缺失所述“mdlog基因启动子缺失片段”)的苹果属植物。
51.第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
52.(g1)dna片段，如seq id no.3所示；
53.(g2)引物对，为权利要求4中所述引物对。
54.本发明的实验证明，本发明通过pcr检测八棱海棠、m9和二者之间的杂交后代mdlog基因启动子片段序列的分离情况，并结合各后代的耐盐性表型可以发现mdlog基因启动子片段(seq id no.3)的缺失现象与耐盐性正相关，缺失mdlog基因启动子片段(seq id no.3)增强其耐盐性。利用本发明mdlog基因启动子片段(seq id no.3)的缺失和存在可以快速的筛选后代中的耐盐性植株，在植物的耐盐性领域中具有重要意义。
附图说明
55.图1为mdlog基因在苹果基因组上的位置示意图。
56.图2为mdlog启动子插入或缺失片段序列比对。上为m9；下为八棱海棠。
57.图3为琼脂糖凝胶电泳分析苹果后代中mdlog基因启动子片段的分离情况。m为marker；其余泳道1-10为10株f1代。
具体实施方式
58.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
59.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
60.苹果砧木m9：在文献“余亮,王飞.苹果砧木m_9快繁技术的建立及试管苗生根进程解剖研究[j].西北林学院学报,2013,28(4):106-110.”和“yi feng et al.,natural variation in cytokinin maintenance improves salt tolerance in apple rootstocks.plant cell environ.2019；42:424
–
436.”中公开过，公众可从中国农业大学获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。
[0061]
苹果砧木八棱海棠：在文献“宗鹏鹏,曲艳华,柴朋,等.八棱海棠耐盐碱性评价[j].中国农业大学学报,2013,18(3):96-100.”和“yi feng et al.,natural variation in cytokinin maintenance improves salt tolerance in apple rootstocks.plant cell environ.2019；42:424
–
436.”中公开过，公众可从中国农业大学获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。
[0062]
实施例1、细胞分裂素激活酶基因mdlog启动子缺失序列的获得
[0063]
一、mdlog启动子序列分析
[0064]
在苹果基因组中对细胞分裂素合成激活酶基因mdlog基因进行搜索，发现在苹果基因组中mdlog基因位于第5号染色体上，如图1所示。图1表明，mdlog蛋白质的基因组序列的基本结构包括7个外显子和6个内含子，为了便于描述基因结构，下述实施例中将mdlog蛋白质的基因组序列中mdlog基因起始密码子atg中的a的位置记作为+1，-代表mdlog蛋白质的基因组序列中mdlog基因起始密码子atg的5’方向，+代表mdlog蛋白质的基因组序列中mdlog基因起始密码子atg的3’方向。
[0065]
二、苹果砧木mdlog基因启动子的扩增
[0066]
分别提取耐盐性苹果砧木(八棱海棠)和非耐盐性苹果砧木(m9)的基因组dna，以其为模板，以f1和r1为引物，进行pcr扩增，得到各个砧木的pcr扩增产物。
[0067]
f1：5
′‑
gacttaacccatccacgaca-3
′
，
[0068]
r1：5
′‑
cattttgttatcttccacacacc-3
′
。
[0069]
八棱海棠砧木的pcr扩增产物的核苷酸序列为seq id no.1，命名为片段1(为mdlog基因启动子一部分)，该片段由金冠苹果的基因组第5号染色体的第25,508,985至25,509,238位和第25,509,267至25,509,538位组成。
[0070]
m9砧木的pcr扩增产物核苷酸序列为seq id no.2，命名为片段2(为mdlog基因启动子一部分)，该片段为金冠苹果的基因组第5号染色体的第25,508,985至25,509,538位。
[0071]
将m9的扩增产物seq id no.2与八棱海棠的扩增产物seq id no.1进行比对，存在
差异的序列比对结果如图2所示，可以看出，八棱海棠的mdlog基因启动子即atg上游的-1305至-1278位置存在一段缺失片段5
’‑
gacttgcccgacgagacttgcccgacaa-3’(seq id no.3)，记作“mdlog基因启动子缺失片段”，其为金冠苹果的基因组第5号染色体的第25,509,239至25,509,266位。
[0072]
