TP53INP2在增强急性髓系白血病细胞对TRAIL敏感性方面的应用

tp53inp2在增强急性髓系白血病细胞对trail敏感性方面的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学研究技术领域，具体涉及tp53inp2在增强急性髓系白血病细胞对trail敏感性方面的应用。


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是一类造血干细胞克隆增殖性的恶性血液疾病，以髓系白血病细胞异常增生及正常造血细胞受抑制为主要表现，呈高度异质性，是成人最常见的急性白血病类型。目前aml的临床治疗药物主要以阿糖胞苷(cytrarabine，ara-c)和柔红霉素(daunorubicin，dnr)为主，通过干扰dna合成继而诱发白血病细胞发生凋亡。尽管常规化疗药物在临床治疗上取得了不错的疗效，但是仍有部分患者治疗效果不佳，面临着敏感性差，副作用大和耐药的问题。因此，需要寻找一种新的治疗策略来解决目前临床面临的问题。细胞凋亡包括内源性凋亡和外源性凋亡两种方式，常规化疗药物ara-c和dnr诱导的凋亡类型属于内源性凋亡。事实上，通过死亡配体，如fas，肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(trail)，与细胞表面的死亡受体结合进而诱发的外源性凋亡在凋亡过程中也发挥了重要的作用。其中trail诱导的细胞凋亡，因其具有较高的肿瘤特异性和对正常细胞较低的毒性而备受关注。trail在实体肿瘤中相关的研究非常之多，近年来在aml中也逐渐有了应用，但是疗效却相对有限。最近的研究报道，肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2(tumor protein53-induced nuclear protein 2，tp53inp2)在部分肝癌细胞中高表达，重要的是，相比其他肝癌细胞，高表达tp53inp2的肝癌细胞对trail诱导的凋亡敏感性显著增加。此外，在乳腺癌细胞中，也观察到高表达tp53inp2的三阴性乳腺癌细胞在trail处理后呈现更高的凋亡水平。上述研究报道提示tp53inp2在trail诱导实体肿瘤细胞凋亡中扮演着重要的角色。然而，tp53inp2在白血病发生中的作用以及是否增强白血病细胞对trail的敏感性还未见报道。


技术实现要素：

3.1.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种增强trail治疗急性髓系白血病疗效的策略及方法。
4.2.本发明的实施例提供一种实验性验证tp53inp2在增强aml细胞对trail敏感性方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
5.(1)检测tp53inp2在各个白血病细胞系的表达水平。首先，利用癌症基因百科全书(cancer cell line encyclopedi，ccle)数据库分析在各类白血病细胞系中tp53inp2的基因表达水平；然后，利用实时荧光定量pcr(quantitative real time pcr，qrt-pcr)实验和蛋白质印迹法(western blotting)检测各类白血病细胞系中tp53inp2的基因和蛋白表达水平。
6.(2)接下来检测tp53inp2的表达水平与白血病细胞对trail的敏感性是否相关。由于在aml中tp53inp2的表达水平与白血病细胞对trail的敏感性是否相关仍然是未知的，故在本实施例中按照如下方式检测。首先利用活细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，cck-8)检测trail诱导后各白血病细胞系体外增殖能力的改变情况。最后，利用western blotting和流式细胞术(flow cytometry，fcm)检测trail诱导后各白血病细胞系的凋亡状况。
7.(3)通过上述实施例，可以表明在aml中tp53inp2的表达水平与白血病细胞对trail的敏感性是否具有相关性。基于上述的发现，在本实施例中，首先构建了pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2的质粒；其次，将构建的pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒瞬时转染于低表达tp53inp2的白血病细胞中，使这类白血病细胞中的tp53inp2表达水平增加。pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒的表达效率通过qrt-pcr和western blotting来验证。
8.(4)为了验证构建的pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒是否能够增强白血病细胞对trail的敏感性，在本实施例中，首先通过cck-8检测试剂盒检测了过表达ha-tp53inp2质粒后是否增强trail抑制白血病细胞体外增殖的能力；其次通过western blotting和fcm检测过表达ha-tp53inp2质粒后是否增强了trail诱导白血病细胞凋亡的能力。
