一种斑疹伤寒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种斑疹伤寒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

背景技术：

1、斑疹伤寒(typhus)，是由立克次体引起的传染病，可分为：流行性斑疹伤寒、丛林斑疹伤寒(恙虫病)与地方性斑疹伤寒(鼠型斑疹伤寒)。症状包括发烧、头痛和皮疹。症状通常在接触病原体后一至两周出现。

2、斑疹伤寒是一种由螨虫传播的传染病，该病的一个特征是患者表现出非特异性症状，包括发热、头痛、肌痛、咳嗽和腹痛等，这些症状与其他全身感染的症状无法区分。焦痂的存在有助于诊断这种疾病；然而，它仅在某些患者中发现。虽然斑疹伤寒的临床病程通常较轻且具有自限性，但严重时延误治疗可导致肾功能衰竭、心肌炎、脑膜脑炎等并发症，甚至死亡。由于斑疹伤寒是流行地区急性未分化发热性疾病(aufi)的最常见原因之一，因此早期明确的诊断对于提供适当的治疗和收集准确的流行病学数据至关重要。

3、斑疹伤寒诊断主要依靠血清学检测，尤其是间接免疫荧光检测(ifa)，通过对血清中抗体滴度增加4倍和/或单个血清样本中igm滴度阳性来识别疾病。然而，这些血清学检测需要血清样本和良好的技术专业知识，即便如此，它们也经常在疾病的早期阶段返回假阴性。此外，不同斑疹伤寒菌株的再感染在流行地区并不少见，并且再感染的患者有时可能表现出高滴度的igg和igm，因此血清学检测无法区分这些患者的急性感染和既往感染。在此背景下，实时荧光定量pcr等分子技术可用于确认血清学结果

4、对于斑疹伤寒的核酸检测，市场现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理，本技术人基于该问题，经过数年研发，与在先申请cn202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备carryon p1000q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qpcr分析系统”，可在60分钟内完成新冠病毒的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本技术即在该技术的基础上，进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类发明，即斑疹伤寒检测的微流控芯片试剂盒。

5、现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的斑疹伤寒检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的上述问题，本技术提供了一种斑疹伤寒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明所述的引物探针检测斑疹伤寒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种检测斑疹伤寒的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测丛林斑疹伤寒scrub typhus的引物探针组合物、检测地方性斑疹伤寒murinetyphus的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。

4、具体地，所述的检测丛林斑疹伤寒scrub typhus的引物探针组合物为scrubtyphus引物探针组合物；

5、所述的检测地方性斑疹伤寒murine typhus的引物探针组合物为murine typhus引物探针组合物；

6、具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为ipc引物探针组合物。

7、进一步具体地，

8、(1)所述的scrub typhus引物探针组合物为：

9、f(seq id no:1)：5'-aagccattagtattgattgctga-3'；

10、r(seq id no:2)：5'-aaggcacctggttttgg-3'；

11、p(seq id no:3)：5'-atatcaatgcagtaagagcttctccgtc-3'；

12、(2)所述的murine typhus引物探针组合物为：

13、f(seq id no:4)：5'-aatgtctgagagttataaaacgcaa-3'；

14、r(seq id no:5)：5'-tgattgagcataaaactgccc-3'；

15、p(seq id no:6)：5'-ctattatgaggtgacgtagctggcatacg-3'；

16、(3)所述的ipc引物探针组合物为：

17、f(seq id no:7)：5'-agttgcagtgtaaccgtcatgta-3'；

18、r(seq id no:8)：5'-tcgacgagactctgctgttaa-3'；

19、p(seq id no:9)：5'-cagtaatctgcgtcgcacgtgtgca-3'。

20、具体地，所述的scrub typhus引物探针组合物用于检测丛林斑疹伤寒scrubtyphus的eae基因。

21、具体地，所述的murine typhus引物探针组合物用于检测地方性斑疹伤寒murinetyphus的crispr位点基因序列。

22、具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为cy3、cy5、cy5.5、fam、hex、vic、joe或rox中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

23、进一步具体地，所述的检测丛林斑疹伤寒scrub typhus的探针用fam标记，所述的检测地方性斑疹伤寒murine typhus的探针用hex标记，所述的检测内参ipc的探针用cy5标记。

24、另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测斑疹伤寒产品中的应用。

25、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

26、又一方面，本发明提供了一种检测斑疹伤寒的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。

27、具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。

28、具体地，所述的产品还包括纯化试剂、冻干ipc质控品和冻干试剂。

29、进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

30、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品的序列为seq id no:10。

31、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品是dna质粒。

32、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、2-羟丙基-β-环糊精、牛血清白蛋白、消泡剂、tris-hcl ph8.0、nacl、tween20。

33、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

34、进一步具体地，所述的冻干反应试剂包括脂多糖和羟丙基甲基纤维素。

35、进一步具体地，所述的冻干反应试剂还包括甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸dntps、kcl、tris-hcl ph9.0、mgcl2、tween20。

36、又一方面，本发明还提供了一种检测斑疹伤寒的微流控芯片试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。

37、具体地，所述的产品还包括纯化试剂、冻干ipc质控品和冻干试剂。

38、进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和triton x-100，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2-2.5，所述的磁珠为干化磁珠。

39、进一步具体地，所述的裂解液包括6m盐酸胍、0.4m ph 4.7醋酸钠和2％triton x-100，所述的洗脱液包括10mm ph8.5 tris-hcl。

40、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品的序列为seq id no:10。

41、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品是dna质粒。

42、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、2-羟丙基-β-环糊精、牛血清白蛋白、消泡剂、tris-hcl ph8.0、nacl、tween20。

43、进一步具体地，所述的冻干ipc质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

44、进一步具体地，所述的冻干试剂包括脂多糖和羟丙基甲基纤维素。

45、进一步具体地，所述的冻干试剂还包括甘露醇、海藻糖、普鲁兰多糖、2-羟丙基-β-环糊精、脱氧核糖核酸聚合酶、牛血清白蛋白、消泡剂、脱氧核苷三磷酸dntps、kcl、tris-hcl ph9.0、mgcl2、tween20。

46、具体地，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

47、具体地，所述的微流控芯片试剂盒可用于carryon p1000q快速核酸检测设备。

48、又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物、产品或试剂盒在检测斑疹伤寒中的应用。

49、又一方面，本发明提供了一种检测斑疹伤寒的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物、产品或试剂盒对待测样本中斑疹伤寒进行检测。

50、具体地，所述的方法包括以下步骤：

51、(1)提取样本的dna并采用上述纯化试剂进行纯化；

52、(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本dna；

53、(3)对扩增结果进行分析。

54、进一步具体地，上述步骤采用carryon p1000q快速核酸检测设备，在微流控一体化芯片上进行。

55、与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：

56、(1)采用本发明提供的引物探针组合物同时检测丛林斑疹伤寒scrub typhus、地方性斑疹伤寒murine typhus，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。

57、(2)利用一体化芯片上微流控的方式解决病原体快速检测的问题，实现“样本进-结果出”的poct检测方案，取样后直接加入设备，集成核酸的提取、纯化、扩增和检测，60分钟内出结果。