一种根瘤菌HH103的多基因突变体及应用

一种根瘤菌hh103的多基因突变体及应用
技术领域
1.本发明属于农用微生物领域，具体涉及一种根瘤菌hh103的多基因突变体及应用。


背景技术：

2.氮元素是限制作物生长的最主要元素之一，但是土壤中能够被植物所利用的氮元素非常有限，主要还是由化学肥料来提供。然而，随着氮肥使用量的不断增加，这不仅抑制根瘤菌与豆科植物间的共生固氮作用，而且给生态环境带来了诸多不利的影响。所以，在无化学肥料供应的情况下，共生固氮可以为豆科植物的生长发育提供足够的氮源。在大豆根系被根瘤菌侵染后会形成共生根瘤，根瘤会通过生物固氮的的方式将空气中的氮气转化成氨为大豆提供氮源。增加大豆与根瘤菌间的固氮能力，既可以大幅度减少氮肥的使用，同时也可以提高大豆产量。因此，提高豆科植物自身的固氮能力对生态环境与农业发展具有重要意义。
3.豆科植物与根瘤菌的共生结瘤过程中有很多信号分子的传导参与，其中根瘤菌的ⅲ型泌出系统分泌的ⅲ型效应因子是最主要的信号分子之一，它影响着根瘤菌与宿主植物之间共生关系的建立。但是ⅲ型效应因子是如何影响植物结瘤的分子机制还不清楚，以及根瘤菌与豆科植物间的互作基因还没有深入的研究。
4.大豆根瘤的数目是影响大豆共生固氮和生长情况的重要的因素，目前控制大豆根瘤菌的数量是没有办法通过人为来控制的，只能通过不断的更换根瘤菌摸索适合于接种大豆的根瘤菌维持稳定的根瘤数量，操作很麻烦并且工程量很大，未知的因素也比较多。现在急需一种可以控制大豆根瘤数量的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了在降低人工人本的前提下，减少根瘤的数量，解决了很难控制大豆根瘤数量的技术问题。
6.本发明提供一种根瘤菌(sinorhizobium fredii)hh103的多基因突变体，所述多基因突变体是以根瘤菌为出发菌，将出发菌株中的nopt基因、nopc基因和nopl基因中的任意两个或三个基因进行突变或者沉默获得的。
7.进一步地限定，所述nopt基因的序列如seq id no.15所示；所述nopc基因的序列如seq id no.16所示；所述nopl基因的序列如seq id no.17所示。。
8.进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将nopt基因和nopc基因与pjq200sk载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌hh103中得到根瘤菌hh103的多基因突变体。
9.进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将nopl基因和nopc基因与pjq200sk载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌hh103中得到根瘤菌hh103的基多因突变体。
10.进一步地限定，任意两个基因进行突变或沉默获得的突变体的方法：将nopl基因
和nopt基因与pjq200sk载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌hh103中得到根瘤菌hh103的多基因突变体。
11.进一步地限定，三个基因进行突变或者沉默获得突变体的方法：将nopl基因、nopc基因和nopt基因与pjq200sk载体连接得到重组载体，然后将重组载体导入到根瘤菌hh103中得到根瘤菌hh103的多基因突变体。
12.本发明提供一种减少大豆根瘤数目的试剂，所述试剂的有效成分是上述的根瘤菌hh103的多基因突变体。
13.本发明提供上述试剂在减少大豆根瘤数目中的应用，将上述的试剂接种野生型大豆幼苗；所述大豆品种为charleston、东农594、绥农14、zyd00006、nattosan、合00-23、红丰11、绥02-339、紫花2号、黑农44、黑农35或北丰11。
14.9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在大豆幼苗生长至对生真叶期，对大豆苗施用含上述的多基因突变体的菌液，接菌数量为大于2
×
105个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。
15.本发明提供上述的多基因突变体在大豆育种中的应用。
