一种ZIF-8抗菌机制的研究方法与流程

一种zif-8抗菌机制的研究方法
技术领域
1.本发明涉及zif-8纳米粒子抗菌研究技术领域，具体为一种zif-8抗菌 机制的研究方法。


背景技术：

2.众所周知，近年来，细菌感染已成为人类健康的主要威胁。细菌感染最 常见和有效的方法是抗生素治疗。但抗生素的不合理使用导致耐药菌的爆发， 对临床细菌感染的治疗构成巨大威胁。由于新抗生素的开发远远滞后于细菌 耐药性的演变，迫切需要针对细菌感染制定替代治疗策略，以缓解细菌耐药 性问题。随着全球细菌耐药性、动物源性食品安全问题日益严重以及抗生素 使用监管的不断加强，研发新型药物替代抗生素迫在眉睫。作为抗耐药细菌 感染的竞争性替代药物，多功能纳米抗菌剂因其耐药可忽略、侵袭性小、全 身毒性风险低、选择性高而备受关注，而mof材料已成为抗菌应用的研究热 点。zif-8纳米粒子是mofs的一个亚类，是由锌离子和2-甲基咪唑组成的一 种多孔材料，具有分散性好、比表面积大、多孔性好、合成方便等优点，广 泛应用于组织工程、给药、抗菌治疗、脱盐、油水分离等应用领域。zif-8中 有机偶联剂和zn2+具有抗菌活性，决定了zif-8在抗菌领域具有广阔的发展 前景。虽然对zif-8的抗菌研究很多，但都是以zif-8为载体进行的。对zif-8 的抗菌研究较少，抗菌机理一直不清楚。
3.目前对zif-8的抑菌机理的研究都是假设的，mof材料的抑菌机理可能与 zif-8对细菌细胞活性的影响有关，细菌周围离子性质的改变；离子通道的破 坏；细胞代谢过程的重组；各种酶的作用受到抑制，导致细菌死亡，到目前 为止，还没有具体的抗菌机理的报道，因此需要新的、更全面的方法来解释 其抗菌机理。
4.本专利以mrsa为代表，提供一种研究zif-8纳米粒子抗菌机制的方法， 主要通过检测与膜损伤相关指标的变化和扫描电镜观察，并进一步检测转录 组学和代谢组学，根据转录组学和代谢组学的结果进行生物信息学分析阐述 zif-8纳米粒子的抗菌机制。


技术实现要素：

5.(一)解决的技术问题
6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效、快捷表征zif-8纳米粒 子抗菌机制的方法。
7.(二)技术方案
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种zif-8抗菌机制的研 究方法，包括以下步骤：
9.步骤1:扫描电镜观察zif-8处理细菌后细菌细胞膜的变化，zif-8与细 菌共孵育后，8000rpm离心10min，pbs洗3次后，加入2.5％戊二醛4
°
固定 过夜，菌体经梯度酒精脱水后，干燥喷金后扫描观察；
10.步骤2：细菌β-半乳糖苷酶含量的变化检测，mrsa过夜培养后离心，pbs 重悬后，不
同浓度zif-8与细菌共孵育后，取上清液100μl，加入终浓度为 3mmol/l的邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)，37℃孵育30min后测定溶 液在420nm的吸光值；
11.步骤3：细菌膜电位的变化检测，mrsa培养后离心，hepes洗涤3次后重 悬，加入disc3(5)至0.5μm进行荧光探针的装载，37℃孵育15min后，加 入90μl至96孔板中，再加入10μlzif-8(终浓度分别为0、25、50、100和 200μg/ml)与细菌共孵育后，用多功能酶标仪m5测定激发波长622nm，发射 波长670nm的荧光值；
12.步骤4：细菌胞内atp的变化检测，mrsa培养后，pbs重悬后,加入不同 的zif-8(0、25、50、100和200μg/ml)处理后，离心收集细菌细胞，每管加 入200ul裂解液，充分涡动以裂解细胞，裂解后4c,12,000g离心5分钟，取 上清，分别加入100ulatp检测工作液到96孔酶标板中，室温放置3-5分钟， 加入20ul不同浓度的标准品及样品，迅速用枪混匀，用化学发光仪液闪仪测 定rlu值；
