一种十字花科根肿病快速接种方法

1.本发明涉及接种菌技术领域，更具体地说，它涉及一种十字花科根肿病快速接种方法。


背景技术：

2.根肿病是制约十字花科作物生产的世界性病害，该病由芸薹根肿菌(plasmodiophora brassicae woronin)引起，其典型症状是在病株根部形成根瘤，阻碍寄主对水分和营养物质的吸收。该病在中国大部分省、市、自治区均有分布，在利于病害发生的环境下，根肿病可导致十字花科作物严重减产甚至绝收，且发病后的土壤将长期带菌，不再适宜栽培十字花科作物。随着根肿病在国内外的发病面积越来越大，病情也越来越重，筛选抗病品种是迫在眉睫的任务。
3.因此建立一套快速、可大批量进行鉴定的人工病害接种方法，是筛选抗根肿病十字花科材料的基础。根肿病鉴定过程中有效的接菌方法有很多，目前国内外报道的方法有，插入法、菌土法、注射法、灌根法、浸芽法等，这些接菌方法有着各自的优缺点，到目前为止尚未形成统一稳定的接菌方法。但这些方法都存在耗大量人工、工作量繁琐、费时费力，且接种浓度不均匀、影响材料长势的缺点，并且都不能进行大批量、同批次的均匀接种，导致容易错过根肿病发病的最佳发病时间，从而对品种筛选造成误差。
4.为此，建立一个根肿病快速、精准、可大批量的鉴定方法是非常重要的。本发明旨在设计提供一种十字花科根肿病快速接种方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种十字花科根肿病快速接种方法，本发明的方法中通过建立一个根肿病菌种池，运用漂浮技术进行苗期根肿病鉴定，接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，并能正确划分出品种真实抗病性及操作简单方便，这样可以大大减轻试验造成的污染，减少人力物力的浪费，从而为根肿菌的研究减轻更多的工作负担。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种十字花科根肿病快速接种方法，包括以下步骤：
7.s1、菌种采集，在十字花科根肿病发病的田块采集发病植株肿根，并将其在-20℃冷冻保存；
8.s2、接种液的制备，取出步骤s1中冷冻保存的部分十字花科肿根，室温解冻，剪成小块后称重，加等量无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后4层纱布过滤，4000r/min离心15min，弃上清液；用无菌水悬浮沉淀3500r/min离心10min，弃上清液，并重复3次，最后弃上清液后重新采用无菌水悬浮沉淀，制成根肿菌休眠孢子悬浮液，利用血球计数板计测休眠孢子悬浮液浓度，并调至108个/ml，4 ℃保存备用；
9.s3、接种：
10.1)播种及苗期管理，将消毒后的十字花科作物种子播在装有灭菌基质的漂浮式育苗盘中，将在漂浮式育苗盘置于育苗池中进行管理，不喷施药剂，待植株长至两叶一心的时期，将漂浮式育苗盘挪出育苗池，控水48小时，准备接种；
11.2)制备接种池，在智能温室内建立一个水泥池作为接种池，注入清水，将制备好的接种液按比例投入接种池，并使用工具将其混匀，使混匀后的接种池中的接种液休眠孢子浓度达108个/ml；
12.3)接种及管理，将提前控水的苗子投入接种池，然后进行正常管理；适量加水之接种池，保持育苗盘漂浮；在播种6周后，为感病品种严重感病时期，即抗性鉴定时间；
13.s4、数据统计和分析：按照根肿病室内人工接种病情分级标准对接种植株进行分级，并计算发病率和病情指数，其中，病情指数的计算公式为：
14.病情指数(di)＝∑(发病级代表值
×
各级病株数
×
100)/(调查总株数
×
最高级发病代表值)。
15.进一步地，步骤s3中所述的灭菌基质为包括蛭石、草炭和灭菌土，且蛭石、草炭和灭菌土的比例为1：1：2，所述灭菌基质的ph 值为5～6。
16.进一步地，所述接种池的长为6.9m，宽为3.6m，高为0.25m。
17.综上所述，本发明具有以下有益效果：
18.本发明的方法中通过建立一个根肿病菌种池，运用漂浮技术进行苗期根肿病鉴定，接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，并能正确划分出品种真实抗病性及操作简单方便，这样可以大大减轻试验造成的污染，减少人力物力的浪费，从而为根肿菌的研究减轻更多的工作负担。
具体实施方式
19.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
20.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
21.实施例：
22.一种十字花科根肿病快速接种方法，包括以下步骤：
23.步骤一、菌种采集，在十字花科根肿病发病的田块采集发病植株肿根，并将其在-20℃冷冻保存；
