识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒。


背景技术：

2.肝纤维化是肝炎长期慢性病变产生的病理反应，长期的肝纤维化进程会促进肝硬化，导致肝功能严重受损，并有进一步癌变的巨大风险；而长期的肾炎肾损伤也会诱导肾脏出现纤维化现象，导致肾器官缩小，肾功能逐渐丧失。尽管当前不少基因被发现具有阻碍肝肾器官纤维化进程的作用，但如何精确地在肝肾纤维化的病理细胞中高精度地表达这些纤维化抑制基因目前仍有待开发。同样，虽然现已发现stat3信号通路的激活是主要的肝肾纤维化驱动性因素，也发现mir-122、mir-145是区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号,mir-29、mir-200是区分正常肾细胞与纤维化病变肾细胞的关键分子信号。但是，目前尚无报道如何通过识别stat3信号激活来区分肝肾纤维化病变组织细胞与正常健康细胞。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是提供识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列、重组质粒、抑制病毒。
4.本发明提供一种识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，所述分子监测序列中，由5’端至3’端依次连接stat3增强子和特异性最短启动子；所述特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。
5.本发明还可以通过以下进一步技术方案实现：
6.进一步，所述stat3增强子的序列如seq id no.1所示。
7.进一步，所述肝特异性最短启动子的序列如seq id no.2所示；所述肾特异性最短启动子的序列如seq id no.3所示。
8.进一步，所述特异性最短启动子的3’端依次连接经过密码子优化的功能基因和细胞纤维化分子信号的互补靶向序列；所述功能基因受所述互补靶向序列的反向调控。
9.进一步，所述分子监测序列为识别肝细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接5’反向末端重复序列、所述stat3增强子、所述肝特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、poly(a)尾巴以及3’反向末端重复序列；
10.其中，所述互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列；
11.所述经过密码子优化的功能基因为mscarlet，sirt1或plau基因中的一种。
12.进一步，所述mir-122的互补靶向序列如seq id no.4所示；所述mir-145的互补靶向序列如seq id no.5所示。
13.进一步，所述分子监测序列为识别肾细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，
依次连接5’反向末端重复序列、所述stat3增强子、所述肾特异性最短启动子、所述经过密码子优化的功能基因、所述互补靶向序列、poly(a)尾巴以及3’反向末端重复序列；
14.所述互补靶向序列为mir-29和mir-200的互补靶向序列；
15.其中，所述经过密码子优化的基因为mscarlet、sirt1或plau基因中的一种。
16.进一步，所述mir-29的互补靶向序列如seq id no.6所示；所述mir-200的互补靶向序列如seq id no.7所示。
17.本发明提供一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的重组质粒，所述重组质粒包括上述的分子监测序列。
18.本发明提供一种用于识别和调控肝肾细胞纤维化的抑制病毒，所述抑制病毒含有如上述的重组质粒。
19.本发明的有益效果在于：
20.(1)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，能够智能精准识别肝肾细胞纤维化。通过人工合成的stat3增强子，并将该增强子与肝肾最短特异性启动子结合，确保了该监测序列只在指定器官中stat3转录因子激活的细胞亚群体产生活性，不仅可以特异性对这类病变细胞亚群产生报告效应，也可帮助测试潜在有治疗功能的基因元件，提高了肝肾细胞纤维化研究的效率。
21.(2)本发明的识别和调控肝细胞纤维化的分子监测序列，含有区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号mir-122和mir-145的互补靶向序列，可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达，实现对肝细胞纤维化的调控。
22.(3)本发明的识别和调控肾细胞纤维化的分子监测序列，含有区分正常代谢肝细胞与纤维化代谢不良病变肝细胞的关键分子信号mir-29和mir-200c的互补靶向序列，可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达，实现对肾细胞纤维化的调控。
23.(4)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，具有高效、精准的识别和调控效果。
24.(5)本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，可结合在质粒上，重组质粒以腺病毒为载体，组装为抑制病毒，该抑制病毒可以作为药物制剂得到广泛应用。
附图说明
25.图1为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的mscarlet基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
26.图2为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的sirt1基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