13.步骤5：细菌呼吸链复合酶变化的检测，mrsa过夜培养后离心，pbs重悬 后，zif-8终浓度分别为0、25、50、100和200μg/ml与细菌共孵育后，8000rpm 离心10min，pbs洗3次后，使用呼吸链复合体活性检测试剂盒；
14.步骤6：转录组学和代谢组学检测，mrsa在37℃的bhi培养基中接种， 200rpm/min振荡3h，然后在含有100ul/mlzif-8的bhi培养基中接种，在37℃ 的培养基中200rpm/min振荡4h，进行转录组学和代谢组学数据生物信息学分 析。
15.进一步的，本发明改进有，上述步骤1中菌体用一系列梯度乙醇的浓度 是50％时为10min，60％时为10min，70％时为10min，80％时为10min，90％时为 10min，95％时为10min，100％时为10min。
16.进一步的，本发明改进有，步骤1中zif-8与细菌共孵育的时间为2h， 之后8000rpm离心10min。
17.进一步的，本发明改进有，上述步骤2中zif-8与细菌共孵育的时间为 2h，之后8000rpm离心10min。
18.进一步的，本发明改进有，上述步骤3中zif-8与细菌共孵育的时间为 2h，之后8000rpm离心10min。
19.进一步的，本发明改进有，上述步骤4中zif-8与细菌共孵育的时间为 2h，之后8000rpm离心10min。
20.进一步的，本发明改进有，上述步骤5中，zif-8处理mrsa后，转录组 学对差异基因进行go注释分析和pathway富集分析。
21.(三)有益效果
22.与现有技术相比，本发明提供了一种zif-8抗菌机制的研究方法，具备 以下有益效果：
23.该zif-8抗菌机制的研究方法，zif-8处理细菌后，金黄色葡萄球菌的表 面凹陷、皱缩，细胞膜破裂，说明细菌细胞膜损伤严重，进一步测定了zif-8 处理细菌细胞后，细胞膜通透性的变化，膜电位的变化以及胞内atp的变化， 利用β-半乳糖苷酶评估了其整个细胞膜的通透性,β-半乳糖苷酶主要存在 于细胞内，只有整个细胞膜破坏后才能被检测到，随着zif-8作用剂量的升 高，β-半乳糖苷酶的水平有显著的提高，而膜电位和胞内atp的水平都的荧 光值升高表明细胞膜电位降低，atp减少，这些结果表明，zif-8引起细菌atp 减
少，进一步影响膜电位的丧失，进而可以破坏细菌的细胞膜，最终引起细 菌细胞死亡，为了进一步了解zif-8是如何引起细菌细胞膜电位丧失的，检 测细菌呼吸链复合酶活性，zif-8处理细菌后，细菌呼吸链复合酶ⅰ和细菌呼 吸链复合酶ⅱ收到抑制，说明zif-8可以通过抑制细菌呼吸链复合酶ⅰ和
ⅱꢀ
的活性，进一步引起细菌膜电位的丧失，多个基因影响草酰乙酸的形成，而 草酰乙酸为tca重要的物质，直接影响能量代谢异常，从而导致细菌死亡， 利用较为简单的方法及表征手段直观、准确的反映zif-8纳米粒子抗菌过程， 为zif-8纳米粒子在抗菌研究及其应用提供一定的参考价值。
附图说明
24.图1为zif-8纳米粒子与mrsa作用后的扫描电镜图；
25.图2为zif-8纳米粒子与mrsa作用后β-半乳糖苷酶含量的变化情况；
26.图3为zif-8纳米粒子与mrsa作用后膜电位的变化情况；
27.图4为zif-8纳米粒子与mrsa作用后胞内atp的变化情况；
28.图5为zif-8纳米粒子与mrsa作用后呼吸链复合酶的变化情况；
29.图6为zif-8处理mrsa后，对差异基因进行go注释分析示意图；
30.图7为zif-8处理mrsa后，对差异基因进行kegg富集分析示意图；
