杂环-三氮唑并噻二唑杂环串联化合物、合成方法、药物组合物及用途

1.本发明属于医药及其制备和应用的技术领域，具体涉及杂环-三氮唑并噻二唑杂环串联化合物、合成方法、药物组合物及用途。


背景技术：

2.shp2是一个在体内广泛存在的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，由两个二个sh2结构域(n-sh2和c-sh2)，一个具有催化活性的ptp结构域及富含脯氨酸基团及酪氨酸磷酸化尾巴组成。shp2作为血小板源性生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞因子(fgf)、白细胞介素-3(il-3)、白血病抑制因子(lif)及α-干扰素(inf-α)等生长因子的下游信号分子，参与多条信号通路(例如ras/mark通路、pi3k/akt通路、jak/stat通路、jnk通路、nf-b通路、rho通路、nfat通路等)，在细胞信息传递过程中起着关键的作用。shp2编码基因发生突变被认作是人类多种疾病的驱动力，例如在努南(noonan)综合征中有40-50％的患者发生了ptpn11的突变；在青少年粒单核细胞白血病(jmml)和急性髓细胞白血病(aml)中ptpn11的突变率分别达到35％和6.6％。在白血病中，shp2突变类型主要是e76k、d61y、e139d、q506p等，其中e76k这个突变类型是最常见的，也是与白血病最为密切的。因此，突变型shp2是潜在的抗肿瘤靶点。
3.近年来，shp2抑制剂取得了重要的进展。在发现第一个野生型shp2变构抑制剂shp099之后，出现了一些基于shp099结构改造的变构抑制剂，具体结构如下所示：
[0004][0005]
当前由各大制药公司开发出的shp2抑制剂如tno155、rmc-4630、jab-3068、et0038和rly-1971等抑制剂均处于临床研究当中。遗憾的是，现有的shp2抑制剂都不是突变型shp2抑制剂，不能满足临床药物开发的需求。因此，迫切需要发现更多结构新颖、选择性高的抑制剂，为研究突变型shp2在白血病信号通路中的生物功能提供工具化合物，为白血病治疗提供药物。


