na2so4、2-6g/l mgso4、0.1-1g/l kcl、1-5g/l (nh4)2so4、4-10g/l nacl、0.01-0.2g/l cacl2、15-25g/l谷氨酸钠、1-5g/l酵母膏和0.5-2.5g/l玉米浆干粉。
10.优选地，所述种子培养和所述发酵培养的条件包括：初始ph为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-35℃。
11.本发明第二方面提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将裂殖壶菌采用上述第一方面所述的方法进行发酵得发酵液，将所述发酵液进行破壁、提取。
12.优选地，采用破壁酶酶解方法进行破壁。
13.进一步优选地，破壁的条件包括：所述破壁酶的用量为2-4g/l，ph为10-12，转速为150-200rpm，温度为25-35℃，时间为3-6h。
14.优选地，提取采用的溶剂为正己烷和/或乙醇。
15.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：本发明克服了微生物发酵过程中添加喹恶啉及其衍生物会导致脂肪酸生物合成受阻而生长缓慢甚至死亡的技术偏见，将n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸用于裂殖壶菌的发酵，且能够有效提高裂殖壶菌的dha产量和生物量，从而有效提高制得的微生物油脂中的dha含量。
具体实施方式
16.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
17.本发明一方面提供一种提高裂殖壶菌的dha产量的方法，该方法包括：将裂殖壶菌接种至种子培养基中进行种子培养后得到种子液，将所述种子液以体积比0.5-10%接种至添加有辅助因子的发酵培养基中进行发酵培养；所述辅助因子为n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸，相对于1l的所述发酵培养基，所述辅助因子的添加量为10-200μmol。
18.本发明的发明人在研究过程中发现，将裂殖壶菌接入含有n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸的培养基中进行发酵，n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸能够促进裂殖壶菌对培养基中营养物质的吸收，进而提高培养基中养分的利用率，而且能够提高裂殖壶菌生产的油脂中的dha的含量。
19.从更进一步提高裂殖壶菌生产的油脂中的dha的含量来考虑，更优选地，所述喹恶啉衍生物为n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和3-甲基-喹恶啉-2-羧酸。所述n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和3-甲基-喹恶啉-2-羧酸的质量比为1：0.5-2。
20.具体地，相对于1l的所述培养基，所述辅助因子的添加量为10-200μmol。相对于1l的所述培养基，所述辅助因子的添加量具体可以为10μmol、50μmol、100μmol、150μmol、200μmol或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。从更进一步提高裂殖壶菌生产的油脂中的dha含量来考虑，优选地，相对于1l的所述培养基，所述辅助因子的添加量为50-200μmol。
21.所述种子培养基和所述发酵培养基的碳源、氮源、金属离子、盐、微量元素等可以
是任意能够用于生物发酵的碳源、氮源、金属离子、盐、微量元素等。为了能够进一步提高裂殖壶菌生产的油脂中的dna含量，优选地，所述种子培养基含有：40-80g/l葡萄糖、1-5g/l kh2po4、25-45g/l na2so4、2-6g/l mgso4、0.5-2g/l kcl、2-8g/l (nh4)2so4、15-25g/l谷氨酸钠和2-8g/l酵母粉。所述发酵培养基含有：60-100g/l葡萄糖、1-5g/l kh2po4、4-12g/l na2so4、2-6g/l mgso4、0.1-1g/l kcl、1-5g/l (nh4)2so4、4-10g/l nacl、0.01-0.2g/l cacl2、15-25g/l谷氨酸钠、1-5g/l酵母膏和0.5-2.5g/l玉米浆干粉。其中，种子培养基的接种量一般为0.5-2体积%，若以甘油管保藏的微生物菌种进行接种，则每个甘油管内的菌种接种至100ml的种子培养基中。
22.优选地，所述种子培养和所述发酵培养的条件包括：初始ph为5.5-7，转速为150-200rpm，温度为25-35℃。研究发现在上述条件进行种子培养和发酵培养能够进一步提高裂殖壶菌生产的油脂中的dha含量。
23.本发明第二方面提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将裂殖壶菌采用上述第一方面所述的方法进行发酵得发酵液，将所述发酵液进行破壁、提取。
24.本发明人的发明人在研究过程中发现才有上述方法制备得到的微生物油脂中dha的含量较高。
25.根据本发明，微生物的细胞破壁可以采用本领域常规的方式，优选地，采用破壁酶酶解方法进行所述破壁，以能够提高破壁效率，减小对微生物细胞中代谢产物的破坏。