16.有益效果：结瘤鉴定结果显示，两个单突变体hh103ωnopt、hh103ωnopc在的结瘤数目均有不同程度的减少，其中hh103ωnopc与野生型hh103相比减少结果最为显著；单基因突变体hh103ωnopl结瘤数目略有增加，但其显著性最小，说明nopl在cssl亲本绥农14中对共生结瘤的影响很小；双基因突变体hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt结瘤数目显著性减少，但是与单基因突变体hh103ωnopt、hh103ωnopc相比结瘤数目略有上调；三基因突变体hh103ωnoptωnopcωnopl结瘤数目同样减少，而且其减少结果最为显著。为了减少单一大豆品种对结果产生的片面性，将双基因突变体与三基因突变体接种30份种植资源，除了个别品种以外，其他结果均与绥农14保持一致。
附图说明
17.图1为nopt上、下游片段，cm片段和nopt-cm大片段扩增，其中，m1：trans 2k plus dna marker；m2：trans 2k plusⅱdna marker；1：nopt上游片段(1020bp)；2：nopt下游片段(1000bp)；3：cm片段(1010bp)；4、5：nopt-cm大片段(3030bp)。
18.图2为nopt-cm-pjq200sk菌液pcr结果图，其中，m：trans 2k plus dna marker；1：插入pjq200sk的nopt-cm大片段(3030bp)。
19.图3为突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的pcr鉴定，其中，m：trans 2k plus dna marker；图a：引物nopt-s-f-x、nopt-a-r-x进行第一轮鉴定；图b：引物nopt-s-f-x、cm-r进行第二轮验证，图c：引物cm-f、cm-r进行第三轮pcr验证，其中10泳道为hh103ωnoptωnopcωnopl突变体。
20.图4为突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的southern鉴定，其中，m:dl 15000dna ladder；1:hh103(xho i)；2:hh103ωnoptωnopcωnopl(xho i)。
21.图5为hh103ωpfaj1702-flag-hnopt的pcr鉴定结果图，其中，m：trans 2k plus dna marker；1、2、3：hh103ωpfaj1702-flag-hnopt。
22.图6为绥农14接种9种根瘤菌的表型结果图，其中，1：hh103；2：hh103ωnoptωnopcωnopl；3：hh103ωnoplωnopt；4：hh103ωnoplωnopc；5：hh103ωnopt；6：hh103ωnopc；7：
gcggttgctg acctgcgagagcaggcggcc gattggcttg atgagcatcg tcaccgcgtc atcagtgagc ttctggcggagtttgatgcc tgcgttatga ttgtcgcgta ccgacggctg gcgttgaagt caccagcgagccaggctgag tggcgtcacc ctcgcggatg tcccgccccc cagaccggat gcggggcctgcaagcgagga tcgatctcga gcgcgtaagc gtcagctccg atcagagctg cctaccacgacgccgggcaa tggcgcgggc cgcgccgacc catgcgttcg atcacggtcg ccattggcag)的引物(分为起始密码子上游1020bp和下游1000bp两个大片段设计引物，如表1所示)；
52.根据pgwc入门载体设计cm大片段引物，三对引物分别利用overlap pcr原理设计，如表1所示，使其引物含有20bp左右的序列重复；
53.表1 nopt-s，nopt-a突变片段-lf引物序列
[0054][0055]
(2)用细菌基因组dna提取试剂盒获取快生型费氏中华根瘤菌hh103全基因组为模板；引物nopt-s-f，nopt-s-r扩增nopt上游基因，引物nopt-a-f，nopt-a-r扩增nopt下游基因，引物cm-f，cm-r扩增cm基因。
[0056]
nopt上游基因反应体系(100μl)如下：模板dna，2μg；5
×
