一种诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基及制备、培养方法与流程

1.本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种用于诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基及其制备和培养方法。


背景技术：

2.金耳子实体是金耳菌（naematelia aurantialba（bandoni & m. zang）millanes & wedin）与毛韧革菌（sterem hirsutum (willd．) fr．）共同形成的金黄色脑状子实体。金耳属于异质复合体，隶属于耳包革科（naemateliaceae x.z. liu, f.y. bai, m. groenew. & boekhout），耳包革属（naematelia fr.）。金耳为二型态真菌，即在环境的影响下其存在酵母型及菌丝型两种型态。在通常情况下，金耳子实体弹射的担孢子在普通培养基上（如：pda、cym、马铃薯综合培养基、马铃薯蔗糖培养基、玉米粉综合培养基、周氏培养基等使用的大量食用菌常用培养基）不能萌发转化为菌丝，而是以芽殖的方式不断形成酵母状芽孢菌落。目前仅有刘正南的研究工作中提到金耳芽孢在木屑、棉籽壳等代料栽培基质、适宜的温湿度下能萌发出洁白、细弱的金耳型菌丝体，但未表明培养基配方以及培养方法等。所以目前尚未见如何诱导金耳菌芽孢向菌丝转化的相关报道，这一问题极大地影响了金耳的基础生物学研究，造成了对金耳菌交配系统研究的困难，不能清楚了解金耳菌的有性生殖过程，将会导致金耳育种相应滞后，无法对金耳进行杂交育种等问题。
3.参考文献可见：[1]杨林雷,李荣春,曹瑶,等.金耳的学名及分类地位考证[j].食药用菌,2020,28(04):252-255+276.[2]田云霞,童江云,汪威,等.银耳属伴生现象研究进展[j].食用菌,2019,41(04):1-3.[3]刘正南,郑淑芳.金耳的生理特性及有效优良菌种的制备原理[j].中国食用菌,1995(05):10-11.。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种可诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基及其培养方法，以及利用所述培养基诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的方法。
[0005]
本发明采取的技术方案如下：一种诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基，制备所述培养基的原料及质量为：金耳出菇包菌渣100 g-200 g、琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g、水1 l。
[0006]
进一步地，所述金耳出菇包菌渣为金耳第一茬菇采收后无污染的干净菌渣，菌渣含水量为33%-38%。
[0007]
本发明所述诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基的制作方法如下：（1）选取刚采摘完金耳子实体后无污染的干净菌包，将菌包中菌渣打碎；（2）称取打碎后的菌渣100 g-200 g，放入水中，小火煮20 min，过滤后取滤液1 l；
（3）称取琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g，加入到滤液中融化后装瓶进行灭菌，得到培养基；（4）将培养基分装至培养皿中即可。
[0008]
进一步地，上述步骤（4）中，将培养基分装至直径9cm的培养皿中，每皿15 ml培养基。
[0009]
采用本发明所述的培养基诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的方法，是将金耳菌酵母状芽孢接种至所述培养基内，置于21 ℃～25℃恒温恒湿培养箱中避光培养12～15 d即可。
[0010]
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种能够成功诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基，通过这一培养基能够实现金耳这一二型态真菌的酵母状分生孢子与菌丝之间的相互转换，使金耳菌酵母状芽孢能在培养12～15天的时间内萌发出菌丝，解决了目前金耳菌只能大量以酵母状芽孢无限芽殖，而不能轻易萌发菌丝的问题，对金耳后续基础生物学研究工作具有重大意义。同时，金耳菌渣也能被有效地进行二次利用，并且培养基原料来源充足，培养基制作简单、便捷，制备成本低。
附图说明
[0011]
图1为jsj-f1芽孢于pda培养基上的生长情况；图2为jsj-f1芽孢于马铃薯综合培养基上的生长情况；图3为jsj-f1芽孢于cym培养基上的生长情况；图4为jsj-f1芽孢于玉米粉综合培养基上的生长情况；图5为jsj-f1芽孢于周氏培养基上的生长情况；图6为 jsj-f1芽孢于本发明培养基上的生长情况；图7为jsj-f1芽孢于本发明培养基上萌发菌丝的its结果；图8 为its序列与ncbi比对结果。
具体实施方式
[0012]
下面将结合具体实施例对本发明的内容进行清楚、完整的描述。
[0013]
实施例1诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基，制备所述培养基的原料及质量为：金耳出菇包菌渣200 g、琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g、水1 l。所述金耳出菇包菌渣为金耳第一茬菇采收后无污染的干净菌渣，菌渣含水量为35%。
[0014]
培养基的制作方法如下：（1）选取刚采摘完金耳子实体后无污染的干净菌包，将菌包中菌渣打碎。金耳出菇菌包的配方为棉籽壳38.9％、杂木屑40％、麦麸20％、石膏粉1％、kh2po
4 0.1％，含水率62％；（2）称取打碎后的菌渣200 g，放入水中，小火煮20 min，过滤后取滤液1 l；（3）称取琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g，加入到滤液中加热融化，装瓶于121 ℃灭菌30 min，得到培养基；（4）将培养基分装至直径9cm的培养皿中，每皿15 ml培养基，冷却后待用。