27.图3为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例1中制备的含有优化的plau基因的肝细胞纤维化分子监测序列；
28.图4为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中制备的含有优化的sirt1基因的肾细胞纤维化分子监测序列；
29.图5为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中制备的含有优化的plau基因的肾细胞纤维化分子监测序列；
30.图6为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例2中，红色荧
光阳性组和红色荧光阴性组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量；
31.图7为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例2中，肝纤维化模型+msirt1组，肝纤维化模型+mplau组，肝纤维化模型+msirt1/mplau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量；
32.图8为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例3中，肝纤维化模型+msirt1组，肝纤维化模型+mplau组，肝纤维化模型+msirt1/mplau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量；
33.图9为本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，实施例4中，肾纤维化模型+msirt1组，肾纤维化模型+mplau组，肾纤维化模型+msirt1/mplau组，肾纤维化模型组，空质粒阴性对照组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量。
具体实施方式
34.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
35.本发明的识别和调控肝肾细胞纤维化的分子监测序列，含有能够特异性识别stat3转录因子的stat3增强子和特异性最短启动子；特异性最短启动子为肝特异性最短启动子或肾特异性最短启动子。
36.本发明的上述分子监测序列，能够智能精准识别肝肾细胞纤维化。通过人工合成的stat3增强子，并将该增强子与肝肾最短特异性启动子结合，确保了该监测序列只在指定器官中stat3转录因子激活的细胞亚群体产生活性，不仅可以特异性对这类病变细胞亚群产生报告效应，也可帮助测试潜在有治疗功能的基因元件，提高了肝肾细胞纤维化研究的效率。
37.上述stat3增强子与最短特异性启动子连接方式为串联，并且最短特异性启动子连接在stat3增强子的3’端。
38.优选的，stat3增强子的序列如seq id no.1所示：
39.5'gttctgccattgacttctgccatttcgcttctgggattgaccttctgccattctacttctgccaattctcttctgccatttgccttctgccattgtacttctgccatt 3'。
40.优选的，肝特异性最短启动子的序列如seq id no.2所示：
41.5'cggcaaacattgcaagcagcccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctccatttaacttggttaatattcaccggccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgctggcaattaacatctcctcagcttcaggtgagaatc3'。
42.肾特异性最短启动子的序列如seq id no.3所示：
43.5'agcctcacctcacatgctcctgacccatggggcctcaccatcctgcccagggccctgcagagactgaggggcctctgcccatccctgggtgtaggtgactcatgcacaggagcacaaggtgctcacacatgagcagaagatggggactcacaaggttttgccttcccatagcaaagatgacatccaggaaaacacagagatgacaccctcaaagacacccctccttgaccatcacctgcatagagttcacccatccagggtctgtagctggtgggctctggatgcccacaaaaatgacccactttgctgtggccccaagctctcaccaatagcccatatgatgtcttcatgtccttccctgcaggggacc
tcagtcttgtccttcaagcccagaccctttctatgtggcaggagatggggaagggatgaaaaagcaggtgtgtgcacactcacacacacacatgcacacatagacactgagacacagacataccaatccc3'。
44.优选的，分子监测序列为识别肝细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接stat3增强子、肝特异性最短启动子、功能基因以及互补靶向序列；互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列，两者的顺序可以任意设置。
45.进一步优选的，功能基因经过密码子优化。具体而言，序列如下：
46.经过密码子优化的mscarlet基因序列如seq id no.10所示：