ps buffer，20μl；dntp，8μl；nopt-s-f，2μl；nopt-s-r，2μg；primestar，1.2μl；ddh2o，up to 100μl。
[0057]
nopt上游基因pcr反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，48s；72℃，10min；4℃，pause。
[0058]
nopt下游基因反应体系(100μl)如下：模板dna，2μg；5
×
ps buffer，20μl；dntp，8μl；nopt-a-f，2μl；nopt-a-r，2μg；primestar，1.2μl；ddh2o，up to 100μl。
[0059]
nopt下游基因pcr反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，pause。
[0060]
cm基因反应体系(100μl)如下：模板dna，2μg；5
×
ps buffer，20μl；dntp，8μl；cm-f，2μl；cm-r，2μg；primestar，1.2μl；ddh2o，up to 100μl。
[0061]
cm基因pcr反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；4℃，pause；4℃，pause。
[0062]
(3)目的片段胶回收：
[0063]
1)使用tae缓冲液制作琼脂糖凝胶，将pcr产物目的片段用100v电压下，琼脂糖电泳跑1.5h；
[0064]
2)在紫外灯光照射下，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，用干净刀片将含有目的片段的凝胶切下，放入1.5ml的离心管中；
[0065]
3)在离心管中按照重量体积1：1加入胶块溶解液buffer gm；
[0066]
4)将离心管放入55℃水浴锅内进行水浴10min中间颠倒3次；
[0067]
5)凝胶完全溶解后，步骤4的混合液转移至spin column中进行离心，1min，12000rpm，弃滤液；
[0068]
6)向spin column内加入700μl buffer wb，室温12000rpm离心1min，弃滤液，重复操作一次；
[0069]
7)空离12000rpm 2min；
[0070]
8)准备干净的1.5ml离心管，向spin column柱内加入elution buffer 30μl，静置2min后12000rpm离心2min洗脱dna，得到产物放入-20℃冰箱保存。
[0071]
2.同源重组片段nopt-cm的克隆
[0072]
(1)以上述构建好的nopt上游基因，nopt下游基因，cm基因为模板，用nopt-s-f，nopt-a-r扩增nopt-cm大片段(序列如seq id no.8所示)nopt-cm大片段反应体系(100μl)如下：模板dna，2μg；5
×
ps buffer，20μl；dntp，8μl；nopt-s-f，2μl；nopt-s-r，2μg；primestar，1.2μl；ddh2o，up to 100μl。
[0073]
nnopt-cm大片段pcr反应条件(33个循环)：98℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，48s；72℃，10min；4℃，pause。
[0074]
(2)产物胶回收获得nopt-cm大片段；
[0075]
(3)peasy-blunt cloning kit载体连接体系(10μl)：nnopt-cm大片段，4μl；solution，5μl；peasy-blunt cloning kit，1μl。16℃金属浴16h。获得重组载体nnopt-cm-peasy-blunt。
[0076]
(4)t1大肠杆菌转化：冰浴，30min；42℃水浴锅，45s；冷敷，2min；加入无抗性lb液体培养基500μl放入37℃水平摇床160rpm，1h。
[0077]
(5)将小摇后的菌液均匀涂布在含有km抗性的lb固体培养基上，吹干后放入37℃恒温培养箱中，次日将筛选出的菌落进行pcr鉴定；
[0078]
(6)单克隆菌液pcr鉴定(20μl)：菌液，1μl；taq master mix，10μl；nopt-s-f(10μm)，0.8μl；nopt-s-r(10μm)，0.8μl；ddh2o，up to 10μl。
[0079]
pcr反应条件(28个循环)：95℃，3min；95℃，15s；55℃，15s；72℃，2min；72℃，5min；4℃，pause。