因此，上述seq id no.3所示的mdlog基因启动子缺失片段可能为苹果属植物耐盐性的标志物，该片段为苹果属植物基因组mdlog基因起始密码子atg中的a的上游方向第-1305位至第-1278位；以mdlog基因起始密码子atg中的a记作第+1位；该片段也是金冠苹果的基因组第5号染色体的第25,509,239至25,509,266位核苷酸(seq id no.3)。基因组中不含有seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的苹果属植物砧木的耐盐性高于基因组中含有seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子无片段缺失现象)的苹果属植物。
[0073]
实施例2、mdlog基因启动子缺失片段在检测苹果属植物砧木耐盐性中的应用一、mdlog基因启动子缺失片段检测
[0074]
1、杂交后代具有耐盐性差异植株的基因组dna获得
[0075]
以八棱海棠为母本，m9为父本进行杂交，得到f1代杂交后代。
[0076]
分别采集f1代杂交后代具有耐盐性差异植株10株(株号为1-10)f1代的叶片，提取基因组dna。
[0077]
2、mdlog基因启动子缺失片段检测
[0078]
设计并合成如下的引物：(以“mdlog基因启动子缺失片段”上游约150bp设计上游引物，在缺失片段下游设计下游引物)
[0079]
mdlog-f：5
′‑
acgcttgagcatggaatgga-3
′
(seq id no.4)；
[0080]
mdlog-r：5
′‑
agatatgtacattgtgtttgcgt-3
′
(seq id no.5)。
[0081]
以步骤1得到的各基因组dna为模板，以mdlog-f和mdlog-r为引物，进行pcr扩增，反应体系如表1所示，反应程序如表2所示，获得各pcr扩增产物。
[0082]
表1、pcr扩增体系(15μl)
[0083]
pcr反应组分每个体系加入量2.5
×
buffer v6.0μlmdlog-f和mdlog-r(各5μm)1.0μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.1μldna1.0μlddh2o补齐至15μl
[0084]
表2、pcr反应程序
id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”)；标记情况“1”表示mdlog基因启动子没有片段缺失现象(即基因组含有seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”)。同列标注不同小写字母的表示彼此之间在p《0.05水平上差异显著(duncan方法)。
[0093]
可以看出，基因组中不含有seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的苹果属植物砧木接穗后植株盐害指数数值均低于基因组中含有seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)的苹果属植物砧木接穗后植株。
[0094]
因此，seq id no.3所示的“mdlog基因启动子缺失片段”可以作为苹果属植物砧木耐盐性高低检测的标志物，可以应用于检测或辅助检测苹果属植物的砧木耐盐性高低、检测或辅助检测苹果属植物耐盐性状态(盐害指数高低)、检测或辅助检测待测苹果属植物是否为耐盐性植物，以及检测或辅助检测待测苹果属植物是否用作耐盐性砧木等方面。
[0095]
基因组中不含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的待测苹果属植物的砧木耐盐性高于基因组中含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)的待测苹果属植物。
[0096]
基因组中不含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的待测苹果属植物盐害指数低于基因组中含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)的待测苹果属植物。
[0097]
若待测苹果属植物的基因组中不含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)，则所述待测苹果属植物为或候选为耐盐性植物，或所述待测苹果属植物能够或候选能够用作耐盐性砧木；若待测苹果属植物的基因组中含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)，则所述待测苹果属植物不为或候选不为耐盐性植物，或所述待测苹果属植物不能或候选不能用作耐盐性砧木。
[0098]
基因组中不含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的苹果属植物的砧木耐盐性高于基因组中含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)的苹果属植物体现在如下：基因组中不含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子有片段缺失现象)的苹果属植物砧木接穗后植株的盐害指数低于基因组中含有“mdlog基因启动子缺失片段”(即mdlog基因启动子没有片段缺失现象)的苹果属植物砧木接穗后植株。
[0099]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。