一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖水平为特征的衰弱性疾病，预计到2045年，这种疾病的全球流行率将达到7亿成年人。1型和2型糖尿病（t1d、t2d）分别以自身免疫破坏和渐进性功能障碍为特征，最终患者体内胰岛β细胞耗竭，从而失去产生胰岛素的能力。目前，两种糖尿病的常规治疗方式均采用外源性胰岛素的注射。然而，由于无法确保在正常生理范围内严格保持葡萄糖水平，患者往往面临危及生命的低血糖症、高血糖症，以及心血管疾病、肾衰竭和神经病变等并发症，严重影响患者的生活质量。另一方面，与胰岛素疗法相比，尽管胰岛细胞移植可实现更好的血糖控制；但由于供体匮乏、价格高昂等因素，使得该技术难以广泛应用。基于近年来胚胎发育学与干细胞生物学的迅速发展，基于人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hpsc）的体外定向分化技术有了长足的进步。使用hpsc作为种子细胞，在体外可源源不断地诱导分化为具备功能的细胞类型；因而一举克服了来源受限的难题，在转化医学领域应用前景巨大。目前，效率较高的胰腺祖细胞技术方法有：1）在分化第三阶段（后前肠）将细胞消化为单细胞，再以聚集体的形式继续分化（cell aggregation optimizes the differentiation of human escs and ipscs into pancreatic bud-like progenitor cells, stem cell research,2015,14(2):185-197；controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro, embo journal,2015,34(13):1759-1772），这种方法虽然大幅提高了pdx1
+
nkx6.1
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胰腺祖细胞的分化效率（》80%），但操作步骤繁琐，涉及到3d悬浮培养，成本高；2）分化第一阶段（定型内胚层诱导）结束后，将其消化为单细胞并重新接种，最后可获得纯度约80%的胰腺祖细胞（enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing pdx1 and nkx6.1, stem cell research and therapy,2018,9:15; highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing pdx1 and nkx6.1, methods in molecular biology,2020），该方法虽全程采用2d分化，但中间要转板的步骤增加了操作难度，而增加了额外matrigel的使用带来的成本增加。此外，这两种方法的诱导时间耗时较长，大于14天，而其他分化方案的诱导效率均在55%左右（reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells, nature biotechnology,2014,32:1121-1133; generation of functional human pancreatic β cells in vitro, cell,2014,159(2):428-439）。另外，现有方法在不同批次间的稳定性也较差。因此，在hpsc向胰岛β细胞定向分化方面，诱导效率低与批次间稳定性差是阻碍应用的2个重要原因。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明旨在提出一种胰腺祖细胞、其构建方法及其应用，聚焦于β细胞定向分化技术流程的前半部分，提高“hpsc
→
胰岛祖细胞”定向分化技术中的诱导效率与稳定性。使用该方法，不仅诱导效率高，且不同批次间稳定性好，不同hpsc间兼容性高，另具备分化耗时短、成本低、操作简单的优势。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：一种胰腺祖细胞的构建方法，该方法包括如下步骤：s0：分化前，将人多能干细胞以0.2
×
10
6-1
×
106个细胞/cm2的密度接种于matrigel包被的细胞培养板，matrigel稀释倍数为70-100倍，达到分化要求后启动分化；s1：使用浓度阶梯降低的acta逐步诱导步骤s0得到的人多能干细胞分化形成定型内胚层；s2：诱导定型内胚层分化为原始肠管；s3：诱导原始肠管分化为后前肠；s4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞。
5.进一步，步骤s1中分化天数至少2天，第1天acta的浓度为150-110ng/ml，后续每一天的acta浓度分别根据前一天使用浓度降低5-20ng/ml。
6.进一步，步骤s1中分化天数为3天，第1天至第3天依次使用120ng/ml rhacta、110ng/ml rhacta和100ng/ml rhacta进行诱导培养。
7.进一步，步骤s1中诱导培养基包括培养基a、培养基b和培养基c，培养基a、培养基b和培养基c均包括基础培养基和添加组分，培养基a中的添加组分为120ng/ml的rhacta、3μm的chir99021，培养基b中的添加组分为110ng/ml的rhacta，培养基c中的添加组分为100ng/ml的rhacta。
8.进一步，基础培养基为含有3-10mm glucose、1-2g/l nahco3、体积占比为0.1-0.3%的bsa-不含脂肪酸和体积占比为1%的glutamax的mcdb131培养基。
9.进一步，步骤s0在进行细胞接种之前，先将人多能干细胞制成单细胞悬液，且单细胞悬液中添加有rock抑制剂。
10.进一步，步骤s2在含有rhfgf7的培养基中诱导培养2-3天，步骤s3在含有rhfgf7、ra、sant1、decursin和ml347的培养基中诱导培养2-3天，步骤s4在含有rhegf、nic、sant1、decursin和ml347培养基中诱导培养3-4天。