[0080]
确定正确条带，送上海生工公司测序，将测序结果与基因序列通过dnaman比对，并命名为nnopt-cm-peasy-blunt，将正确菌液进行质粒提取。nnopt-cm-peasy-blunt质粒提取
[0081]
结果：克隆nopt基因大片段与cm基因片段，overlap pcr获得nopt-cm大片段
[0082]
以中华根瘤菌hh103基因组和pgwc载体为模板，用引物nopt-s-f、nopt-s-r扩增nopt上游片段，引物nopt-a-f、nopt-a-r扩增nopt下游片段，引物cm-f、cm-r扩增cm片段，overlap pcr获得nopt-cm大片段，nopt上游片段的目标条带为1020bp，nopt下游片段的目标条带为1000bp，cm的目标条带为1000bp，nopt-cm大片段的目标条带为3030bp，扩增长度与理论相符。如图1所示。
[0083]
3.重组自杀载体构建
[0084]
(1)通过dnaman分析nopt-cm和pjq200sk载体的酶切位点，后者存在的酶切位点为sali和xbai，设计引物如表2所示。
[0085]
表2 nopt-cm-x引物序列
[0086][0087]
(2)以nopt-cm大片段为模板，用引物nopt-s-f-x，nopt-a-r-x扩增nopt-cm-x。nopt-cm-x与pjq200sk载体酶切。
[0088]
酶切体系(150μl)：dna，6μg；cutsmart，15μl；ecori，ecori；ddh2o，up to 150μl。放置金属浴中37℃，3-5h，酶切产物胶回收得到nopt-cm-x序列。
[0089]
连接体系及反应条件(10μl)：载体，0.5μg；片段，2μg；buffer，1μl；t4连接酶，1μl；ddh2o，up to 10μl，获得重组载体nopt-cm-pjq200sk。放置金属浴中16℃，16h。连接后转入大肠杆菌感受态，菌液pcr鉴定后，测序成功后命名nopt-cm-pjq200sk。
[0090]
用sali、xbai双酶切nopt-cm大片段和pjq200sk载体，连接转化后，挑选单克隆用引物nopt-s-f-x、nopt-a-r-x进行菌液pcr，扩增长度与理论相符。如图2所示。
[0091]
构建突变体hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoptωnopc、hh103ωnoplωnopt，采用传统的三亲杂交方法，构建完载体直接使用这个方法就可以构建了。
[0092]
pjq200sk-nopc-spec载体记载在专利公开号为cn113388562a的专利中。
[0093]
pjq200sk-nopt-spec载体(mapping quantitative trait loci related to nodule number in soybean(glycine max(l.)merr.)in response to the sinorhizobium(ensifer)fredii hh103 nopt type iii effector)，经过三亲杂交的方法获得突变体hh103ωnopt。
[0094]
hh103ωnopl记载在(zhang,y.,liu,x.,chen,l.et al.mining for genes encoding proteins associated with nopl of sinorhizobium fredii hh103 using quantitative trait loci in soybean(glycine max merr.)recombinant inbred lines.plant soil 431,245
–
255(2018).)。
[0095]
hh103ωnopl和pjq200sk-nopc-spec进行三亲杂交获得hh103ωnoplωnopc；
[0096]
hh103ωnopt和pjq200sk-nopc-spec进行三亲杂交获得hh103ωnoptωnopc；
[0097]
hh103ωnopl和pjq200sk-nopt-spec进行三亲杂交获得hh103ωnoplωnopt。
[0098]
实施例2.构建根瘤菌hh103的突变体
[0099]
三亲杂交(1)菌株：双突突变体hh103ωnoplωnopc，t1大肠杆菌克隆菌株；