47.gtgagcaagggcgaggccgtgatcaaggagttcatgagattcaaggtgcacatggaaggaagcatgaatggccacgagttcgagatcgagggagaaggcgagggcagaccttacgaaggcacccaaacagccaagctcaaggtgacaaagggcggccctctgccttttagctgggacatcctgagcccccagtttatgtacggctctagagccttcaccaagcaccccgctgacatccctgactactacaagcaaagctttcccgaaggatttaagtgggaacgggtgatgaacttcgaggatggaggagccgtgacagtgacccaggacacatcgctggaagacggaaccctgatctacaaggtgaagctgagaggcaccaacttccctccagacggccctgtgatgcagaaaaaaaccatgggctgggaggccagcactgagagactgtatcctgaggacggcgtgctgaagggcgatatcaagatggccctgagactgaaggacggtggaagatacctggccgactttaagaccacctacaaagccaagaagccagtgcagatgcctggcgcctacaacgtggacagaaagctcgatatcacgagccacaacgaagattacaccgtcgtggaacagtacgagcggagcgaaggcagacacagcacaggcggcatggacgagctgtacaagtga。
48.经过密码子优化的sirt1基因序列如seq id no.11所示：
49.atggccgatgaggccgccctcgccctacagcctggaggcagcccgagcgccgccggtgctgacagagaagccgccagctcacctgccggagagcctctgcgcaagcggccacgcagagatggccccggcctggagcggagccccggggagcctggcggtgccgctcctgagagagaggtgcctgccgccgctagaggttgtcctggagccgccgccgctgccctgtggagagaggccgaggctgaagctgccgccgccggcggcgagcaggaggcccaggccaccgcagctgccggcgaaggcgataatggccctggactgcagggcccttctagagagccccccctggcagacaatctgtatgacgaagacgacgatgatgaaggggaggaagaagaagaagccgccgccgctgccatcggctacagagacaacctgctctttggcgatgagatcattacaaacggcttccacagctgtgaaagcgacgaagaggatagggccagccacgccagctcttctgactggacccctcgtccaagaatcggaccatacacattcgtgcagcagcacctgatgatcggcaccgaccctagaacaatcctgaaggacttactgcctgaaacaatccctcctcctgaactggacgacatgaccctgtggcagatcgtgataaacatcctgagcgagcctcctaagcggaaaaagagaaaagacatcaacaccatcgaggacgcggtgaaactgctgcaggagtgcaaaaaaatcatcgtgctgacaggagccggcgtgtccgtgtcttgtggcatccccgacttcagaagcagagacggaatctatgccagactggctgtggacttccctgacctgcccgacccccaagcaatgttcgatatcgaatacttccggaaggaccctcggcctttcttcaaattcgccaaggaaatctaccccggccagttccagcctagcctgtgtcataagttcatcgccctgtccgataaggaagggaagctgcttagaaattacacccagaacatcgacaccctggaacaagtggccggcattcagagaatcattcaatgccatggctcttttgctaccgcttcttgtctgatctgcaagtacaaggtggactgcgaggccgtgcggggcgatatcttcaaccaggtggtccctaggtgcccccgctgccctgccgacgagcctctggccatcatgaaacctgagatcgtcttcttcggcgagaacctgcccgagcagttccaccgggccatgaaatatgacaaggatgaagtggacctgctgatcgtgatcggctctagcctgaaagtgcggcccgttgctctgatcccctccagcatcccgcacgaggttccacagatcctgatcaaccgggagcctctgccacacctgcacttcgacgttgagctgctgggcgattgcgacgtgatcattaacgagctgtgccacagactgggcggcgagtacgccaagctgtgctgcaaccccgtgaagctgagcgaaatcacagagaagcctcctcggacccagaaggagctggcttatctgagcgaactgccaccca
cccccctgcacgtgagcgaggacagctcttctcctgaaagaaccagccctcccgattcttccgtgatcgtgaccctgctggaccaggccgccaaaagtaacgacgacctggacgttagcgaatctaagggctgcatggaagaaaagccccaggaggtgcagaccagcagaaacgtggagagcatcgccgagcagatggaaaatcccgacctgaagaacgtgggctctagcaccggcgaaaagaacgagcggacaagcgtggctggcaccgtcagaaaatgttggcctaaccgggtggccaaggaacagatcagcagacggctggatggcaaccaatacctgttcctgcctcctaatcggtacatcttccacggcgccgaggtctacagcgatagcgaggacgatgtgctgtcttccagctcctgcggcagcaatagcgactccggaacctgccagagccctagcctggaagagcctatggaggatgagtccgagattgaggagttctacaacggcctggaggacgagcctgacgtgcctgagagagccggcggcgcgggctttggcacagatggcgatgaccaggaagctatcaatgaggccatcagcgtgaagcaggaggtgaccgacatgaactacccctcaaacaagtcctga。