11.本发明还提供了一种由上述任一项所述的方法构建的胰腺祖细胞。
12.本发明还提供了一种如上述所述的胰腺祖细胞在诱导产生胰岛β细胞上的应用。
13.本发明还提供了一种用于上述方法的试剂盒，包括：步骤s1使用的阶梯浓度的acta；步骤s2使用的rhfgf7；步骤s3使用的rhfgf7、ra、sant1、decursin和ml347；步骤s4使用的rhegf、nic、sant1、decursin和ml347。
14.相对于现有技术，本发明所述的具有以下优势：本发明所述的胰腺祖细胞的构建方法是一种完全基于2d培养胰腺祖细胞定向分化方法，不仅诱导效率高，大于90%，且不同批次间稳定性好，不同hpsc间兼容性高，短诱导
周期，仅需10天即可获得高纯度胰腺祖细胞；无血清诱导体系，成分明确可控；全2d操作系统成本低，操作简单。
附图说明
15.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为胰腺祖细胞的诱导分化阶段示意图；图2为hpsc的多能性免疫荧光鉴定结果图；（a）为dapi染色结果，用以表征细胞核；（b）为oct4染色结果，（c）为nanog染色结果，（d）为dapi+oct4+nanog染色结果堆叠；图3为第0天（d0或day 0）分化起始前明场图；图4为s1阶段第3天（d3或day 3）形成的定型内胚层明场图；图5为s2阶段第5天（d5或day 5）形成的原始肠管明场图；图6为s3阶段第7天（d7或day 7）形成的后前肠明场图；图7为s4阶段第10天（d10或day 10）形成的胰腺祖细胞明场图；图8为s4阶段第10天（d10或day 10）免疫荧光鉴定结果图；（a）为dapi染色结果，用以表征细胞核；（b）为pdx1
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染色结果，（c）为nkx6.1
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染色结果，（d）为dapi+pdx1
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+nkx6.1
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染色结果堆叠；图9为s4阶段第10天（d10或day 10）流式鉴定结果图；图10为细胞株ⅰ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为s1阶段分化图，（b）为s2阶段分化图，（c）为s3阶段分化图，（d）为s4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；图11为细胞株ⅱ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为s1阶段分化图，（b）为s2阶段分化图，（c）为s3阶段分化图，（d）为s4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；图12为细胞株ⅲ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图及免疫荧光鉴定结果图；（a）为s1阶段分化图，（b）为s2阶段分化图，（c）为s3阶段分化图，（d）为s4阶段分化图，（e）为免疫荧光鉴定结果图；图13为细胞株ⅰ、细胞株ⅱ、细胞株ⅲ和细胞株ⅳ表达pdx1
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nkx6.1
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的细胞占比图；细胞株ⅳ即本实施例使用的细胞株；图14为对比例1低密度组第10天（d10或day 10）流式鉴定结果图；图15为对比例1低密度组第10天（d10或day 10）免疫荧光结果图；（a）为dapi染色结果，用以表征细胞核；（b）为pdx1
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染色结果，（c）为nkx6.1
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染色结果，（d）为dapi+pdx1
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+nkx6.1
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染色结果堆叠；图16为对比例2与第0天（d0或day 0）、本实施例在s1阶段诱导效率；（a）为标志物foxa2的表达，（b）为标志物sox17的表达；图17为对比例3取自不同细胞株的细胞采用不同浓度matrigel包被后表达pdx1
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nkx6.1
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的细胞占比图。
具体实施方式
16.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
17.定形内胚层：指胚胎发育早期肝脏、小肠、大肠等内脏器官主要组成细胞的原始发育位点。
18.后肠管衍生物（或肠管前部衍生物）：肠管（gut tube）指胚胎发育早期由定形内胚层发育而来的条形组织。
19.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
20.然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。
21.实施例中用到的相关试剂示于表1和表2，使用的相关抗体示于表3。
22.分化前，从多能性标志物阳性率检验hpsc的质量，以确保后续分化的成功率与高效率。