9.综合以上分析，我们提出了以下思路：首先检测在各白血病细胞系中tp53inp2的表达水平(如图1)，然后观察在白血病细胞中tp53inp2表达水平与白血病细胞对trail的敏感性是否相关(如图2和图3)，进而基于上述的发现构建出pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2的质粒并转染于低表达tp53inp2的白血病细胞(如图4)，最后通过实验验证表达的pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒是否增强了白血病细胞对trail的敏感性(图5)。
10.3.实验结果
11.(1)检测tp53inp2在各个白血病细胞系的表达情况。为了检测tp53inp2在白血病细胞中的表达情况，首先利用公共数据库ccle分析在11种白血病细胞中tp53inp2的基因表达水平，结果如图1a所示，tp53inp2在oci-aml3细胞中表达最高，在其余的白血病细胞系中都表达较低。随后，利用qrt-pcr检测tp53inp2在oci-aml3、oci-aml2、nb4、thp-1和kg-1α细胞中的mrna表达水平，结果如图1b所示，tp53inp2在oci-aml3细胞中表达最高，在oci-aml2和thp-1等细胞中表达则相对较低；最后，通过western blotting检测tp53inp2在上述几种细胞中的蛋白表达水平，如图1c所示，结果与mrna水平一致。以上结果表明，tp53inp2除了在oci-aml3细胞外，在其他白血病细胞如oci-aml2和thp-1细胞中的表达都比较低。
12.(2)观察白血病细胞对trail的敏感性和其tp53inp2表达水平的联系。为了观察在aml中白血病细胞对trail的敏感性与其tp53inp2的表达水平是否直接相关，我们首先利用cck-8实验，检测在不同浓度的trail(0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml)处理48h后各类白血病细胞系的体外增殖能力改变情况。结果如图2所示，随着trail浓度的增加，除oci-aml3细胞外，oci-aml2、thp-1等白血病细胞的体外增殖能力被抑制程度都比较轻；随后，将oci-aml3、oci-aml2和thp-1细胞用100ng/ml的trail处理48h后，通过western blotting检测其凋亡水平。如图3a-c所示，通过parp、caspase 8、caspase 3的活化水平表明oci-aml3细胞处于较高的凋亡水平，而oci-aml2和thp-1细胞则处于较低的凋亡水平；最后，将上述的三种白血病细胞用50ng/ml的trail处理48h后，通过fcm检测其凋亡率。结果如图3d所示，oci-aml3细胞凋亡率最高，而oci-aml2和thp-1细胞的凋亡率都
较低。以上的结果表明，高表达tp53inp2的oci-aml3细胞对trail更敏感，而低表达tp53inp2的oci-aml2和thp-1细胞则对trail相对耐受，这提示了白血病细胞对trail的敏感性与其tp53inp2的表达水平呈现正相关。
13.(3)构建tp53inp2的质粒并过表达于trail不敏感白血病细胞。在观察到白血病细胞对trail的敏感性与其tp53inp2的表达水平呈正相关后，我们着手构建pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2的质粒。构建完成的pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒的序列如sequence no.1所示。在ha-tp53inp2质粒构建完成后，将其转染入低表达tp53inp2的oci-aml2和thp-1细胞，通过qrt-pcr和western blotting检测ha-tp53inp2的mrna和蛋白表达水平，如图4a-d所示，在oci-aml2和thp-1细胞中ha-tp53inp2成功表达。
14.(4)验证构建的tp53inp2质粒能否增强白血病细胞对trail的敏感性。接下来，我们观察ha-tp53inp2质粒能否增强白血病细胞对trail的敏感性。在oci-aml2和thp-1细胞中成功过表达ha-tp53inp2后，我们一方面用200ng/ml的trail处理oci-aml2和thp-1细胞48h，通过cck-8试剂盒检测对其体外增殖能力的影响，结果如图5a-b所示，过表达ha-tp53inp2后trail更加显著地抑制了oci-aml2和thp-1细胞的体外增殖能力；另一方面，将转染了ha-tp53inp2的thp-1和oci-aml2细胞分别用100ng/ml的trail处理48h后进行western blotting，用50ng/ml的trail处理48h后进行fcm检测。结果如图5c-e所示，过表达ha-tp53inp2后trail对oci-aml2和thp-1细胞诱导的凋亡程度比原来更显著。上述的结果表明，构建ha-tp53inp2质粒能够显著地增强白血病细胞对trail的敏感性。