50.经过密码子优化的plau基因序列如seq id no.12所示：
51.atggtgttccacctgagaaccagatacgagcaggccaactgcgactgcctgaacggcggcacctgcgtgtccaacaagtacttcagcaacatccactggtgcaactgtcctaagaagtttggaggccagcattgcgagatcgacaagagcaagacctgctacgaaggcaacggtcatttctacagaggcaaggcctccaccgacaccatgggccggccctgcctgccctggaacagcgccacagtgctgcaacaaacataccacgcccacagaagcgacgccctgcaactgggcctcggcaagcacaactactgcagaaaccctgacaacagaagaagaccctggtgctacgtgcaggtgggcctcaaattgctggtccaggaatgcatggtccacgactgtgccgatggaaagaagcccagctctcctccagaagaactgaaattccagtgtggacagaaaaccctgcggcctagattcaagatcatcggcggcgaatttacgaccatcgagaaccagccttggttcgccgctatctaccggcggcaccggggcggcagcgtgacatacgtttgtggcggaagcctgatcagcccttgctgggtcatcagcgccacacactgcttcatcgattacccaaagaaggaggactatatcgtgtacctcggccgcagcagactgaacagcaatacccagggcgagatgaagtttgaggtggaaaacctgatcctgcacaaagactacagcgctgataccctggcccaccacaacgacatcgccctgctgaagatcagatctaaggaaggccggtgcgcccagccaagtagaacaatccagaccatctgcctgcccagcatgtacaacgacccccagttcggcaccagctgtgaaatcaccggattcggcaaggaaaacagcacagactacctgtaccctgagcagctgaagatgaccgtggtgaagctgatctctcaccgcgagtgccagcagccgcactattacggctcggaggtgaccacaaagatgctgtgcgctgccgatcctcagtggaagacagattcttgtcagggcgacagcggcggccctctggtgtgcagcctgcagggaagaatgacactgaccggtatcgtgtcttggggcagaggttgtgccctgaaggacaaacctggagtgtacacccgggtgtcccacttcctgccttggatcagaagccacaccaaggaagaaaatggactggcactgtga。
52.经过密码子优化的功能基因为mscarlet，sirt1或plau基因中的一种。
53.mir-122和mir-145的互补靶向序列可以反向调控经过密码子优化的功能基因的基因表达。密码子优化是指人源密码子优化。
54.优选的，mir-122的互补靶向序列如seq id no.4所示:：
55.seq id no.4：5’tatttagtgtgataatggcgtt 3’。
56.mir-145的互补靶向序列如seq id no.5所示：
57.seq id no.5：5’agggattcctgggaaaactggac 3’。
58.在上述识别肝细胞纤维化的分子监测序列中，当功能基因为mscarlet、该监测序列主要用于监测细胞是否纤维化，当功能基因为sirt1或plau基因时，该监测序列可以对纤维化的肝细胞进行调节，降低其中α平滑肌蛋白的表达量，改善肝细胞的纤维化情况。
59.优选的，分子监测序列为识别肾细胞纤维化的分子监测序列，由5’端至3’端，依次连接所述stat3增强子、所述肾特异性最短启动子、经过密码子优化的功能基因以互补靶向
序列；互补靶向序列为mir-29和mir-200的互补靶向序列，两者的顺序可任意设置；经过密码子优化的基因为mscarlet、sirt1或plau基因中的一种。
60.优选的，mir-29的互补靶向序列如seq id no.6所示：
61.seq id no.6：5’ctgaacaccaaaagaaatcagt 3’。
62.mir-200的互补靶向序列如seq id no.7所示：
63.seq id no.7：5’tccatcattacccggcagtatta 3’。
64.本发明的用于智能精准识别和调控肝肾细胞纤维化的重组质粒，包括上述的分子监测序列。
65.本发明的用于智能精准识别和调控肝肾细胞纤维化的抑制病毒，含有上述的重组质粒。
66.优选的，本发明的抑制病毒的病毒载体可以为aav腺相关病毒或腺病毒ad5。
67.本发明的用于智能精准识别肝肾细胞纤维化的试剂，包括上述的抑制病毒的病毒液。
68.本发明的上述试剂可以用于制备抑制肝肾细胞纤维化的药物。
69.以下通过具体的实施例对本发明的效果进行举例说明：
70.实施例1
71.本实施例通过基因合成得到识别肝细胞纤维化的分子监测序列，并将该监测序列通过生物工程方法构建含有上述分子监测序列的质粒载体、含有该质粒载体的aav腺相关病毒。
72.如图1～3所示，本实施例的分子监测序列中，由5’端至3’端依次连接有aav腺相关病毒5’反向末端重复序列、stat3增强子、肝特异性最短启动子、经过密码子优化的功能基因、互补靶向序列、poly(a)尾巴以及aav腺相关病毒3’反向末端重复序列。
