一种可识别核微丝结构的nAC荧光探针小鼠模型及其应用

一种可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型及其应用，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.由于细胞核内的微丝数量远少于胞质微丝，经典的鬼笔环肽染色很难区分两者，且鬼笔环肽无法对活细胞的核微丝骨架进行染色。actin chromobody是一类可以特异性识别单体肌动蛋白(g-actin)的纳米抗体。有研究者将actin chromobody和荧光报告蛋白citrine以及可将重组蛋白转运至细胞核内的核定位序列(nuclear localization signal，nls)整合成actin-chromobody-citrine-1
×
nls(nac)序列并克隆至慢病毒质粒上，通过慢病毒感染的形式使目的细胞过量表达nac荧光探针，从而识别细胞核内的单体肌动蛋白和核微丝。此方法相较于鬼笔环肽，可对活细胞进行染色，有助于观察核微丝这一高度动态变化的细胞骨架类型。然而，过往研究发现病毒感染有可能会导致核微丝骨架的形成。通过慢病毒对细胞系进行感染有可能会产生假阳性，从而不利于研究结果的解读。
3.在细胞系内过表达可以识别核微丝的探针，这些细胞系无法模拟生理状态下细胞核微丝的存在及表达情况。这些细胞系与生理状态下具备三维结构的原代细胞的形态学有明显的差异，因此在生理状态下可能会存在不同的核微丝形态。此外，一些原代细胞或肿瘤细胞系的探针转染效率非常低，使得对此类细胞核微丝相关的研究陷入困境。


技术实现要素：

4.本发明旨在利用crispr/cas9技术，构建可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型，利用该小鼠模型与cre工具鼠杂交后得到可在全身组织或特定组织内表达识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠，用于研究核微丝骨架结构在原代细胞生理状况下的功能和核微丝骨架在肿瘤微环境中浸润细胞中的作用。
5.为了达到上述目的，本发明提供了用于构建可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型的组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括：
6.针对小鼠rosa26位点的grna，所述grna的序列为ggggacacactaagggagcttgg；
7.包含3.3kb 5’同源臂、cag-lsl-actin-chromobody-citrine-1
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nls基因片段和3.3kb 3’同源臂的同源重组载体；
8.针对5’同源臂重组鉴定引物及针对3’同源臂重组鉴定引物，所述5’同源臂重组鉴定引物包括序列为gccgggcctcgtcgtctg的正向引物和序列为tgagggcaatctgggaaggtt的反向引物；所述3’同源臂重组鉴定引物包括序列为gggggaggggagtgttgc的正向引物和序列为ttcttcctgcctgccttctgtgac的反向引物。
9.本发明还提供了一种可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型的构建方法，利用crispr/cas9技术构建nac荧光探针的rosa26定点敲入小鼠模型，具体如下步骤：
10.步骤1：通过体外转录获得cas9 mrna和grna，通过in-fusion cloning的方法构建
同源重组载体(donor vector)；基于cre-loxp诱导表达系统通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体，该同源重组载体载体包含3.3kb 5’同源臂、cag-lsl-actin-chromobody-citrine-1
×
nls基因片段和3.3kb 3’同源臂；所述grna的序列为ggggacacactaagggagcttgg；
11.步骤2：显微共注射与f0代小鼠获得：将cas9 mrna、grna和同源重组载体显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，待小鼠出生后，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，得到f0代嵌合体小鼠；
12.步骤3：f1代阳性小鼠获得：将f0代嵌合体小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配，繁育获得f1代小鼠，通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定，得到f1代阳性杂合子小鼠rosa26
lsl/+
，完成可稳定传代小鼠模型的构建。
13.本发明还提供了一种小鼠模型，所述小鼠模型包括f1代阳性杂合子小鼠模型rosa26
lsl/+
，f1代阳性小鼠之间经交配繁育得到的f2代杂合子或纯合子小鼠模型，f1代阳性小鼠或f2代阳性小鼠与不同的cre小鼠品系交配繁育得到的小鼠模型。所述的cre小鼠品系包括全身细胞表达cre重组酶的cre工具小鼠或组织特异性cre工具小鼠。其中，组织特异性cre工具小鼠指的是带有组织特异性基因启动子的cre工具小鼠，特定的cre工具鼠可以在组织特异性基因启动子调控下表达组织特异性cre重组酶。
14.优选地，所述小鼠模型中具有核微丝结构的细胞或组织可通过荧光检测工具或方法进行识别。
15.本发明还提供了上述的构建方法构建得到的小鼠模型或上述的小鼠模型在识别具有核微丝骨架结构的组织或细胞中的应用。
16.优选地，所述细胞包括黑色素瘤细胞。
17.本发明还提供了上述的构建方法构建得到的小鼠模型或上述的小鼠模型在不同病理条件下研究细胞核微丝骨架的功能及其作用机制中的应用。
18.优选地，包括用于研究核微丝骨架结构在原代细胞生理状况下的功能或核微丝骨架在肿瘤微环境中浸润细胞中的作用。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
20.(1)本发明利用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在rosa26基因位点定点插入cag-lsl-actin-chromobody-citrine-1