23.如图2免疫荧光鉴定结果所示，（a）图为dapi染色结果，用以表征细胞核；（b）图为oct4染色结果，（c）图为nanog染色结果，（d）图为dapi+oct4+nanog染色结果堆叠，用以判断正确表达模式下的双阳性率（由于oct4定位于细胞核，因此双阳性的判断还要看是否在细胞核上）。多能性标志物oct4与nanog在表达模式正确的前提下，双阳性率＞98%；表明hpsc具备良好的分化潜能。
24.本方法的关键在于：1）通过高密度接种hpscs准备分化板，使细胞的生长始终处于一种高度挤压的状态，这对本方法最终的成功至关重要；2）同时本方法采用matrigel作为细胞外基质，稀释倍数限制在70-100倍，使得胶的硬度在合适范围内；3）另外，acta的浓度对第一阶段定型内胚层的形成至关重要，本方法采用梯度降低acta浓度的方式高效产生定型内胚层。在同时满足以上关键步骤的前提下产生的胰腺祖细胞，pdx1
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nkx6.1
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双阳性细胞效率稳定在90%以上，以上三个关键步骤的组合对于本方案成功实施缺一不可。
25.图1为胰腺祖细胞的诱导分化阶段示意图，具体分化方法包括如下步骤：本方法整体分为4个阶段，历时10天。
26.s0：待hpscs汇合度达80%～90%后，使用tryple酶消散为单细胞悬液，离心后重悬于补充有10μm y-27632的mtesr1培养基，并以0.5
×
106个细胞/cm2的密度接种于matrigel包被的细胞培养板，matrigel稀释倍数限制在70倍，24小时后汇合度达90%～100%启动分化，如图3所示。
27.s1：诱导hpsc分化定形内胚层（day 1-3）该阶段基础培养基如下：mcdb131培养基补充5mm glucose、1.2g/l nahco3、体积占比为0.1% bsa（不含脂肪酸）以及体积占比为1% glutamax。
28.day 1:将上述人多能干细胞在培养基a中培养1天，培养基a包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：120ng/ml rhacta、3μm chir99021；day 2:之后将上述细胞转移至培养基b中继续培养1天，培养基b包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：110ng/ml rhacta；day 3:之后将上述细胞转移至培养基c中继续培养1天，培养基c包括上述基础培养基及添加组分，添加组分包括：100ng/ml rhacta。
29.s2：诱导定型内胚层分化为原始肠管（day 4-5）
将s1分化成功的细胞继续在培养基d中培养2天，培养基d包括基础培养基及添加组分，基础培养基为mcdb131培养基补充5mm glucose、1.2g/l nahco3、体积占比为0.1% bsa（不含脂肪酸）、体积占比为1% glutamax以及0.25 mm vc，添加组分包括：50ng/ml rhfgf7。
30.在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
31.s3：诱导原始肠管分化为后前肠（day 6-7）将上述细胞继续在培养基e中培养2天，培养基e包括基础培养基及添加组分，基础培养基为mcdb131培养基补充3mm glucose、2g/l nahco3、体积占比为2% bsa（不含脂肪酸）、体积占比为1% glutamax、体积占比为1% p/s以及0.25mm vc，添加组分包括：50ng/ml rhfgf7、2μm ra、0.25μm sant1、20μm decursin、25μm ml347。
32.在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
33.s4：诱导后前肠分化为胰腺祖细胞（day 8-10）该阶段培养基f包括基础培养基及添加组分，基础培养基在阶段s3的基础上加体积占比为1%的b27，添加组分包括：100ng/ml rhegf、10mm nic、0.25μm sant1、20μm decursin、25μm ml347。
34.在培养期间，每24h更换新的分化培养基。
35.在本实施例方案提供的s0阶段准备分化板和s1阶段诱导定型内胚层的基础下，将第s1、s2阶段的bsa更换为等量血清可获得相近的效果，但引入了血清中的不明成分。
36.在本实施例方案提供的s0阶段准备分化板和s1阶段诱导定型内胚层的基础下，适当调整各阶段的天数可获得相近的结果，比如，s1阶段加减一天，s2、s3、s4阶段加一天，尽管稳定性不如本方案好。
37.本实施例中s1阶段acta在第一天的浓度范围锁定在150-110ng/ml，之后第2、3天的浓度范围使用浓度依次降低5-20ng/ml，为梯度降低。浓度可以不等间距变化，但是要比前一天至少低5ng/ml，否则细胞由于acta浓度持续处于高水平而生长速度缓慢，最终达不到胰腺祖细胞诱导的必要条件：细胞持续处于高度挤压状态。若是降的太多，大于20ng/ml，定型内胚层的诱导效率降低。
38.对比例1将hpsc以0.8
×
105个细胞/cm2的密度进行接种，设定为低密度组，其他条件与本实施例相同，当其汇合度达90%～100%启动分化。
39.对比例2在上述实施例的基础上，第一阶段3天分化使用的rhacta浓度始终保持100ng/ml。
40.对比例3为了证明该方法的兼容性，另取与本实施例所用细胞株不同株的3个细胞株，即细胞株1、细胞株2、细胞株3，而本实施例的细胞是从细胞株4中挑取的，细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4均购自北京塞贝生物技术有限公司。
41.从细胞株1、细胞株2和细胞株3中分别挑取细胞，并标记为细胞株ⅰ、细胞株ⅱ、细胞株ⅲ，重复上述诱导分化过程。本实施例从细胞株4中挑取的细胞标记为细胞株ⅳ。
42.对比例4在上述实施例的基础上，改变matrigel的包被浓度，稀释倍数分别为50、70、100、