73.互补靶向序列为mir-122和mir-145的互补靶向序列；经过密码子优化的功能基因为mscarlet，sirt1或plau基因中的一种。
74.上述序列中，两端的反向末端重复序列可以使该序列连接在以avv腺相关病毒为载体的质粒上。本实施例采用的病毒为aav9病毒。
75.mscarlet、sirt1或plau基因受表达3
×
mir-122/mir-145联合靶点序列的反向调控，通过aav9病毒包装纯化工艺，使得包含肝细胞纤维化分子监测系统的aav病毒滴度达到1e13。
76.本实施例含有上述分子监测序列的aav腺相关病毒包装完整流程如下：
77.(1)基因克隆：采用引物对经过基因合成的分子监测序列进行扩增，并通过gibson法安装到aav载体骨架上。其中，引物为：
78.itr-f:5’ctccatcactaggggttccttctagacgggagctaggctagccttctggg3’(seq id no.8)；
79.itr-r:5’ggttcctgcggccctccccagcatgcgagccagacatgataagatacat3’(seq id no.9)。
80.扩增体系如表1所示：
81.表1扩增体系
82.成分50μl反应体系
5x q5 pcr反应缓冲液10μl10mm dntps1μl10μm itr-f正向引物2.5μl10μm itr-r负向引物2.5μldna模板10ngq5高保真dna聚合酶0.5μl5x q5高gc反应液10μl超纯水to 50μl
83.扩增程序如表2所示：
84.表2扩增程序
[0085][0086]
gibson片段连接反应体系如表3所示：
[0087]
表3 gibson片段连接反应体系
[0088][0089]
gibson片段连接反应温度为50℃，反应时间15分钟。
[0090]
完成后，得到含有分子监测序列的重组质粒。
[0091]
(2)病毒包装：将含有分子监测序列的重组质粒与辅助质粒adhelper vector和paav-rep/cap vector共转染进入hek293t细胞，感染72h之后即包装完毕。
[0092]
(3)收毒：反复冻融3次破碎上述细胞，分别收获培养基上清与细胞沉淀，peg8000沉淀培养基上清中的病毒，培养基上清先用0.45μm滤膜过滤。
[0093]
(4)纯化浓缩：通过碘克沙醇法对病毒进行纯化，一方面提高病毒滴度，另一方面，某些动物实验需要纯化之后才可进行。纯化完成后，再将收集到的病毒液置于超滤管中超高速离心进行浓缩。
[0094]
(5)滴度和特异性检测：首先通过qpcr的方法来检测病毒滴度，利用pcr的方法进行病毒特异性检测，最后用银染方法核实病毒纯度。
[0095]
本实施例中，图1的分子监测序列的核苷酸序列如seq id no.13所示：
[0096]
gacggatcgggagctagcgttctgccattgacttctgccatttcgcttctgggattgaccttctgccattctacttctgccaattctcttctgccatttgccttctgccattgtacttctgccattcggcaaacattgcaagca
gcccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctccatttaacttggttaatattcaccggccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgctggcaattaacatctcctcagcttcaggtgagaatccttaaggtcgaccgccgccaccgtgagcaagggcgaggccgtgatcaaggagttcatgagattcaaggtgcacatggaaggaagcatgaatggccacgagttcgagatcgagggagaaggcgagggcagaccttacgaaggcacccaaacagccaagctcaaggtgacaaagggcggccctctgccttttagctgggacatcctgagcccccagtttatgtacggctctagagccttcaccaagcaccccgctgacatccctgactactacaagcaaagctttcccgaaggatttaagtgggaacgggtgatgaacttcgaggatggaggagccgtgacagtgacccaggacacatcgctggaagacggaaccctgatctacaaggtgaagctgagaggcaccaacttccctccagacggccctgtgatgcagaaaaaaaccatgggctgggaggccagcactgagagactgtatcctgaggacggcgtgctgaagggcgatatcaagatggccctgagactgaaggacggtggaagatacctggccgactttaagaccacctacaaagccaagaagccagtgcagatgcctggcgcctacaacgtggacagaaagctcgatatcacgagccacaacgaagattacaccgtcgtggaacagtacgagcggagcgaaggcagacacagcacaggcggcatggacgagctgtacaagtgatcgagcggccgccaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccaagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacgcggccgcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatc
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[0097]
本实施例中，图2的分子监测序列的核苷酸序列如seq id no.14所示：
[0098]