24.步骤二、接种液的制备，取出步骤s1中冷冻保存的部分十字花科肿根，室温解冻，剪成小块后称重，加等量无菌水，用组织捣碎匀浆机搅成匀浆后4层纱布过滤，4000r/min离心15min，弃上清液；用无菌水悬浮沉淀3500r/min离心10min，弃上清液，并重复3次，最后弃上清液后重新采用无菌水悬浮沉淀，制成根肿菌休眠孢子悬浮液，利用血球计数板计测休眠孢子悬浮液浓度，并调至108个/ml，4 ℃保存备用；
25.步骤三、接种：(供试材料：不同抗性甘蓝、萝卜、大白菜品种)
26.1)播种及苗期管理，将消毒后的十字花科作物种子(甘蓝、萝卜种子)播在装有灭
菌基质的漂浮式育苗盘中，将在漂浮式育苗盘置于育苗池中进行管理，不喷施药剂，待植株长至两叶一心的时期，将漂浮式育苗盘挪出育苗池，控水48小时，准备接种；
27.2)制备接种池，在智能温室内建立一个水泥池作为接种池，注入清水，将制备好的接种液按比例投入接种池，并使用工具将其混匀，使混匀后的接种池中的接种液休眠孢子浓度达108个/ml；
28.3)接种及管理，将提前控水的苗子投入接种池，然后进行正常管理；适量加水之接种池，保持育苗盘漂浮；在播种6周后，为感病品种严重感病时期，即抗性鉴定时间；
29.步骤四、数据统计和分析：按照根肿病室内人工接种病情分级标准对接种植株进行分级，并计算发病率和病情指数，其中，病情指数的计算公式为：
30.病情指数(di)＝∑(发病级代表值
×
各级病株数
×
100)/(调查总株数
×
最高级发病代表值)。根肿病群体抗性分级标准如下：
31.免疫(i)：di＝0；高抗hr：0《hr《10；抗病r:10≤r《20；耐病t： 20≤t《30；感病s≥30。
32.其中，灭菌基质为包括蛭石、草炭和灭菌土，且蛭石、草炭和灭菌土的比例为1：1：2，灭菌基质的ph值为5～6。
33.接种池的长为6.9m，宽为3.6m，高为0.25m。
34.在本实施例中，十字花科根肿病室内人工接种病情分级标准(农业部公益性行业科研专项“十字花科作物根肿病防控技术研究与示范”项目组制定))如下：
35.表1室内根肿病分级标准及症状
[0036][0037]
以下为本实施例的试验研究：
[0038]
接种六周后，对发病情况进行调查，按照根肿病室内人工接种病情分级标准对接种植株进行分级，计算发病率和病情指数。从实验结果表明，运用本接种方法，可快速大量的筛选不同种类的十字花科作物，且结果分级显著，接种效率高，接种方法和接种量一致，品种发病均匀，抗、感稳定性好，病情判别灵敏度高，可操作性强，既适用于小样本材料的病原菌小种鉴定，也适用于大批量材料的品种抗病性鉴定，操作简单快捷，接种浓度精确定量，接种效率高，成本低，对环境友好，生产应用上操作性强，轻简化程度高，该技术适合室内抗性鉴定及药剂活性筛选研究工作，更适用大田育种材料的规模化接种筛选和评价。
[0039]
表2大白菜根肿病病情调查
[0040][0041][0042]
从试验研究及表2的数据统计结果显示，10份大白菜鉴定材料中，表现高抗(hr)材料3份，分别为品种1、品种2和品种3；抗病(r)材料3份，分别为品种4、品种6和品种7；耐病(t)材料 2份，分别为品种5和品种8；感病(s)材料2份，分别为品种9和品种10。
[0043]
表3萝卜根肿病病情调查
[0044][0045]
从试验研究及表3的数据统计结果显示，10份萝卜鉴定材料中，表现高抗(hr)材料3份，分别为品种3、品种5和品种8；抗病(r) 材料3份，分别为品种1、品种6和品种9；耐病(t)材料2份，分别为品种4和品种7；感病(s)材料2份，分别为品种2和品种10。
[0046]
表4甘蓝根肿病病情调查
[0047]
[0048][0049]
从试验研究及表4的数据统计结果显示，10份甘蓝鉴定材料中，表现高抗(hr)材料0份；抗病(r)材料2份，分别为品种7和品种9；耐病(t)材料3份，分别为品种2、品种3和品种6；感病(s) 材料5份，分别为品种1、品种4、品种5、品种8和品种10。
[0050]
在本发明的上述实施例中，建立了一套快速、可大批量进行鉴定的人工病害接种方法，是筛选抗根肿病十字花科材料的基础。现有技术中根肿病鉴定过程中有效的接菌方法有很多，与本发明相比，现有的方法都存在耗大量人工、工作量繁琐、费时费力，且接种浓度不均匀、影响材料长势的缺点，并且都不能进行大批量、同批次的均匀接种，导致容易错过根肿病发病的最佳发病时间，从而对品种筛选造成误差。
[0051]
本发明的方法通过建立一个根肿病菌种池，运用漂浮技术进行苗期根肿病鉴定，接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，并能正确划分出品种真实抗病性及操作简单方便，这样可以大大减轻试验造成的污染，减少人力物力的浪费，从而为根肿菌的研究减轻更多的工作负担。
[0052]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。