15.本发明有益效果在于：1、本发明首次检测了aml细胞中tp53inp2的表达水平，发现tp53inp2高表达的白血病细胞对trail治疗的敏感性增加，基于上述发现，tp53inp2的表达水平可以作为临床上应用trail治疗aml患者的潜在判断指标；2、本发明建立了一种能够增强trail治疗aml患者疗效的策略和方法。对trail相对不敏感的白血病细胞，可通过增加其tp53inp2的表达水平，以提高trail的疗效，从而促进trail治疗在aml患者的临床应用。
附图说明
16.图1a显示为在ccle数据库的11种白血病细胞中tp53inp2的基因表达情况。
17.图1b显示为利用qrt-rcr检测tp53inp2在各白血病细胞系的基因表达情况。
18.图1c显示为利用western blotting检测tp53inp2在各白血病细胞系的蛋白表达情况。
19.图2显示为利用cck-8实验观察trail处理后各白血病细胞的增殖能力变化情况。
20.图3a-c显示为利用western blotting检测trail诱导后oci-aml2和thp-1细胞的凋亡变化情况。
21.图3d显示为利用fcm检测trail诱导后oci-aml2和thp-1细胞的凋亡率。
22.图4a和图4c显示为转染ha-tp53inp2质粒后利用qrt-pcr检测oci-aml2和thp-1细胞的tp53inp2 mrna变化情况。
23.图4b和图4d显示为转染ha-tp53inp2质粒后利用western blotting检测oci-aml2和thp-1细胞的tp53inp2蛋白变化情况。
24.图5a-b显示为转染ha-tp53inp2质粒后利用cck-8实验观察oci-aml2和thp-1细胞在trail诱导后的体外增殖能力变化情况。
25.图5c-d和图5e显示了转染ha-tp53inp2质粒后利用western blotting和fcm检测oci-aml2和thp-1细胞在trail诱导后的凋亡改变情况。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
27.1、本发明实施例中ccle数据库tp53inp2基因相关数据下载及可视化tp53inp2在11种白血病细胞中的基因表达数据均来自于癌症基因百科全书(cancer cell line encyclopedi，ccle，https://depmap.org/portal/)数据库。另外，将tp53inp2的基因表达数据从ccle下载完成后，利用graphpad prism(version 7.00)软件实现可视化。
28.2、本发明实施例中白血病细胞的培养方法oci-aml3和oci-aml2细胞购买自德国微生物菌种保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh，dsmz)。细胞生长所需的培养基是以rpmi-1640培养液、澳洲胎牛血清和青霉素-链霉素溶液(100u/ml)按照100：10：1的比例配制而成，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。平均2-3天传代，以保持细胞对数生长。kg-1α、thp-1和nb4细胞购买自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)，细胞生长所需的培养基是以rpmi-1640培养液、南美胎牛血清和青霉素-链霉素溶液(100u/ml)按照100：10：1的比例配制而成，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。平均1-2天传代，以保持细胞对数生长。
29.3、本发明实施例中qrt-pcr检测基因表达水平的方法：
30.(1)rna提取：首先，以1，000rpm
×
5min离心，收集适量状态良好的细胞；弃上清，用预冷的pbs洗2-3次，以3，000rpm
×
3min离心；随后，弃上清，加入1mlrna提取试剂trizol，充分混匀，冰上静置10min；然后，加入trizol 1/5体积的氯仿，颠倒混匀，冰上静置后，4℃离心，12，000g
×
15min；吸取上清至预冷的新无酶ep管中，加入与氯仿等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置，以12，000g
×
10min的条件4℃离心；弃上清，加入1ml新鲜配制的75％乙醇溶液，清洗沉淀，以13，000g
×
15min的条件4℃离心；弃上清，静置2-3分钟使乙醇挥发，根据沉淀量加入适量depc水溶解；最后，测定rna浓度及纯度。
31.(2)逆转录，按表1-1配制逆转录体系，并进行逆转录表1-1逆转录反应体系(20μl体系)试剂用量5
×
primescript rt master mix4μltotal rna1μgrnase free ddh2oup to 20μl反应条件：37℃
×
15min，85℃
×
5s，4℃冷却，cdna于-40℃保存。
32.(3)qrt-pcr，实时荧光定量pcr反应体系见表1-2
表1-2qrt-pcr反应体系反应条件：第一阶段，95℃预变性30s；第二阶段，95℃变性5s，58℃退火30s，72℃充分延伸20s，采集荧光，循环39次。融解曲线条件：(65℃～95℃)每上升0.5℃采集1次荧光。
33.以β-actin为内参，相对定量值结果采用2