26.根据本发明，优选地，所述破壁步骤的条件包括：所述破壁酶的用量为2-4g/l，具体可以为2g/l、3g/l、4g/l，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；ph为10-12，具体可以为10、11、12，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；转速为150-200rpm，具体可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；温度为25-35℃，具体可以为25℃、30℃、35℃，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值；时间为3-6h，具体可以为3h、4h、5h、6h，或上述任意两个数值所构成的范围中的任意值。
27.根据本发明，为了提高对微生物油脂的提取效率，优选地，所述提取步骤采用的溶剂为正己烷和/或乙醇，优选为正己烷和乙醇，以利用乙醇破碎微生物细胞的同时，利用正己烷萃取油脂。所提取的油脂中含有油酸、棕榈酸、亚油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等多不饱和脂肪酸。
28.根据本发明一种特别优选的实施方式，提供一种微生物油脂的制备方法，该方法包括：将所述裂殖壶菌接种至种子培养基中在初始ph为5.5-7、转速为150-200rpm、温度为25-35℃的条件下进行种子培养后得到种子液，将所述种子液以体积比0.5-10%接种至发酵培养基中在初始ph为5.5-7、转速为150-200rpm、温度为25-35℃的条件下进行发酵培养，将破壁酶以2-4g/l的添加量加入发酵液中，在ph为10-12、转速为150-200rpm、温度为25-35℃的条件下酶解3-6h得到破壁液，将破壁液与乙醇、正己烷以体积比1:1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂。
29.所述种子培养基含有：40-80g/l葡萄糖、1-5g/l kh2po4、25-45g/l na2so4、2-6g/l mgso4、0.5-2g/l kcl、2-8g/l (nh4)2so4、15-25g/l谷氨酸钠和2-8g/l酵母粉；所述发酵培养基含有：60-100g/l葡萄糖、1-5g/l kh2po4、4-12g/l na2so4、2-6g/l mgso4、0.1-1g/l kcl、1-5g/l (nh4)2so4、4-10g/l nacl、0.01-0.2g/l cacl2、15-25g/l谷氨酸钠、1-5g/l酵
母膏和0.5-2.5g/l玉米浆干粉；所述辅助因子添加在发酵培养基，所述辅助因子为n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸，相对于1l的所述培养基，所述辅助因子的添加量为10-200μmol。
30.上述优选实施例提供的方法制备得到的微生物油脂中dha的含量更高。
31.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中，裂殖壶菌为schizochytrium sp. hx-308，现保藏在中国典型培养物保藏中心（简称cctcc），保藏号为cctcc m 209059。破囊壶菌为thraustochytrium sp.，现保藏在美国模式培养物集存库（简称atcc），保藏号为atcc 26185。
32.n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛、3-甲基-喹恶啉-2-羧酸、2-喹恶啉羧酸、2-[4-(6-氯-2-喹恶啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯和喹恶啉购于上海阿拉丁试剂公司，其cas号分别为177355-84-9、74003-63-7、879-65-2、113776-20-8、91-19-0。其他原料和试剂均为商购获得。
[0033]
生物量的测量方法为：取1ml的发酵液于已称重的离心管中，离心去上清，于烘箱干燥至恒重。
[0034]
微生物油脂中的dpa含量的测试方法为：取0.5g油脂，用正己烷定容至10ml；然后移取1ml至容器中，加入3ml 0.5mol/l的koh-甲醇溶液，于65
°
c水浴15-20min，冷却；再加入2ml bf3-乙醚-甲醇溶液（bf3-乙醚:甲醇=3:7，v/v），水浴65℃5-10min，冷却；再加饱和nacl溶液、正己烷各2ml，振荡后静置、分层，取上层至另一个容器中，取1ml正己烷相上气相进行脂肪酸分析。
[0035]
气相分析条件：色谱柱：db-23（60m
×
0.25mm
×
0.25μm）；检测器：fid；载气：氮气；分流比：30/1；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；进样量：1μl；升温程序：初始柱温为100℃，先以25℃/min的速度升至196
°
c，再以2℃/min的速度升至220℃，保持12min。柱流速：3.0ml/min；尾吹流速：30ml/min；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min。
[0036]
气相色谱仪购于日本岛津，仪器型号为qp2010 se。
[0037]
实施例1（1）种子培养基的配方为：葡萄糖60g/l、kh2po
4 3g/l、na2so
4 35g/l、mgso
4 4g/l、kcl 1g/l、(nh4)2so
4 5g/l、谷氨酸钠20g/l、酵母粉4g/l，121℃高温灭菌20min后备用；发酵培养基的配方为：葡萄糖80g/l、kh2po
4 3g/l、na2so
4 8g/l、mgso
4 4g/l、kcl 0.3g/l、(nh4)2so
4 3g/l、nacl 6.6g/l、cacl
