云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法。


背景技术：

2.云南牛蛭hirudinidea poecilobdella，属于颚蛭目(gnathobdellida)，医蛭科(hirudidae)，牛蛭属(hirudinaria whitman)。云南牛蛭为无脊椎软体动物，无骨架结构，全体均可以利用；主要成分是蛋白质、多肽、微量元素和脂肪酸素等。在内陆淡水水域内生长繁殖，是我国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后中医入药，具有治疗中风、高血压、清淤、闭经、跌打损伤等功效。
3.云南具有丰富的蛭类资源，在全国发现的相关物种中，云南蛭类占中国已知蛭类1/3以上，云南一些特有种为其它地方所罕见。近些年新发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效，因此该物种可为药用研究和物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持。线粒体基因组是生物重要的遗传物质，其中后生动物线粒体dna为典型的环状分子结构，长度大多在14-18kb之间，编码37个基因，包括13个蛋白质基因，22个trna以及12s rrna和16s rrna。线粒体dna是核外遗传物质，具有分子量小、结构简单、母系遗传等特点，成为生物多样性、群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记。鉴于目前该科类群遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量比较少，开展其线粒体基因组全序列的研究就显得十分必要。
4.目前扩增线粒体基因组全序列的方法大多采用引物步移法，通过对公共数据库中近缘物种线粒体基因组中保守区设计引物，对目标区域扩增序列并测序,对测序得到的序列再继续设计引物进行扩增测序，重复这一步骤直到测序得到的全部序列经拼接后获得完整线粒体基因组序列位置。以往的引物扩增反应后产物长度较短(400-500bp)，按照线粒体基因组大小15000bp计算，需要设计30对以上的引物来完成全部片段的扩增和有效拼接，费时费力，且反复扩增测序导致错误率升高，影响测序后的拼接结果和注释准确性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过筛选得到14对特异性引物，并用于扩增云南牛蛭线粒体全基因序列，这为云南牛蛭的药用研究、物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物，包括如下14对对引物对：
8.(1)第1对引物为如seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物；(2)第2对引物为如seq id no.3所示的上游引物和seq id no.4所示的下游引物；(3)第3对
引物为如seq id no.5所示的上游引物和seq id no.6所示的下游引物；(4)第4对引物为如seq id no.7所示的上游引物和seq id no.8所示的下游引物；(5)第5对引物为如seq id no.9所示的上游引物和seq id no.10所示的下游引物；(6)第6对引物为如seq id no.11所示的上游引物和seq id no.12所示的下游引物；(7)第7对引物为如seq id no.13所示的上游引物和seq id no.14所示的下游引物；(8)第8对引物为如seq id no.15所示的上游引物和seq id no.16所示的下游引物；(9)第9对引物为如seq id no.17所示的上游引物和seq id no.18所示的下游引物；(10)第10对引物为如seq id no.19所示的上游引物和seq id no.20所示的下游引物；(11)第11对引物为如seq id no.21所示的上游引物和seq id no.22所示的下游引物；(12)第12对引物为如seq id no.23所示的上游引物和seq id no.24所示的下游引物；(13)第13对引物为如seq id no.25所示的上游引物和seq id no.26所示的下游引物；(14)第14对引物为如seq id no.27所示的上游引物和seq id no.28所示的下游引物。
9.本发明还提供所述的扩增引物在云南牛蛭线粒体全基因组序列扩增中的应用。
10.本发明还提供一种利用所述的扩增引物扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的方法，包括以提取的云南牛蛭基因组dna为模板，利用所述的扩增引物进行pcr扩增，所得扩增产物进行琼脂糖电泳检测、测序。
11.优选的是，扩增反应体系包括：dna模板60ng、0.2-1.0μm引物各1.5μl，2.5mm dntp 8μl、10
×
pcr buffer 5μl、2.0mm mgcl
2 1μl、tap酶0.5μl，余量用无核酸酶水补齐50μl。
12.优选的是，扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
13.优选的是，所述扩增产物的核苷酸序列如seq id no.29所示。
14.本发明还提供一种扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的试剂盒，包括所述的扩增引物。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.(1)本发明针对云南地区的云南牛蛭设计了14对特异性引物，可以对云南牛蛭线粒体dna进行pcr扩增，并获得线粒体全长基因。本发明的扩增体系可以用更少的引物来完成目的片段的全覆盖，减少了扩增工作量，同时也降低了多次扩增反应造成的扩增错误的概率。
17.(2)牛蛭基因组目前可用的参考基因组较少，扩增方法每一对引物的反应条件都会有所不同，因此，对于这个类群生物的线粒体基因组的获得会非常有意义，该物种可为药用研究和物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持.