×
nls表达框以获得目标小鼠模型；该小鼠模型可在所有细胞中稳定表达可识别核微丝的荧光探针，为研究在生理状态下具有核微丝骨架的细胞类型及其生物学功能奠定了基础。
21.(2)本发明的小鼠模型，可以在生理条件下探索具有细胞核微丝骨架的细胞类型，此外，基于本发明的小鼠模型，可根据实验的不同需要，与不同的cre小鼠交配即可获得在不同组织特异性表达核微丝荧光探针的小鼠，而结合不同的疾病模型小鼠，可在不同病理条件下研究细胞核微丝骨架的功能及其作用机制。
附图说明
22.图1为本发明的rosa26定点r26-e(cag-lsl-nac)1基因条件性过表达小鼠模型的构建方法示意图；
23.图2为同源重组载体质粒图谱；
24.图3为f0代小鼠鉴定方法流程示意图；
25.图4为同源重组阳性f0代小鼠pcr鉴定电泳图；其中，数字为f0代小鼠编号；wt为野生型对照；m为1kb dna marker；
26.图5为f1代小鼠5’同源臂和3’同源臂pcr鉴定电泳图；其中，数字为f1代小鼠编号；wt为野生型对照；m为1kb dna ladder；
27.图6为f1代小鼠pcr产物测序验证示意图；
28.图7为通过荧光共聚焦显微镜在小鼠心脏组织中观察到的具有核微丝骨架结构的细胞，40x：40倍，200x：200倍，dapi为指示细胞核的染料，nac指示具有核微丝骨架的细胞核，merge指示dapi和nac的共定位情况；
29.图8为通过荧光共聚焦显微镜在小鼠肺组织中观察到的具有核微丝骨架结构的细胞，40x：40倍，200x：200倍，dapi为指示细胞核的染料，nac指示具有核微丝骨架的细胞核，merge指示dapi和nac的共定位情况；
30.图9为通过荧光共聚焦显微镜在小鼠肾脏组织中观察到的具有核微丝骨架结构的细胞，40x：40倍，200x：200倍，dapi为指示细胞核的染料，nac指示具有核微丝骨架的细胞核，merge指示dapi和nac的共定位情况；
31.图10为通过荧光共聚焦显微镜在小鼠肌肉组织中观察到的具有核微丝骨架结构的细胞，40x：40倍，200x：200倍，dapi为指示细胞核的染料，nac指示具有核微丝骨架的细胞核，merge指示dapi和nac的共定位情况；
32.图11为为通过荧光共聚焦显微镜在黑色素瘤微环境中观察到的具有核微丝骨架结构的细胞，200x：200倍，dapi为指示细胞核的染料，nac指示具有核微丝骨架的细胞核，merge指示dapi和nac的共定位情况。
具体实施方式
33.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
34.以下实施例中，primestar gxl购于takara公司(宝日医生物技术有限公司)，货号：r050a；目的序列actin-chromobody-citrine-1xnls(nac序列)如seq id no:1所示：
35.atggctcaggtgcagctggtggagtctgggggaggactgacgcaggcagggggctctctgagactctcctgtgcaacctctggactaatcttcagtgcctttggcatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtaggaggtattaactggaggggtagtacaaactatggagacttcgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtatttgcagatgaacaacctgaaacctgaggacacggccgtttattactgcgcagcacgtatggttcacaaaaccgagtatgactattggggcgaggggacccaggtcaccgtctcctcaagaagcttaggtggaggaggttctggaggcggtggaagtggtggcggaggtagcggtggaggaggttctatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactacca
gcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaaggggccgcctaagaaaaagcggaaggtgtaa。
36.以下实施例中如无特殊说明，所采用的试剂和生物材料均来源于市售。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
37.实施例1
38.本实施例提供了一种可识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
39.采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方式，在rosa26基因位点定点插入cag-lsl-actin-chromobody-citrine-1xnls表达框以获得目标小鼠模型(rosa26定点r26-e(cag-lsl-nac)1基因条件性过表达小鼠模型)，流程如图1所示：
40.(1)通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna，其中，grna的序列如表1所示；通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，获得的同源重组载体质粒图谱如图2所示，该载体包含3.3kb 5’同源臂、cag-lsl-actin-chromobody-citrine-1
×
nls-wpre-polya基因片段和3.3kb 3’同源臂。
41.表1 grna序列
42.序列名称序列(5
’‑3’
) grnaggggacacactaagggagcttggseq id no：2
43.(2)f0代阳性小鼠获得：将cas9 mrna、grna和donor vector显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为f0代小鼠。通过pcr扩增及测序对其进行基因型鉴定。
44.f0代小鼠鉴定方法流程如图3所示，具体方案为：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.4kb片段，阴性基因组应扩增出5.1kb片段；3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.6kb片段，阴性基因组应扩增出6.5kb片段；