31.图8为zif-8处理mrsa后，差异代谢物的kegg富集分析示意图。图9为zif-8处理mrsa后，tca循环的转录基因与代谢产物的相关性分 析。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.请参阅图1-8，本发明为一种zif-8抗菌机制的研究方法，包括以下步骤：
34.步骤1:扫描电镜观察zif-8处理细菌后细菌细胞膜的变化，zif-8与细 菌共孵育后，8000rpm离心10min，pbs洗3次后，加入2.5％戊二醛4
°
固定 过夜，菌体经梯度酒精脱水后，干燥喷金后扫描观察；
35.步骤2：细菌β-半乳糖苷酶含量的变化检测，mrsa过夜培养后离心，pbs 重悬后，不同浓度zif-8与细菌共孵育后，取上清液100μl，加入终浓度为 3mmol/l的邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)，37℃孵育30min后测定溶 液在420nm的吸光值；
36.步骤3：细菌膜电位的变化检测，mrsa培养后离心，hepes洗涤3次后重 悬，加入disc3(5)至0.5μm进行荧光探针的装载，37℃孵育15min后，加 入90μl至96孔板中，再加入10μlzif-8(终浓度分别为0、25、50、100和 200μg/ml)与细菌共孵育后，用多功能酶标仪m5测定激发波长622nm，发射 波长670nm的荧光值；
37.步骤4：细菌胞内atp的变化检测，mrsa培养后，pbs重悬后,加入不同 的zif-8(0、25、50、100和200μg/ml)处理后，离心收集细菌细胞，每管加 入200ul裂解液，充分涡动以裂解细胞，裂解后4c,12,000g离心5分钟，取 上清，分别加入100ulatp检测工作液到96孔酶标板中，室温放置3-5分钟， 加入20ul不同浓度的标准品及样品，迅速用枪混匀，用化学发光
仪液闪仪测 定rlu值；
38.步骤5：细菌呼吸链复合酶变化的检测，mrsa过夜培养后离心，pbs重悬 后，zif-8终浓度分别为0、25、50、100和200μg/ml与细菌共孵育后，8000rpm 离心10min，pbs洗3次后，使用呼吸链复合体活性检测试剂盒；
39.步骤6：转录组学和代谢组学检测，mrsa在37℃的bhi培养基中接种， 200rpm/min振荡3h，然后在含有100ul/mlzif-8的bhi培养基中接种，在37℃ 的培养基中200rpm/min振荡4h，进行转录组学和代谢组学数据生物信息学分 析。
40.进一步的，上述步骤1中菌体用一系列梯度乙醇的浓度是50％时为10min， 60％时为10min，70％时为10min，80％时为10min，90％时为10min，95％时为10min， 100％时为10min。
41.进一步的，步骤1中zif-8与细菌共孵育的时间为2h，之后8000rpm离 心10min。
42.进一步的，上述步骤2中zif-8与细菌共孵育的时间为2h，之后8000rpm 离心10min。
43.进一步的，上述步骤3中zif-8与细菌共孵育的时间为2h，之后8000rpm 离心10min。
44.进一步的，上述步骤4中zif-8与细菌共孵育的时间为2h，之后8000rpm 离心10min。
45.进一步的，上述步骤5中，zif-8处理mrsa后，转录组学对差异基因进 行go注释分析和pathway富集分析。
46.综上所述，该zif-8抗菌机制的研究方法，在使用时，扫描电镜观察zif-8 处理细菌后细菌细胞膜的变化，zif-8与细菌共孵育后，8000rpm离心10min， pbs洗3次后，加入2.5％戊二醛4
°