[0100]
将带有nopt-cm-pjq200sk的大肠杆菌划线于含有gent，cm抗性的lb固体培养基；双突突变体hh103ωnoplωnopc划线于含rif，km，spec抗性的ty固体培养基中；
[0101]
将带有helper质粒的大肠杆菌划线于含km抗性的lb固体培养基。过夜培养直至长出单克隆；将3种菌挑单克隆分别于7ml相应培养基中培养至od
600
值为0.6左右；
[0102]
每个用枪吸取1ml，分别放于新的1.5ml离心管中，常温下离心12 000rpm离心30s，弃上清，用1ml无抗ty反复重悬；
[0103]
取重悬后的hh103ωnoplωnopc菌液200μl，nopt-cm-pjq200sk的大肠杆菌和带有helper质粒的大肠杆菌各100μl加入到新的1.5ml离心管中，离心12000rpm离心30s，弃上清，用20μl无抗ty重新重悬；将混合菌液滴到无抗ty固体培养基平板上过夜培养；
[0104]
过夜培养后，刮取大斑划线到含rif/spec/km/cm抗性的ty固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的rif/spec/km/cm抗性的ty固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体命名为hh103ωnoptωnopcωnopl。
[0105]
(2)hh103ωnoptωnopcωnopl菌液pcr鉴定
[0106]
利用引物nopt-s-f-x、nopt-a-r-x和nopt-s-f-x、cm-r以及cm-f、cm-r三对引物分别扩增突变菌株hh103ωnoptωnopcωnopl，通过电泳的方法，观察到目的条带，测序验证突变体。
[0107]
分别用引物nopt-s-f-x、nopt-a-r-x和cm-f、cm-r以及nopt-s-f-x、cm-r对突变体hh103ωnopz菌液进行pcr鉴定。用引物nopt-s-f-x和nopt-a-r-x扩增长度应该包含nopt-cm大片段，长度为3030p。用引物cm-f、cm-r扩增，证明扩增菌液包含抗生素片段，长度为960bp。用引物nopt-s-f-x和cm-r扩增长度应该包含抗生素片段与nopt上游片段，长度为2020p。最终筛选出突变体hh103ωnoptωnopcωnopl。如图13所示。
[0108]
(3)southern blot鉴定
[0109]
引物：设计标记探针的引物，引物包括目的基因及cm基因的一部分，总共大约200bp，设计引物如表3所示。
[0110]
表3 sb-nopt-cm探针引物序列
[0111][0112]
(4)southern blot药品准备：a)变性缓冲液(1.5m nacl，0.5m naoh)。b)中和缓冲液(1m tris-hcl，1.5m nacl)ph为7.5。c)脱嘌呤液(0.25m hcl)。d)20
×
ssc(nacl 175g，柠檬酸钠88g)。为中性溶液。2
×
ssc，ph为7.2；0.5
×
ssc，ph为7.2。e)马来酸缓冲液，ph为7.5。f)洗涤液，ph为7.5。g)检测缓冲液，ph为9.5。h)1
×
阻断液：10
×
阻断液(vial6)稀释10倍。i)antibody solution：1
×
阻断液1：10000稀释。j)10
×
tbe buffer。k)鲑鱼精。
[0113]
1)用细菌基因组dna提取试剂盒获取快生型费氏中华根瘤菌hh103和突变体hh103ωnopt全基因组。
[0114]
2)southern blot探针的标记：用s-nopt(f/r)扩增目的基因，胶回收获得基因片段。模板dna，5μl；ddh2o，up to 16μl；dna模板100℃8min，冰浴；加入dig-high prime(vail1)试剂离心，37℃金属浴12h，65℃5min，-20℃保存，酶切基因组。
[0115]
3)凝胶电泳：将dna样品放入样品口中，在60v电压下进行琼脂糖凝胶电泳，跑到三分之二处停止。
[0116]
4)电泳后，将胶进行处理：脱嘌呤液25min，ddh2o摇洗5min(两次)，变性缓冲液25min，ddh2o摇洗6min(两次)，中和缓冲液30min，ddh2o摇洗5min(两次)。
[0117]
5)dna转印：搭建转膜装置，在装置盒子内加入20
×
ssc，滤纸用2
×