gacggatcgggagctagcgttctgccattgacttctgccatttcgcttctgggattgaccttctgccattctacttctgccaattctcttctgccatttgccttctgccattgtacttctgccattcggcaaacattgcaagcagcccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctccatttaacttggttaatattcaccggccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgctggcaattaacatctcctcagcttcaggtgagaatccttaaggtcgaccgccgccaccatggccgatgaggccgccctcgccctacagcctggaggcagcccgagcgccgccggtgctgacagagaagccgccagctcacctgccggagagcctctgcgcaagcggccacgcagagatggccccggcctggagcggagccccggggagcctggcggtgccgctcctgagagagaggtgcctgccgccgcta
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[0099]
本实施例中，图3的分子监测序列的核苷酸序列如seq id no.15所示：
[0100]
gacggatcgggagctagcgttctgccattgacttctgccatttcgcttctgggattgaccttctgccattctacttctgccaattctcttctgccatttgccttctgccattgtacttctgccattcggcaaacattgcaagcagcccctccctgcctgctgaccttggagctggggcagaggtcagagacctctctgggcccatgccacctccaacatccactcgaccccttggaatttcggtggagaggagcagaggttgtcctggcgtggtttaggtagtgtgtggacacaggacgctgtggtttctgagccagggggcgactcagatcccagccagtggacttagcccctgtttgctccatttaacttggttaatattcaccggccagcagcctcccccgttgcccctctggatccactgctggcaattaacatctcctcagcttcaggtgagaatccttaaggtcgaccgccgccaccatggtgttccacctgagaaccagatacgagcaggccaactgcgactgcctgaacggcggcacctgcgtgtccaacaagtacttcagcaacatccactggtgcaactgtcctaagaagtttggaggccagcattgcgagatcgacaagagcaagacctgctacgaaggcaacggtcatttctacagaggcaaggcctccaccgacaccatgggccggccctgcctgccctggaacagcgccacagtgctgcaacaaacataccacgcccacagaagcgacgccctgcaactgggcctcggcaagcacaactactgcagaaaccctgacaacagaagaagaccctggtgctacgtgcaggtgggcctcaaattgctggtccaggaatgcatggtccacgactgtgccgatggaaagaagcccagctctcctccagaagaactgaaattccagtgtggacagaaaaccctgcggcctagattcaagatcatcggcggcgaatttacgaccatcgagaaccagccttggttcgccgctatctaccggcggcaccggggcggcagcgtgacatacgtttgtggcggaagcctgatcagcccttgctgggtcatcagcgccacacactgcttcatcgattacccaaagaaggaggactatatcgtgtacctcggccgcagcagactgaacagcaatacccagggcgagatgaagtttgaggtggaaaacctgatcctgcacaaagactacagcgctgataccctggcccaccacaacgacatcgccctgctgaagatcagatctaaggaaggccggtgcgcccagccaagtagaacaatccagaccatctgcctgcccagcatgtacaacgacccccagttcggcaccagctgtgaaatcaccggattcggcaaggaaaacagcacagactacctgtaccctgagcagctgaagatgaccgtggtgaagctgatctctcaccgcgagtgccagcagccgcactattacggctcggaggtgaccacaaagatgctgtgcgctgccgatcctcagtggaagacagattcttgtcagggcgacagcggcggccctctggtgtgcagcctgcagggaagaatgacactgaccggtatcgtgtcttggggcagaggttgtgccctgaaggacaaacctggagtgtacacccgggtgtcccacttcctgccttggatcagaagccacaccaaggaagaaaatggactggcactgtgatcgagcggccgccaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccacaaacaccattgtcacactccaagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacagggattcctgggaaaactggacgcggccgcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaatt
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[0101]
实施例2
[0102]
采用实施例1制备的抑制病毒对人肝星状细胞进行感染，验证其对纤维化肝细胞的监测和调控效果。
[0103]
本实施例采用的人肝星状细胞购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。
[0104]