[0015]
采用上述培养基诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的方法如下：
（1）收集金耳菌担孢子：金耳菌担孢子从云南菌视界生物科技有限公司生产的新鲜金耳子实体收集所得。将新鲜金耳子实体利用无菌水冲洗干净后放至超净工作台，吹干子实体表面残留水分，利用悬钩法收集到金耳子实体担孢子后与无菌水混合制作孢子悬浮液；（2）获取金耳菌酵母状芽孢：将孢子悬浮液接种至pda培养基中，置于20℃恒温恒湿培养箱暗培养，获得金耳酵母状芽孢，命名为jsj-f1芽孢；（3）将金耳菌酵母状芽孢（jsj-f1芽孢）接种至所述培养基内，封口后放至23℃恒温恒湿培养箱内进行暗培养14 d，即得到金耳菌芽孢萌发的菌丝。
[0016]
萌发菌丝的its鉴定：将接种芽孢后成功诱导出的菌丝挑取至离心管中，根据试剂盒提取dna（百泰克生物科技有限公司真菌基因组dna提取试剂盒）。使用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物its1（5，-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和its4（5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’）分别为正向、反向引物进行pcr扩增，pcr反应扩增总体系为50ul：混合mix：25ul，ddh2o：22ul，its1、its4各1ul，dna模板：1ul。混匀后，于pcr仪中进行扩增反应，pcr扩增程序为：94℃—5min，94℃—30s，56℃—45s，72℃—1min，35个循环，72℃—10min，4℃—不限时间。将pcr扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，得到一条483 bp左右的序列，见图7。提交ncbi进行blast，其序列片段与genbank中tremella aurantialba同源性为97.26%～98.69%，见图8。因此，所属物种鉴定为金耳菌。
[0017]
图1为jsj-f1芽孢于pda培养基上的生长情况，图2为jsj-f1芽孢于马铃薯综合培养基上的生长情况，图3为jsj-f1芽孢于cym培养基上的生长情况，图4为jsj-f1芽孢于玉米粉综合培养基上的生长情况，图5为jsj-f1芽孢于周氏培养基上的生长情况，图6为 jsj-f1芽孢于本发明培养基上的生长情况。从图1~图5可以看到，jsj-f1芽孢于传统的各类培养基上都未能萌发菌丝，只能以芽殖的方式无限繁殖生成大量的酵母状芽孢。而从图6中可清楚地看到，jsj-f1芽孢在本发明的培养基上，芽孢周围能萌发出菌丝。证明本发明的培养基能够成功诱导金耳菌芽孢萌发菌丝，从而可以解决目前金耳菌只能大量以酵母状芽孢无限芽殖，而不能轻易萌发菌丝的问题。
[0018]
实施例2诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基，制备所述培养基的原料及质量为：金耳出菇包菌渣100 g、琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g、水1 l。所述金耳出菇包菌渣为金耳第一茬菇采收后无污染的干净菌渣，菌渣含水量为33%。
[0019]
培养基的制作方法如下：（1）选取刚采摘完金耳子实体后无污染的干净菌包，将菌包中菌渣打碎；（2）称取打碎后的菌渣100 g，放入水中，小火煮20 min，过滤后取滤液1 l；（3）称取琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g，加入到滤液中加热融化，装瓶于123 ℃灭菌30 min，得到培养基；（4）将培养基分装至直径9cm的培养皿中，每皿15 ml培养基，冷却后待用。
[0020]
采用上述培养基诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的方法如下：（1）收集金耳菌担孢子：金耳菌担孢子从云南菌视界生物科技有限公司生产的新鲜金耳子实体收集所得。将新鲜金耳子实体利用无菌水冲洗干净后放至超净工作台，吹干
子实体表面残留水分，利用悬钩法收集到金耳子实体担孢子后与无菌水混合制作孢子悬浮液；（2）获取金耳菌酵母状芽孢：将孢子悬浮液接种至pda培养基中，置于21℃恒温恒湿培养箱暗培养，获得金耳酵母状芽孢；（3）将金耳菌酵母状芽孢接种至所述培养基内，封口后放至21℃恒温恒湿培养箱内进行暗培养15 d，即得到金耳菌芽孢萌发的菌丝。
[0021]
实施例3诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的培养基，制备所述培养基的原料及质量为：金耳出菇包菌渣150 g、琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g、水1 l。所述金耳出菇包菌渣为金耳第一茬菇采收后无污染的干净菌渣，菌渣含水量为38%。
[0022]
培养基的制作方法如下：（1）选取刚采摘完金耳子实体后无污染的干净菌包，将菌包中菌渣打碎；（2）称取打碎后的菌渣150 g，放入水中，小火煮20 min，过滤后取滤液1 l；（3）称取琼脂25 g、磷酸二氢钾1.24 g、硫酸镁0.71 g，加入到滤液中加热融化，装瓶于123 ℃灭菌30 min，得到培养基；（4）将培养基分装至直径9cm的培养皿中，每皿15 ml培养基，冷却后待用。
[0023]
采用上述培养基诱导金耳菌芽孢萌发菌丝的方法如下：（1）收集金耳菌担孢子：金耳菌担孢子从云南菌视界生物科技有限公司生产的新鲜金耳子实体收集所得。将新鲜金耳子实体利用无菌水冲洗干净后放至超净工作台，吹干子实体表面残留水分，利用悬钩法收集到金耳子实体担孢子后与无菌水混合制作孢子悬浮液；（2）获取金耳菌酵母状芽孢：将孢子悬浮液接种至pda培养基中，置于20℃恒温恒湿培养箱暗培养，获得金耳酵母状芽孢；（3）将金耳菌酵母状芽孢接种至所述培养基内，封口后放至25℃恒温恒湿培养箱内进行暗培养12 d，即得到金耳菌芽孢萌发的菌丝。
[0024]
除非另有说明，本发明所述百分数均为质量百分数。