2 0.06g/l、谷氨酸钠20g/l、酵母膏3g/l、玉米浆干粉1.5g/l，然后添加100μmol/l的n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛，121℃高温灭菌20min后备用；（2）将裂殖壶菌菌种按照1体积%接种量接种至种子培养基中，在初始ph为6.5、转速为170rpm、温度为28℃的条件下培养24h后得到种子液，将种子液按照8体积%接种量接种至发酵培养基中，在初始ph为6.5、转速为170rpm、温度为28℃的条件下培养，培养120h，在发酵过程中保证葡糖糖含量不低于10g/l，若低于10g/l，滴加500g/l的葡萄糖溶液，得到发酵液；（3）将破壁酶以3g/l的添加量加入发酵液中，在ph为11、转速为180rpm、温度为30℃的条件下酶解4h得到破壁液，将破壁液与乙醇、正己烷以体积比1:1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂；对微生物油脂进行测量得到dha含量如表1所示。
[0038]
实施例2（1）种子培养基的配方为：葡萄糖40g/l、kh2po
4 1g/l、na2so
4 45g/l、mgso
4 2g/l、kcl 2g/l、(nh4)2so
4 2g/l、谷氨酸钠15g/l、酵母粉2g/l，121℃高温灭菌20min后备用；发酵培养基的配方为：葡萄糖60g/l、kh2po
4 1g/l、na2so
4 4g/l、mgso
4 6g/l、kcl 1g/l、(nh4)2so
4 5g/l、nacl 4g/l、cacl
2 0.01g/l、谷氨酸钠15g/l、酵母膏5g/l、玉米浆干粉0.5g/l，然后添加50μmol/l的n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛，121℃高温灭菌20min后备用；（2）将裂殖壶菌菌种按照1体积%接种量接种至种子培养基中，在初始ph为5.5、转速为200rpm、温度为25℃的条件下培养24h后得到种子液，将种子液按照10体积%接种量接种至发酵培养基中，在初始ph为5.5、转速为200rpm、温度为25℃的条件下培养，培养120h，在发酵过程中保证葡糖糖含量不低于10g/l，若低于10g/l，滴加500g/l的葡萄糖溶液，得到发酵液；（3）将破壁酶以2g/l的添加量加入发酵液中，在ph为12、转速为200rpm、温度为35℃的条件下酶解3h得到破壁液，将破壁液与乙醇、正己烷以体积比1:1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂；对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0039]
实施例3（1）种子培养基的配方为：葡萄糖80g/l、kh2po
4 5g/l、na2so
4 25g/l、mgso
4 6g/l、kcl 0.5g/l、(nh4)2so
4 8g/l、谷氨酸钠25g/l、酵母粉8g/l，121℃高温灭菌20min后备用；发酵培养基的配方为：葡萄糖100g/l、kh2po
4 5g/l、na2so
4 12g/l、mgso
4 2g/l、kcl 0.1g/l、(nh4)2so
4 1g/l、nacl 10g/l、cacl
2 2g/l、谷氨酸钠25g/l、酵母膏1g/l、玉米浆干粉2.5g/l，然后添加200μmol/l的n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛，121℃高温灭菌20min后备用；（2）将裂殖壶菌菌种按照1体积%接种量接种至种子培养基中，在初始ph为7、转速为150rpm、温度为35℃的条件下培养24h后得到种子液，将种子液按照2体积%接种量接种至发酵培养基中，在初始ph为7、转速为150rpm、温度为35℃的条件下培养，培养120h，在发酵过程中保证葡糖糖含量不低于10g/l，若低于10g/l，滴加500g/l的葡萄糖溶液，得到发酵液；（3）将破壁酶以4g/l的添加量加入发酵液中，在ph为10、转速为160rpm、温度为25℃的条件下酶解6h得到破壁液，将破壁液与乙醇、正己烷以体积比1:1:1进行混合提取得到正己烷相，将正己烷相经旋蒸去除正己烷得到微生物油脂；对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0040]
实施例4按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛中添加量为10μmol/l。
[0041]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0042]
实施例5按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛中添加量为500μmol/l。
[0043]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0044]
实施例6
按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0045]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0046]
实施例7按照实施例2的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0047]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0048]