18.(3)本发明首次获得云南牛蛭线粒体基因组全长序列，经分析得出：序列全长14667bp，包括13个蛋白质编码基因、22个trna基因和2个rrna基因。
附图说明
19.图1表示云南牛蛭8对特异性引物的电泳图(dl2000 plus dna marker)；
20.图2表示云南牛蛭6对特异性引物的电泳图(dl5000 dna marker)。
具体实施方式
21.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
22.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
23.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
24.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
25.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
26.实施例1
27.1、材料与方法
28.1.1实验材料获取
29.云南牛蛭标本采自云南地区，活体样本采集后立即浸泡如无水乙醇，-20℃保存备用。
30.1.2dna提取
31.采用组织细胞基因组dna快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)，对组织样品进行dna提取，提取完成后，将基因组进行凝胶电泳，检测其质量合格后进行后续实验。
32.具体操作步骤如下：
33.(1)将需要提取的样品剪碎,或者在液氮中研磨组织成细粉后,转入装有180μl组织裂解液tl的1.5ml离心管中，用大口径枪头吹打混匀。
34.(2)加入20μl的蛋白酶k(20mg/ml),立刻涡旋振荡充分混匀。
35.(3)将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
36.(4)加20μl rnase a(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。
37.(5)加入200μl结合液cb，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。
38.(6)冷却后加入100μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
39.(7)用1ml的枪头吸取混合物，将混合物加入一个吸附柱ac中，(将吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
40.(8)加入500μl抑制物去除液ir，12000rpm离心30秒，弃废液。
41.(9)加入600μl漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃废液。
42.(10)加入600μl漂洗液wb，12000rpm离心30秒，弃废液。
43.(11)将吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。
44.(12)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。
45.1.3引物设计与pcr扩增
46.1.3.1引物设计
47.根据genbank收录的云南牛蛭近源物种线粒体基因组特定区域信息设计特异性引物，特异性引物由长沙市墨比迪科生物科技有限公司合成，共14对，引物特性、目标扩增区域及扩增范围见下表1所示。
48.表1 引物序列
49.[0050][0051]
1.3.2 pcr扩增
[0052]
本实验中涉及长片段扩增，为保证扩增保真度及长度，在体系中使用长片段taq酶(la-pcr taq polymerase)进行扩增。
[0053]
pcr的反应体系为50μl，其中：60ng dna模板、0.2-1.0μm引物各1.5μl、2.5mm dntp 8μl、10
×
pcr buffer 5μl、2.0mm mgcl
2 1μl、tap酶0.5μl，余量用无核酸酶水补齐。
[0054]
pcr扩增条件为：94℃预变性2min，然后经94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
[0055]
pcr产物电泳检测：称量1g琼脂糖加入500ml1
×
tae缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热至琼脂粉完全溶解且无泡沫，冷却至50-60℃左右加入7μl核酸染料gelview，轻轻摇匀避免产生气泡。待冷却至不烫手时将胶缓缓倒入胶槽内,待琼脂糖凝胶完全凝固后：竖直拔掉梳子，将5μl云南牛蛭dna样本与1μl 6
×