–
δδct计算。各目的基因的引物由上海生工有限公司合成，序列见表1-3。表1-3 qrt-pcr的引物序列
34.4、本发明实施例中蛋白质印迹法检测(western blotting)蛋白表达水平的方法：
35.(1)蛋白质提取：首先，以1，000rpm
×
5min离心，收集适量状态良好的细胞，用预冷的pbs洗涤3次，以3，000rpm
×
3min离心；留取细胞沉淀，加入沉淀量约2-3倍体积的蛋白质裂解液(由蛋白酶抑制剂和ripa裂解液以1：100配制)，充分震荡混匀；冰上裂解细胞30min，每5min涡旋振荡一次，重复6次，以13，300rpm
×
30min，4℃离心；吸取上清溶液至预冷的新ep管中，以bca法检测蛋白质浓度，加入约1/4蛋白样品体积的5
×
loading buffer，然后煮沸变性5-6分钟，最后于-80℃保存。
36.(2)sds-page凝胶电泳：按照表1-4的两块凝胶配方，先配制下层12％的分离胶，上层加入适量无水乙醇，室温静置30min；随后倒掉无水乙醇，然后配制上层的5％的浓缩胶，插入尺梳，室温静置30min。在电泳槽内灌满电泳缓冲液后，拔掉尺梳，按照实验需要上样。
37.按照二步法电泳分离蛋白第一步，电压80v，电流120ma，30min；第二步，电压120v，电流210ma，60～90min。表1-4
38.(3)转膜：待电泳结束后，首先根据待测蛋白分子量大小切取凝胶，然后剪裁与之匹配的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，pvdf)膜，将裁剪好的pvdf膜置于甲醇中浸泡15-30s活化，双蒸水洗涤2min，然后将pvdf膜和滤纸片浸泡在预冷的湿转缓冲液中。最后由正极向负极方向依次按照海绵、滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸和海绵的顺序进行转膜。以220ma的恒流电泳转膜，转膜时间由蛋白分子量大小决定。
39.(4)封闭：转膜后，将pvdf膜放入5％蛋白封闭液，室温封闭2h。
40.(5)抗体孵育：首先，除去膜上残留的封闭液，tbst洗涤3次；用定性滤纸吸干膜上残留液体后，将膜置于蜡板上，加入预先稀释好的一抗工作液均匀覆盖pvdf膜，4℃孵育过夜；回收一抗工作液后，将pvdf膜放入tbst中洗涤3次，每次10min；最后，加入预先稀释好的辣根过氧化物酶标记二抗于pvdf膜上，室温孵育1h，tbst洗涤3次，每次10min。
41.(6)显色及成像：暗室内，将pvdf膜置于化学发光板上，然后加入预先配置的化学发光试剂均匀覆盖于pvdf膜，于成像系统中显示成像。
42.5、本发明实施例中构建了pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2的质粒质粒的设计，鉴定和合成：本发明中的pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2质粒的设计和合成由武汉金开瑞公司完成。
43.6、本发明实施例中转染质粒pcdna3.1-egfp/ha-tp53inp2的方法：将状态良好的细胞以适当密度接种至6孔细胞板中培养；然后用250μl不含血清的1640培养基稀释质粒储存液至适当浓度，轻柔混匀，室温孵育5min；用250μl不含血清的培养基稀释5μllipofectamine2000轻柔混匀，室温孵育5min；然后将稀释的质粒与稀释的lipofectamine 2000轻轻混匀，室温孵育20min，以形成脂质体核酸复合物；随后将脂质体核酸混合液加入含有细胞的6孔板中，轻轻混匀，在37℃、5％co2的培养箱中培养24-96h。
44.7、本发明实施例中cck-8实验检测细胞增殖的方法：收集各组细胞，以每孔1.5
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104个细胞数接种于96孔板中，每组设置5个复孔，同时设立空白对照，于孵箱中继续培养；培养第0、24h、48h和72h时每孔加入10μlcck-8试剂，混匀后继续培养3h；在450nm波长下检测吸光度(od)值，以od450值为纵坐标、培养时间为横坐标来绘制细胞增殖曲线。
45.8、本发明实施例中fcm实验检测细胞凋亡的方法：收集各组细胞，用预冷的pbs洗涤2-3次，1，500rpm
×
5min；取5
×
105个重悬的细胞，300g
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5min，弃上清后加入500μl稀释的1
×
annexin v binding buffer工作液重悬细胞；细胞悬液中加入5μl的annexin v-apc
和5μl的dapi染液，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15min，反应完成后立即上机检测。
46.9、本发明实施例中的统计分析方法：所有数据来自3次独立的实验，定量资料以均数
±
标准差(
±
sd)表示。采用graphpad prism(version 7.00)软件进行统计处理。两样本均数比较采用非配对学生t检验。检验水准为α＝0.05，p《0.05表示差异有统计学意义。