α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)是肝星状细胞(hsc)活化的标志，α-平滑肌肌动蛋白的表达量越大，说明活化的肝星状细胞(hsc)越多，而肝星状细胞(hsc)的活化与肝细胞纤维化有重要的关系。因此，监测α-平滑肌肌动蛋白的表达可以实现对肝细胞纤维化的监测。
[0105]
在本实施例中，向肝星状细胞添加10ng/ml的细胞因子tgfb1和10ng/ml pdgfb，并在培养基dmem/f12+15％胎牛血清+非必需氨基酸的培养条件下处理14天，诱导其发生细胞纤维化转变。
[0106]
使用如图1所示的带有红色荧光蛋白mscarlet的aav肝细胞纤维化监测病毒，对人肝星状细胞进行病毒感染，3天后，通过流式细胞术对红色荧光蛋白阳性的细胞及红色荧光蛋白阴性的细胞进行区分。各组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量如表4和图6所示：
[0107]
表4各组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量
[0108] 红色荧光阳性组红色荧光阴性组no.12.651no.23.081no.32.911平均值2.881标准差0.1768238290
[0109]
通过实验数据可以看出，本实施例的肝细胞纤维化分子监测病毒对于阳性纤维化肝细胞与阴性纤维化肝细胞的相对表达量具有显著性差异。数据经非配对双尾student’s t检验,p value《0.01则标记**。
[0110]
另取上述的肝星状细胞，添加10ng/ml的细胞因子tgfb1和10ng/ml的细胞因子pdgfb，并在培养基dmem/f12+15％胎牛血清+非必需氨基酸的培养条件下处理14天，诱导其发生细胞纤维化转变。
[0111]
使用如图2和3所示的具有hsirt1、hplau表达功能的aav肝细胞纤维化监测病毒进行病毒感染，并与未感染aav肝细胞纤维化监测病毒的纤维化肝星状细胞及未感染aav肝细胞纤维化监测系统的野生型肝星状细胞进行
ɑ
平滑肌纤维蛋白(
ɑ-smooth muscle actin)的表达量比较。
[0112]
其中，hsirt1、hplau是指人源sirt1和plau基因。
[0113]
上述实验分为5组，分别为肝纤维化模型+hsirt1组，肝纤维化模型+hplau组，肝纤维化模型+hsirt1/hplau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组，每组进行10次平行实验。
各组实验结果如表5和图7所示。数据经非配对双尾student’s t检验,同肝纤维化模型组相比p value《0.01则标记**。
[0114]
表5各组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量
[0115][0116]
通过实验结果可以看出，肝纤维化模型+hsirt1/hplau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肝细胞纤维化调控效果。
[0117]
实施例3
[0118]
本实施例通过动物试验验证本发明的分子监测序列在体内的监测效果。
[0119]
使用酶切及gibson连接技术，将人源stat3可识别合成增强子及人源肝特异性合成启动子替换为鼠源stat3可识别合成增强子及鼠源肝特异性合成启动子，并将sirt1及plau进行鼠源密码子优化，得到msirt1及mplau。
[0120]
本实施例设置5组实验对照组，分别为肝纤维化模型+msirt1组，肝纤维化模型+mplau组，肝纤维化模型+msirt1/mplau组，肝纤维化模型组，空质粒阴性对照组。
[0121]
本实施例采用40只c57bl/6j小鼠，通过6周，每周两次腹腔注射四氯化碳构建肝纤维化小鼠模型。构建成功后，尾静脉注射aav9包装的肝细胞纤维化分子监测系统，21天后，取各组小鼠的肝组织，检测其中
ɑ
平滑肌纤维蛋白(
ɑ-smooth muscle actin)的表达，并比较各组间差异，smaα蛋白相对表达量如表6和图8所示。数据经非配对双尾student’s t检验,同肝纤维化模型组相比p value《0.01则标记**。
[0122]
通过实验结果可以看出，肝纤维化模型+msirt1/mplau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肝细胞纤维化调控效果。
[0123]
表6各组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量
[0124][0125]
实施例4
[0126]
本实施例通过生物工程方法构建肾细胞纤维化分子监测序列及含有该序列的抑制病毒，并通过动物试验验证其在体内的监测效果。具体步骤为：
[0127]
通过基因合成构建基如图4～5所示的aav骨架载体用于通过可识别stat3蛋白的合成增强子及肾特异性最短合成启动子表达经过密码子优化的sirt1或plau基因，且sirt1或plau基因受3
×
mir-29/mir-200联合靶点序列的反向调控，通过aav8病毒包装纯化工艺，使得包含肾纤维化细胞分子监测系统的aav病毒滴度达到1e13。
[0128]
本实施例使用酶切及gibson连接技术，将人源stat3可识别合成增强子及人源肾特异性合成启动子替换为鼠源stat3可识别合成增强子及鼠源肾特异性合成启动子，并将sirt1及plau进行鼠源密码子优化，并设置5组实验对照组，分别为肾纤维化模型+msirt1组，肾纤维化模型+mplau组，肾纤维化模型+msirt1/mplau组，肾纤维化模型组，空质粒阴性对照组。
[0129]
本实施例采用40只c57bl/6j小鼠，通过单侧输尿管梗阻技术构建肾纤维化小鼠模型。构建成功后，尾静脉注射aav8包装的肾纤维化分子监测系统，21天后，取各组小鼠的肾组织，检测其中
ɑ
平滑肌纤维蛋白(
ɑ-smooth muscle actin)的表达，并比较各组间差异。结果如表7和图9所示。数据经非配对双尾student’s t检验,同肾纤维化模型组相比p value《0.01则标记**。