实施例8按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0049]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0050]
实施例9按照实施例4的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0051]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0052]
实施例10按照实施例5的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0053]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0054]
实施例11按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用2-喹恶啉羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0055]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0056]
实施例12按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用2-[4-(6-氯-2-喹恶啉氧基)-苯氧基]丙酸乙酯替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0057]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0058]
实施例13按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用喹恶啉替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0059]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0060]
实施例14按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，采用n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和3-甲基-喹恶啉-2-羧酸替换n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛，n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和3-甲基-喹恶啉-2-羧酸的质量比为1：1。
[0061]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0062]
实施例15按照实施例1的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，种子培养基中也添加有100μmol的n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0063]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0064]
实施例16按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（2）中，采用破囊壶菌替换裂殖壶菌。
[0065]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0066]
对比例1按照实施例3的方法制备微生物油脂，不同的是，步骤（1）中，发酵培养基中不添加n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛。
[0067]
对微生物油脂进行测量得到其组分含量如表1所示。
[0068]
表1通过表1的结果可以看出，采用本发明实施例中dha含量和油脂产量相比于对比例得到了显著的提高，说明将n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛和/或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸添加进培养基中进行生物发酵，能够促进裂殖壶菌对培养基中营养物质的吸收，进而提高培养基中养分的利用率，而且能够提高裂殖壶菌生产的油脂中的dha的含量。
[0069]
实施例3和实施例8均是与对比例1相对应的实施例，区别在于：实施例3中添加了200μmol/l的n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛，实施例8中添加了200μmol/l的3-甲基-喹恶啉-2-羧酸，而对比例1中并未添加n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸。根据表1中的记载可知，实施例3中dha产量为53.5g/l，实施例8中dha产量为57.6g/l，对比例1中dha产量为43.3 g/l，实施例3和实施例8中的dha产量明显高于对比例1中dha产量，说明n,n-二氧喹恶啉-2-甲醛或3-甲基-喹恶啉-2-羧酸的添加能够有效提高裂殖壶菌的dha产量。
[0070]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其
它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。