ssc提前润湿，注意滤纸平板之间不留气泡，用绝缘材料封闭四边，放置短路产生，室温下，进行20h，中途注意装置内是否吸干液体，及时添加，转膜后，标记好正反，凝胶与尼龙膜直接接触一面为正面。
[0118]
6)照射：尼龙膜用2
×
ssc清洗2次，用紫外交联仪对膜的两面进行照射，每次5min。
照射后，放置4℃保存。
[0119]
7)杂交实验过程：
[0120]
预杂交：首先将地高辛(vail7)放入37℃水浴锅中预热，将尼龙膜放入杂交瓶中，排出其中的气泡，加入预杂交液37℃1h。
[0121]
探针变性准备：将之前准备的探针放入100℃水浴锅中变性10min后冰浴准备(变性后的探针应立即使用)。
[0122]
8)杂交：将杂交瓶中的液体出，加入新配置的杂交液，以及变性探针，重新放入杂交炉中，12h。
[0123]
9)洗膜：室温下20ml，2
×
ssc10min，50℃20ml，0.5
×
ssc15min(溶液需要预热)，20ml洗涤缓冲液5min，20ml，检测缓冲液2h，20ml，阻断液5min，2ml cspd显色液(在暗室中进行，用保鲜膜包裹，避光15min)
[0124]
10)化学显影：在暗室中进行，注意避光，用吸水纸轻轻将残余的cspd显色液吸干，将尼龙膜和x光片放入压片夹中，曝光显影2-3min，定影2-3min直至有条带显现出来。
[0125]
结果：将pjq200sk-nopt、hh103、helper三种菌液按2:1:1的比例混合，滴到无抗ty固体培养基平板上过夜培养，用灭过的枪头分多次刮取大斑，划线到含rif/spec(50mg/ml)抗性的ty固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；将经过3次筛选的单克隆划线于含有5％蔗糖的rif/spec(50mg/ml)抗性的ty固体培养基进行筛选，重复3次；筛选到的突变体经pcr、southern blot鉴定后命名为hh103ωnopt。
[0126]
实施例3.构建回补菌株hh103ωpfaj1702-flag-hnopt
[0127]
(1)引物：在nopt起始密码子前500bp左右开始到nopt终止为扩增片段。用dnaman分析不能切开的酶有kpnⅰ、salⅰ，设计引物。
[0128]
表4 pfaj1702-flag-hnopt回补菌株引物序列
[0129][0130]
(2)用hnopt(f/r)扩增中华根瘤菌hh103全基因组，纯化产物后将puc57-flag载体和hnopt目标产物用kpnⅰ、salⅰ进行双酶切3-5h，酶切后进行产物纯化，连接16h后转入t1大肠杆菌中，菌液pcr验证后进行测序，命名为puc57-flag-hnopt；
[0131]
(3)用kpnⅰ、xbaⅰ双酶切puc57-flag-hnopt，pfaj1702，酶切后进行产物纯化，将带有flag标签的hnopt连接到pfaj1702，连接16h后转入t1大肠杆菌中，菌液pcr验证后进行测序，命名为pfaj1702-flag-hnopt；
[0132]
(4)通过三亲杂交的方法获得nopt的回补菌株，回补菌株被命名为hh103ωpfaj1702-flag-hnopt。
[0133]
hh103ωpfaj1702-flag-hnopt菌液pcr鉴定：利用引物hnopt(f/r)分别扩增hh103ωpfaj1702-flag-hnopt、hh103野生型，后者作为对照，通过电泳的方法，观察到目的条带。验证回补菌株hh103ωpfaj1702-flag-hnopt。
[0134]
突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的菌液pcr鉴定：分别用引物nopt-s-f-x、nopt-a-r-x和cm-f、cm-r以及nopt-s-f-x、cm-r对突变体hh103ωnopt液进行pcr鉴定。用引物
nopt-s-f-x和nopt-a-r-x扩增长度应该包含nopt-cm大片段，长度为3030p。用引物cm-f、cm-r扩增，证明扩增菌液包含抗生素片段，长度为960bp。用引物nopt-s-f-x和cm-r扩增长度应该包含抗生素片段与nopt上游片段，长度为2020p。最终筛选出突变体hh103ωnoptωnopcωnopl。扩增长度与理论相符。如图3所示。
[0135]
三基因突变体、双基因突变体、单基因突变体、回补菌株和野生型hh103的鉴定
[0136]