固定过夜，菌体经梯度酒精脱水后，干燥 喷金后扫描观察，细菌β-半乳糖苷酶含量的变化检测，mrsa过夜培养后离心， pbs重悬后，不同浓度zif-8与细菌共孵育后，取上清液100μl，加入终浓度 为3mmol/l的邻硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)，37℃孵育30min后测定 溶液在420nm的吸光值，细菌膜电位的变化检测，mrsa培养后离心，hepes 洗涤3次后重悬，加入disc3(5)至0.5μm进行荧光探针的装载，37℃孵育 15min后，加入90μl至96孔板中，再加入10μlzif-8(终浓度分别为0、25、 50、100和200μg/ml)与细菌共孵育后，用多功能酶标仪m5测定激发波长 622nm，发射波长670nm的荧光值，细菌胞内atp的变化检测，mrsa培养后， pbs重悬后,加入不同的zif-8(0、25、50、100和200μg/ml)处理后，离心收 集细菌细胞，每管加入200ul裂解液，充分涡动以裂解细胞，裂解后4c,12,000g 离心5分钟，取上清，分别加入100ulatp检测工作液到96孔酶标板中，室 温放置3-5分钟，加入20ul不同浓度的标准品及样品，迅速用枪混匀，用化 学发光仪液闪仪测定rlu值，细菌呼吸链复合酶变化的检测，mrsa过夜培养 后离心，pbs重悬后，zif-8终浓度分别为0、25、50、100和200μg/ml与细 菌共孵育后，8000rpm离心10min，pbs洗3次后，使用呼吸链复合体活性检 测试剂盒，转录组学和代谢组学检测，mrsa在37℃的bhi培养基中接种， 200rpm/min振荡3h，然后在含有100ul/mlzif-8的bhi培养基中接种，在37℃ 的培养基中200rpm/min振荡4h，进行转录组学和代谢组学数据生物信息学分 析，通过图1可知，zif-8处理细菌后，金黄色葡萄球菌的表面凹陷、皱缩， 细胞膜破裂，说明细菌细胞膜损伤严重，测定了zif-8处理细菌细胞后，细 胞膜通透性的变化，膜电位的变化以及胞内atp的变化，如图2所示，我们 首先利用β-半乳
糖苷酶评估了其整个细胞膜的通透性,β-半乳糖苷酶主要 存在于细胞内，只有整个细胞膜破坏后才能被检测到，发现随着zif-8作用 剂量的升高，β-半乳糖苷酶的水平(图2)有显著的提高，而膜电位(图3) 和胞内atp的水平(图4)都的荧光值升高表明细胞膜电位降低，atp减少， 这些结果表明，zif-8引起细菌atp减少，进一步影响膜电位的丧失，进而可 以破坏细菌的细胞膜，最终引起细菌细胞死亡，为了进一步了解zif-8是如 何引起细菌细胞膜电位丧失的，检测细菌呼吸链复合酶活性，如图5所示， zif-8处理细菌后，细菌呼吸链复合酶ⅰ和细菌呼吸链复合酶ⅱ收到抑制，说 明zif-8可以通过抑制细菌呼吸链复合酶ⅰ和ⅱ的活性，进一步引起细菌膜 电位的丧失，通过图6说明，zif-8处理细菌后，大量基因出现变化，对差异 基因进行go注释分析，细菌细胞膜完整性、转录、atp结合、dna结合、金 属离子结合等方面受到影响，差异基因kegg富集分析(图7)说明tca循环 影响最大，为此，进一步检测了zif-8处理细菌后细菌代谢组学研究，对差 异代谢物进行kegg富集分析(图8)，tca循环收到影响，进一步将tca循环 相关的基因与代谢产物进行关联分析，图9结果显示，多个基因影响草酰乙 酸的形成，而草酰乙酸为tca重要的物质，直接影响能量代谢异常，从而导 致细菌死亡，表明zif-8通过影响草酰乙酸，进一步tca循环障碍，从而抑 制细菌呼吸链复合酶，导致膜电位异常，引起细胞膜损伤，导致内容物外泄， 从而导致细菌死亡。
47.为详细说明本技术可能的应用场景，技术原理，可实施的具体方案，能 实现目的与效果等，以下结合所列举的具体实施例并配合附图详予说明。本 文所记载的实施例仅用于更加清楚地说明本技术的技术方案，因此只作为示 例，而不能以此来限制本技术的保护范围。
48.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。