dna loading buffer混合后依次上样，最后点上6μl dl2000marker后开始电泳。电泳电压设定为120v，电流300ma，时间30min。电泳完毕在凝胶成像系统照相，通过调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片。结果如图1-2所示，每对引物都能扩增出清晰、特异性的条带。
[0056]
1.4序列测定与拼接
[0057]
1.4.1序列测定
[0058]
将上一步电泳检测条带大小符合预期、带型单一的产物送公司测序，测序引物为片段扩增引物，双向测通，最终确定针对基因组中特定序列能够获得稳定扩增产物且条带清晰的引物共14对，引物特征如下：
[0059]
(1)第1对上游引物为：seq id no.1所示的核苷酸序列(gaagctcatgaaattgaaac)，下游引物为：seq id no.2所示的核苷酸序列(ccacaaatttctgaacattg)；
[0060]
(2)第2对上游引物为：seq id no.3所示的核苷酸序列(cattcttgaactgtgcctag)，
下游引物为：seq id no.4所示的核苷酸序列(gaactacgtctcgtcatcac)；
[0061]
(3)第3对上游引物为：seq id no.5所示的核苷酸序列(gtagaacctagaccatgacc)，下游引物为：seq id no.6所示的核苷酸序列(caaaatgtcaatatcaagctg)；
[0062]
(4)第4对上游引物为：seq id no.7所示的核苷酸序列(ctggttttcatggagttcatg)，下游引物为：seq id no.8所示的核苷酸序列(ctatcaaatattgaatttgag)；
[0063]
(5)第5对上游引物为：seq id no.9所示的核苷酸序列(tgttgcattaagacctaatc)，下游引物为：seq id no.10所示的核苷酸序列(tgttgcattaagacctaatc)；
[0064]
(6)第6对上游引物为：seq id no.11所示的核苷酸序列(ctttctcaaattcaatatttg)，下游引物为：seq id no.12所示的核苷酸序列(ggtataatgaaatgcagtga)；
[0065]
(7)第7对上游引物为：seq id no.13所示的核苷酸序列(agattctgaggagctactgt)，下游引物为：seq id no.14所示的核苷酸序列(cttgacacccaccaattcagg)；
[0066]
(8)第8对上游引物为：seq id no.15所示的核苷酸序列(cagtttaccattatgtaatttttg)，下游引物为：seq id no.16所示的核苷酸序列(cataaatgaaaaggatatattgg)；
[0067]
(9)第9对上游引物为：seq id no.17所示的核苷酸序列(tgaggttatcaaccagaacg)，下游引物为：seq id no.18所示的核苷酸序列(gccgaagatctaaaagcatg)；
[0068]
(10)第10对上游引物为：seq id no.19所示的核苷酸序列(catcagtaagtcacatgggt)，下游引物为：seq id no.20所示的核苷酸序列(gtatctaatccttgttttac)；
[0069]
(11)第11对上游引物为：seq id no.21所示的核苷酸序列(tgtgccagcagcagcggtta)，下游引物为：seq id no.22所示的核苷酸序列(gagtgacgggcgatttgtac)；
[0070]
(12)第12对上游引物为：seq id no.23所示的核苷酸序列(agtgcagtctatagtaatgg)，下游引物为：seq id no.24所示的核苷酸序列(cgattagcatataacttctg)；
[0071]
(13)第13对上游引物为：seq id no.25所示的核苷酸序列(cgtaccttttgcattatggg)，下游引物为：seq id no.26所示的核苷酸序列(cgccggtctgaactcaactc)；
[0072]
(14)第14对上游引物为：seq id no.27所示的核苷酸序列(ggagcgtgagattaagttac)，下游引物为：seq id no.28所示的核苷酸序列(caatatcattggtgacctac)。
[0073]
1.4.2序列拼接与分析
[0074]
测序所得各片段直接运用geneious r11软件进行拼接和基因注释，ncbi在线多序列比对。
[0075]
2、结果
[0076]
经geneious r11软件分析可知，云南牛蛭线粒体全基因组序列见seq id no.29所示的核苷酸序列。该线粒体基因组长度为14667bp，全基因组序列包含2个核糖体rna基因，13个不含内含子的蛋白质编码基因，22个转运rna基因。
[0077]
云南牛蛭的具体线粒体基因组结构如下表2所示：
[0078]
表2 云南牛蛭的具体线粒体基因组结构
[0079]
[0080]
[0081][0082]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。