(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωnopt、hh103ωnopc、hh103ωnopl、hh103ωttsi和hh103ωpfaj1702-flag-hnopt；
[0137]
(2)大豆品种；染色体片段代换系(cssl)父本绥农14；
[0138]
(3)实验用品：缺氮植物营养液(1l包含mgso
4 0.5mol
·
l-1
、na2moo
4 0.2mmol
·
l-1
、mnso
4 2mmol
·
l-1
、h3bo
3 4mmol
·
l-1
、cacl
2 2mol
·
l-1
、coso
4 0.2mmol
·
l-1
、k2so
4 0.5mol
·
l-1
、cuso
4 4mmol
·
l-1
、kh2po
4 1mol
·
l-1
、znso
4 1mmol
·
l-1
和c6h5feo
7 20mmol
·
l-1
)，双层钵植物培养系统、植物房、蛭石、白石子、锥形瓶、注射器等。
[0139]
1)将大豆采用氯气灭菌法，过夜灭活表面细菌。
[0140]
2)把灭菌后的大豆种子取出，在干净无菌的环境下吹除表面氯气。
[0141]
3)灭过菌的种子种植在含有蛭石和营养液的双层钵中生长，每个双层钵种5粒大豆种子，种好种子的双层钵盖好盖子保墒。
[0142]
4)生长一段时间，在双层钵上层铺上灭菌的小石子，石子为植物保墒，并将双层钵放置在设定好温度的房间中生长并定期浇水。
[0143]
(2)植物接种菌液的获取：
[0144]
1)取出回补菌株、突变体菌株和野生型菌株，在无菌操作台中将三种菌株划在固体平板上，封好平板放入培养箱中培养长出菌斑后，挑取菌斑在液体培养基中活化。
[0145]
2)取100μl菌液于新鲜的ty液体培养基中，继续培养。
[0146]
3)取培养好的菌液离心，留下沉淀物，实验前配置好mgso4溶液并灭菌，用灭过菌的硫酸镁将沉淀吹起，这一操作重复三次。
[0147]
4)用灭菌后的硫酸镁吹起菌块，并活化菌液，至菌液活性最佳时接种植。
[0148]
5)植株接种菌液及根瘤性状的调查。
[0149]
菌液接种：双层钵中的大豆植株对生针叶展开时为最佳接种时机，将活化好的菌液用20ml注射器打入蛭石中，确保每个双层钵接种两毫升菌液，接种后大豆植株继续生长，一个月后调查大豆根部结瘤情况。
[0150]
根瘤性状调查方法：长成的大豆拔出植株，调查根瘤数量、每一株的根瘤用干净的离心管承装，并烘干根瘤称取根瘤干重。
[0151]
突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的southern blot鉴定：为验证突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的真实性，采用检测试剂盒和地高辛标记对突变体进行southern blot鉴定。对突变体hh103ωnopt和野生型根瘤菌hh103的基因组用xho i限制性内切酶酶切。选用内切酶时避免选用cm和目的基因内部的内切酶，以免将突变hh103ωnoptωnopcωnopl片段切碎影响验证结果。如图4所示，酶切后突变体hh103ωnoptωnopcωnopl片段比野生型根瘤菌hh103片段多大约1000bp多，即cm基因片段大小，验证突变体hh103ωnoptωnopcωnopl的准确性。扩增长度与理论相符。
[0152]
hh103ωpfaj1702-flag-hnopt获得：将pfaj1702-flag-hnopt、hh103ωnoptωnopcωnopl、helper三种菌液按2:1:1的比例混合，滴到无抗ty固体培养基平板上过夜培养，用灭过的枪头分多次刮取大斑，划线到含tet/rif/spec/km/cm(50mg/ml)抗性的ty固体培养基培养，直至长出单克隆；将单克隆继续划线筛选，重复3次；筛选到的回补菌株经pcr鉴定后命名为hh103ωpfaj1702-flag-hnopt。hh103ωpfaj1702-flag-hnopt的pcr鉴定：扩增的cds区，以hh103ωpfaj1702-flag-hnopt菌液为模板，用引物hnopt(f/r)进行菌液pcr验证，扩增长度与理论相符。如图5所示。
[0153]
利用以下实验验证实验效果：
[0154]
阳性根结瘤性状分析
[0155]
(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωnopt、hh103ωnopc、hh103ωnopl、hh103ωttsi