45.其中，5’同源臂重组阳性f0代小鼠pcr鉴定引物如表2所示，pcr鉴定反应体系如表3所示，pcr鉴定反应条件如表4所示：
46.表2 5’同源臂鉴定引物
47.序列名称序列(5'-3') 正向引物(primer i)gccgggcctcgtcgtctgseq id no：3反向引物(primer ii)tgagggcaatctgggaaggttseq id no：4
48.表3 5’同源臂鉴定pcr反应体系
4683min重复步骤2～4进行35个循环5685min-612-hold
60.鉴定结果为：双臂同源重组阳性的f0代小鼠为8号，长片段pcr鉴定电泳结果如图4所示。
61.(3)f1代阳性小鼠获得：由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的f0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的f1代小鼠。将f0代阳性小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配，繁育获得f1代小鼠，通过pcr鉴定及测序对其进行基因型鉴定，pcr鉴定策略及方法同f0代小鼠鉴定部分，f1代小鼠5’和3’同源臂pcr鉴定电泳结果如图5所示。pcr鉴定f1代阳性小鼠为：1、4、23、24、25、26、27号。f1代阳性小鼠pcr鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，如图6所示。其中，5’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1、2；3’同源臂鉴定，pcr产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3、4；经测序确认均为阳性。
62.后续小鼠繁殖策略如下：
63.条件性过表达杂合子f1代阳性小鼠，简写为：rosa26
lsl/+
，杂合的f1代rosa26
lsl/+
雌雄小鼠交配可获得条件性过表达纯合子小鼠或杂合子小鼠(f2代)，纯合子小鼠简写为rosa26
lsl/lsl
，f2代杂合小鼠和纯合小鼠的鉴定方法同上。
64.阳性小鼠可通过与不同的cre小鼠品系交配，实现目的基因的广泛表达、特定组织或者细胞类型表达。后续小鼠的表型分析中，如实验组选择条件性过表达纯合子且cre阳性小鼠(简写为：rosa26
lsl/lsl
:cre)，则对照组应为条件性过表达纯合子且cre阴性小鼠(简写为：rosa26
lsl/lsl
)；如实验组选择条件性过表达杂合子且cre阳性小鼠(简写为：rosa26
lsl/+
:cre)，则对照组应为条件性过表达杂合子且cre阴性小鼠(简写为：rosa26
lsl/+
)；也可以将rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠和rosa26
lsl/+
:cre小鼠均作为实验组，两者表型相互比较，将rosa26
lsl/lsl
和rosa26
lsl/+
作为对照组。理论上，rosa26
lsl/+
:cre和rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠在目的基因的表达量上有差异，rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠的目的基因表达量应更高，表型可能更明显。
65.获得rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠可有两种繁育方法选择：
66.一种方法是将获得的rosa26
lsl/+
:cre小鼠与rosa26
lsl/+
交配，获得rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/8)和rosa26
lsl/lsl
小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/8)，以及rosa
26lsl/+
:cre小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)和rosa26
lsl/+
小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)；
67.一种方法是将获得的rosa26
lsl/+
:cre小鼠与rosa26
lsl/lsl
交配，获得rosa26
lsl/lsl
:cre小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)和rosa26
lsl/lsl
小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)，以及rosa26
lsl/+
:cre小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)和rosa26
lsl/+
小鼠(该小鼠所占后代比例为：1/4)。
68.实施例2
69.本实施例提供了在全身组织或特定组织中表达识别核微丝结构的nac荧光探针小鼠模型的构建：
70.1、按照实施例1的方法获得f1阳性杂合子小鼠rosa26
lsl/+
；
71.2、在全身组织或特定组织中表达识别核微丝的nac荧光探针小鼠的获得：将f1代nac杂合子小鼠和可在全身细胞表达的dppa3-cre小鼠(通过上海南方模式生物科技公司购入)进行杂交，使nac荧光探针在f2代小鼠全身细胞进行表达。通过对各组织(心脏，肺，肾脏，肌肉等)进行冰冻切片，并通过荧光共聚焦显微镜在40倍(40x)和200倍(200x)进行观察，可以看到各组织内部都有不同比例的具有核微丝骨架结构的细胞，如图7-10所示。因此，该小鼠模型可以与不同组织特异性表达的cre小鼠进行杂交，以应用于研究核微丝骨架结构在原代细胞生理状况下的功能。
72.同时，对该f2代小鼠皮下注射黑色素瘤b16f10细胞系，在肿瘤微环境中，也发现了来源于nac宿主的具有核微丝结构的浸润细胞，如图11所示，这有助于研究核微丝骨架在肿瘤微环境中浸润细胞中的作用。
73.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。