110。分别从上述的细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4中各挑取4份细胞，并将这些细胞分别对应标记为细胞株
ⅴ
、细胞株ⅵ、细胞株ⅶ和细胞株
ⅷ
；将这些细胞分为4个组，每一组中均包含细胞株
ⅴ
、细胞株ⅵ、细胞株ⅶ和细胞株
ⅷ
，之后分别对这4个组采用不同稀释倍数的matrigel进行包被，稀释倍数依次为50、70、100、110。
43.结果分析：1、s1阶段完成，即3天后细胞群呈现内胚层典型特点，并且由于细胞密度不断增大，第3天出现隆起，如图4。s2阶段完成，即第5天，此时细胞出现典型的条状隆起，如图5。继续加入s3阶段分化培养基，此阶段结束后，即第7天，细胞又恢复平滑的单层，如图6所示。更换为s4阶段培养基，直到该阶段结束，即第10天，细胞始终维持平滑的单层生长状态，如图7所示。
44.2、图8为第10天得到的胰腺祖细胞的免疫荧光鉴定结果，其中，（a）图为dapi染色结果，用以表征细胞核；（b）图为pdx1
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染色结果，图（c）为nkx6.1
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染色结果，图（d）为dapi+pdx1
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+nkx6.1
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染色结果堆叠，结果证明pdx1
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nkx6.1
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双阳细胞的效率在s4阶段结束后达90%以上。图9为流式鉴定结果，也可以看出pdx1
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nkx6.1
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双阳细胞的效率达90%以上。
45.3、如图10-图12所示，图10为细胞株ⅰ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图，图10中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图；图11为细胞株ⅱ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图，图11中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图；图12为细胞株ⅲ分别在s1阶段、s2阶段、s3阶段和s4阶段的分化图，图12中（e）图为其免疫荧光鉴定结果图。
46.图13为分别从细胞株1、细胞株2、细胞株3和细胞株4中挑取的细胞（即细胞株ⅰ、细胞株ⅱ、细胞株ⅲ和细胞株ⅳ）并按照上述实施例的方法进行诱导培养后所表达pdx1
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nkx6.1
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的细胞占比图。
47.从图10-图13中可以发现，本方法在不同细胞株上获得了高度一致的结果，说明该方法在不同hpsc间兼容性高，不同批次间稳定性好。
48.4、在进行细胞培养时，细胞接种数对细胞的生长有直接影响，适宜的接种密度可以促使细胞更好的增殖，接种密度太高或太低都不利于细胞的生长增殖，细胞正常的接种密度为0.5
×
10
5-0.8
×
105个细胞/cm2。对比例1采用的接种密度是常规的密度，图14为对比例1低密度组第10天（d10）流式鉴定结果图，可以发现按照常规密度接种的对比例1得到的胰腺祖细胞的pdx1
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nkx6.1
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双阳细胞的比例大幅下降至57%。图15免疫荧光结果图也可以看出pdx1
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nkx6.1
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双阳细胞明显变少。
49.5、通过对比例2的比较结果图16中可以看出，s1阶段不采用梯度浓度，s1阶段定型内胚层的诱导效率大幅降低，说明梯度浓度培养方式对定型内胚层的诱导效率至关重要。
50.6、matrigel在使用时一般需要进行稀释，常规稀释倍数在30-50倍。图17为4组细胞分别在稀释倍数为50、70、100、110的matrigel包被下培养后的结果，从图17中可以看出，当matrigel的稀释倍数若在70～100倍之外，该方案的兼容性明显变差，分化效率也低下。
51.通过对比例的比较可以发现，高密度接种、限制matrigel包被浓度以及梯度降低acta浓度诱导定型内胚层的组合方法产生胰腺祖细胞的效率更高，批间差异更少，而改变其中任何一个条件均达不到本发明所强调的优点，即高效率、高兼容性、低耗时。
52.本发明所述的胰腺祖细胞的构建方法具有以下优点：1、高分化效率，诱导效率稳定在90%以上；2、高兼容性，适用于多种hpsc的诱导，不同批次间稳定性好；3、短诱导周期，
仅需10天即可获得高纯度胰腺祖细胞；4、无血清诱导体系，成分明确可控；5、全2d（二维）分化系统，操作简便。
53.表1 试剂列表表2 试剂对应名称
表3 抗体列表以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。