[0156]
(2)大豆品种；东农50
[0157]
(3)实验用品：缺氮植物营养液(1l包含mgso4 0.5mol
·
l-1、na2moo4 0.2mmol
·
l-1、mnso4 2mmol
·
l-1、h3bo3 4mmol
·
l-1、cacl2 2mol
·
l-1、coso4 0.2mmol
·
l-1、k2so4 0.5mol
·
l-1、cuso4 4mmol
·
l-1、kh2po4 1mol
·
l-1、znso4 1mmol
·
l-1和c6h5feo7 20mmol
·
l-1)，双层钵植物培养系统、植物房、蛭石、白石子、锥形瓶、注射器等。
[0158]
将野生型hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωnopt、hh103ωnopc、hh103ωnopl、hh103ωttsi接种空载体k599-psoyi转化根。
[0159]
三基因突变体、双基因突变体、单基因突变体、回补菌株和野生型hh103的结瘤鉴定接种sn14鉴定：对本实验室构建的导入系群体父本绥农14作为能力鉴定的材料，在双层钵植物生长营养系统中种植，在大豆根部分别接种快生型费氏中华根瘤菌hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωnopt、hh103ωnopc、hh103ωnopl、hh103ωttsi和hh103ωpfaj1702-flag-hnopt。接种一个月后对性状进行统计分析。如图6-8所示，hh103ωttsi(ttsi是所有效应因子缺失的涂突变体。作为对照菌)、两个单突变体hh103ωnopt、hh103ωnopc在的结瘤数目均有不同程度的减少，其中hh103ωnopc与野生型hh103相比减少结果最为显著；单基因突变体hh103ωnopl结瘤数目略有增加，但其显著性最小，说明nopl在cssl亲本绥农14中对共生结瘤的影响很小；双基因突变体hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt结瘤数目显著性减少，但是与单基因突变体hh103ωnopt、hh103ωnopc相比结瘤数目略有上调；三基因突变体hh103ωnoptωnopcωnopl结瘤数目同样减少，而且其减少结果最为显著。与中华根瘤菌hh103和ttsi相比，nopc突变能够引起根瘤数目的显著较少，也能够引起根瘤干重的显著降低。接种回补菌株hh103ωpfaj1702-flag-hnopt后，数目与干重均增加，但不超过中华根瘤菌hh103，这可能与内源基因的表达形式有关。nopc突变能够造成根瘤菌侵染和根瘤发育受到影响，说明根瘤菌ⅲ型效应因子nopc对于大豆-根瘤菌共生体系的正常建立是十分重要的。
[0160]
接种30份种质资源鉴定
[0161]
(1)菌株：快生型费氏中华根瘤菌hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωttsi；
[0162]
(2)大豆品种：30份种质资源(包括栽培种，农家种，地方种)；
[0163]
为了减少单一大豆品种对结果影响从而产生的片面性，我们将根瘤菌hh103、突变体hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωttsi接种30份种质资源，除了极个别材料产生的极值结果，其余材料均与绥农14的结瘤鉴定结果一致，结果如图9-图10所示。
[0164]
实施例4.减少大豆根瘤数量的试剂
[0165]
试剂的成分：突变体菌液。
[0166]
使用方法：(1)分别将hh103ωnoptωnopcωnopl、hh103ωnoplωnopc、hh103ωnoplωnopt、hh103ωnoptωnopc突变体进行培养活化，控制od600为0.65-0.86；
[0167]
(2)将步骤(1)得到的菌液进行4000rpm，10min离心，用10mm的硫酸镁溶液进行重悬洗菌重复4次；将硫酸镁溶液重悬后的菌液od
600
＝0.2；
[0168]
(3)大豆苗生长至对生真叶期，对大豆苗进行接菌，接菌数量为大于2
×
105个/株，培育接种菌液后的大豆30-40天。
[0169]
将结瘤数量过多的大豆品种使用的根瘤菌进行突变，降低结瘤数目，减少共生固氮消耗的能量，保证大豆产量。通过突变体调节接种根瘤菌在大豆上的结瘤数目，保证结瘤数目在合理范围内。