[0130]
表7各组的
ɑ
平滑肌纤维蛋白(smaα蛋白)相对表达量
[0131][0132][0133]
通过实验结果可以看出，肾纤维化模型+msirt1/mplau组的α平滑肌纤维蛋白表达量显著的低于其他实验组，说明该组具有显著的肾细胞纤维化调控效果。
[0134]
本实施例中，图4的分子监测序列的核苷酸序列如seq id no.16所示：
[0135]
gacggatcgggagctagcttcgaattccgatagatacctggaatccgtaccagcttggaccgaatgaagcggtttcctccaagttacagccataggaaatcctcaggaaggtaagcctcacctcacatgctcctgacccatggggcctcaccatcctgcccagggccctgcagagactgaggggcctctgcccatccctgggtgtaggtgactcatgcacaggagcacaaggtgctcacacatgagcagaagatggggactcacaaggttttgccttcccatagcaaagatgacatccaggaaaacacagagatgacaccctcaaagacacccctccttgaccatcacctgcatagagttcacccatccagggtctgtagctggtgggctctggatgcccacaaaaatgacccactttgctgtggccccaagctctcaccaatagcccatatgatgtcttcatgtccttccctgcaggggacctcagtcttgtccttcaagcccagaccctttctatgtggcaggagatggggaagggatgaaaaagcaggtgtgtgcacactcacacacacacatgcacacatagacactgagacacagacataccaatccccttaaggtcgaccgccgccaccatggcggacgaggtggcgctcgcccttcaggccgccggctccccttccgcggcggccgccatggaggccgcgtcgcagccggcggacgagccgctccgcaagaggccccgccgagacgggcctggcctcgggcgcagcccgggcgagccgagcgcagcagtggcgccggcggccgcggggtgtgaggcggcgagcgccgcggccccggcggcgctgtggcgggaggcggcaggggcggcggcgagcgcggagcgggaggccccggcgacggccgtggccggggacggagacaatgggtccggcctgcggcgggagccgagggcggctgacgacttcgacgacgacgagggcgaggaggaggacgaggcggcggcggcagcggcggcggcagcgatcggctaccgagacaacctcctgttgaccgatggactcctcactaatggctttcattcctgtgaaagtgatgacgatgacagaacgtcacacgccagctctagtgactggactccgcggccgcggataggtccatatacttttgttcagcaacatctcatgattggcaccgatcctcgaacaattcttaaagatttattaccagaaacaattcctccacctgagctggatgatatgacgctgtggcagattgttattaatatcctttcagaaccaccaaagcggaaaaaaagaaaagatatcaatacaattgaagatgctgtgaagttactgcaggagtgtaaaaagataatagttctgactggagctggggtttctgtctcctgtgggattcctgacttcagatcaagagacggtatctatgctcgccttgcggtggacttcccagacctcccagaccctcaagccatgtttgatattgagtattttagaaaagacccaagaccattcttcaagtttgcaaaggaaatatatcccggacagttccagccgtctctgtgtcacaaattcatagctttgtcagataaggaaggaaaactacttcgaaattatactcaaaatatagataccttggag
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gctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc。
[0136]
本实施例中，图5的分子监测序列的核苷酸序列如seq id no.17所示：
[0137]
gacggatcgggagctagcttcgaattccgatagatacctggaatccgtaccagcttggaccgaatgaagcggtttcctccaagttacagccataggaaatcctcaggaaggtaagcctcacctcacatgctcctgacccatggggcctcaccatcctgcccagggccctgcagagactgaggggcctctgcccatccctgggtgtaggtgactcatgcacaggagcacaaggtgctcacacatgagcagaagatggggactcacaaggttttgccttcccatagcaaagatgacatccaggaaaacacagagatgacaccctcaaagacacccctccttgaccatcacctgcatagagttcacccatccagggtctgtagctggtgggctctggatgcccacaaaaatgacccactttgctgtggccccaagctctcaccaatagcccatatgatgtcttcatgtccttccctgcaggggacctcagtcttgtccttcaagcccagaccctttctatgtggcag
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[0138]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。