技术实现要素：

[0006]
本发明所要解决的技术问题是克服突变型shp2抑制剂的稀缺性问题，提供杂环-三氮唑并噻二唑杂环串联全新骨架类型的突变型shp2抑制剂、其中间体、合成方法、药物组合物及用途。该类化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶shp2的生物活性，尤其对e76k突变型shp2具有高度选择性，在细胞中能有效抑制shp2下游信号通路的磷酸化水平，对肿瘤细胞具有很好的抑制活性，可以为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供新的手段，具有广阔的药物开发前景。
[0007]
本发明主要通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0008]
[化合物]
[0009]
本发明提供了一种通式i所示的一类杂环-三氮唑并噻二唑杂环化合物或其药学上可接受的盐，
[0010][0011]
其中x独立选自o、-ch＝ch-、-n＝ch-，r1、r2分别独立选自-no2、-nh2、-sh、未取代和取代的芳香环、未取代和取代的杂芳香环、c
1-c6链烷基、环烷基、卤素、环氧烷基、烯基、炔基、醚链、-nhra、-shrb；其中ra选自氢、c
1-c6链烷基、环烷基、-c(o)-rc、未取代和取代的芳香环、未取代和取代的杂芳香环、未取代和取代的杂环烷基；rb选自氢、未取代和取代的芳香环、苯环上有取代或无取代的苄基；rc选自未取代和取代的芳香环、未取代和取代的杂芳香环。
[0012]
所述芳香环为苯环或者萘环。
[0013]
所述杂芳香环包括：呋喃环、噻吩环、哌啶环、吡啶环、吡咯环。
[0014]
所述杂环烷基为含有1-3个杂原子的c2-c5环烷基，杂原子包括s、n、o；具体可选：四氢呋喃环。
[0015]
所述取代的基团包括：卤素(f、cl、br、i)、c1-4烷基、c1-4烷氧基、-no2、-nhrd；rd选自氢、c
1-c6链烷基、环烷基、-c(o)-re、未取代和取代的芳香环、未取代和取代的杂芳香环、未取代和取代的杂环烷基；re选自未取代和取代的芳香环、未取代和取代的杂芳香环。
[0016]
优选地，当x为o时，为通式ⅱ，
[0017]
[0018]
r1，r2分别独立选自如下结构：nh2、sh、-cl、-f、-br、-i、-ch3、、
[0019]
优选地，x为-ch＝ch-时，为式ⅲ所示结构，r1，r2分别独立选自如下结构：
[0020][0021]
r1，r2分别独立选自如下结构：-no2、-nh2、-sh、烯基、炔基、c
1-c6链烷基、醚链、含氧环烷基、环烷基、卤素、-nhra、-srb、未取代和取代的芳香环或杂芳香环、其中ra选自环丙基、环己基、异丙基、甲基，或者-nhra选自：
[0022]-srb选自：
[0023]
未取代和取代的芳香环为
[0024]
杂芳香环为
[0025]
优选地，当x为-n＝ch-时，为式ⅳ所示结构，r1，r2分别独立选自如下结构：
[0026][0027]
r1，r2分别独立选自如下结构：-no2、-nh2、-sh、烯基、炔基、c
1-c6链烷基、醚链、含氧环烷基、环烷基、卤素、-nhra、-srb、未取代和取代的芳香环或杂芳香环、其中ra选自环丙基、环己基、异丙基、甲基，或者-nhra选自：
[0028]-srb选自：
[0029]
未取代和取代的芳香环为
[0030]
杂芳香环为
[0031]
最优选地，一类杂环-三氮唑并噻二唑杂环化合物的具体结构为：
[0032]
[0033]
[0034]
[0035][0036]
[合成方法]
[0037]
本发明还提供了一种所述通式ⅰ化合物的合成方法，所述方法通过以下反应方案来实施：
[0038]
合成方案1
[0039][0040]
试剂和条件：a)二氯亚砜(socl2)，无水甲醇，氮气(n2)，80℃，12h；b)水合肼(n2h4.h2o)，甲醇，80℃，12h；c)二硫化碳，氢氧化钾，无水甲醇，室温，12h；d)水合肼(n2h4.h2o)，水，110℃，5h；e)溴化氰，75％乙醇，90℃，16h；f)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温℃，2h；
[0041]
取i-1溶解于无水甲醇中，在冰浴条件下缓慢滴加二氯亚砜，n2保护后置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去meoh，固体加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物i-2，将i-2溶解于无水甲醇中，滴加水合肼，将该溶液置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去甲醇，固体用水和无水乙醇洗涤，真空干燥，得化合物i-3，将i-3溶解于无水甲醇中，将溶于无水甲醇的koh溶液缓慢滴加到上述溶液中搅拌，缓慢滴加cs2溶液，室温搅拌15h，监测反应完全后，抽滤固体，用无水乙醚进行洗涤，收集固体，直接投下一步，将i-4溶解在水中，滴加水合肼，将该溶液置于110℃油浴锅内加热回流3h，监测反应完全后，向反应液内加入冰水淬灭，在冰浴条件下用浓盐酸调ph 5-6，抽滤固体，真空干燥得i-5，将i-5，溴化氰溶解于75％乙醇溶液中，将反应液置于90℃油浴锅内加热回流20h，监测反应完全后，减压蒸馏至溶剂剩
1/4，加入饱和碳酸钠溶液，抽滤，得固体i-6，将i-6，i-7，hatu，dipea溶于dmf中，室温搅拌4h，监测反应完全后，将反应液滴入水中，析出固体，抽滤，经柱层析纯化得化合物i-8。
[0042]
合成方案2
[0043][0044]
试剂和条件：a)三氯氧磷，90℃，16h
[0045]
将ii-1，ii-2溶解在三氯氧磷中，90℃条件下加热回流16h，用水淬灭反应后加入50％氢氧化钠溶液调ph 7-8，用乙酸乙酯萃取后减压旋干溶剂，经柱层析纯化得化合物ii-3。
[0046]
合成方案3
[0047][0048]
试剂和反应条件：a)溴化亚铜(cubr2)，亚硝酸叔丁酯(t-buno2)，乙腈，0℃-室温，3h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h。
[0049]
将化合物iii-1和cubr2溶解于乙腈中，冰浴条件下缓慢滴加t-buno2，然后室温下反应3小时，反应完全后用etoac和1m/l稀盐酸洗涤，收集有机相，用无水na2so4干燥，减压旋蒸得化合物iii-2。将粗品iii-2、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯和碳酸铯加入溶剂dmf中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，将合并的有机相用无水na2so4干燥并减压旋蒸除去溶剂，粗品用柱层析纯化得化合物iii-3。将固体iii-3溶解在盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用甲基叔丁基醚(mtbe)和二氯甲烷(dcm)打浆，真空干燥得化合物iii-4。
[0050]
合成方案4
[0051][0052]
试剂和反应条件：a)氯乙酸，三氯氧磷，90℃，12h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，dmf，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h。
[0053]
化合物iv-1和氯乙酸溶解在三氯氧磷中，90℃条件下加热回流12小时，将反应液缓慢滴加入水，用50％浓度的氢氧化钠中和至ph7-8，用etoac萃取，合并的有机相用无水na2so4干燥，旋干。粗品通过柱层析纯化得白色固体iv-2。将粗品iv-2、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯和碳酸铯加入溶剂dmf中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取3次，用饱和食盐水洗涤1-2次，将合并的有机相用无水na2so4干燥并减压旋干溶剂，粗品用柱层析纯化得化合物iv-3。将固体iv-3溶解在盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用mtbe和dcm打浆，真空干燥得化合物iv-4。
[0054]
合成方案5
[0055][0056]
试剂和反应条件：a)二硫化碳，氢氧化钾，甲醇，90℃，24h；b)碳酸钾，乙腈，室温，12h。
[0057]
将v-1和氢氧化钾溶解在溶剂甲醇中，滴加二硫化碳溶液，将反应置于90℃油浴内加热回流24小时，监测反应完全后，用6m/l盐酸溶液调碱后经柱层析纯化得化合物v-2，将v-2，v-3和碳酸钾溶于乙腈中，室温反应12h，监测反应完全后抽滤，将滤液旋干后经柱层析纯化得化合物v-4。
[0058]
除特殊说明外，以上反应中所用试剂为本领域的常规试剂。例如，以上反应可以在如下溶剂中进行：n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙醚、甲醇、水或上述溶剂的混合溶剂。根据具体化合物的反应情况，反应温度一般为室温或加热温度从45℃至110℃。反应时间根据具体反应物而定。所用缩合剂为本领域中常规的缩合剂，所用碱为本领域中常规的无机碱和有机碱，所用酯化试剂和还原试剂为本领域的常规酯化试剂和还原剂。通常用tlc来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后一般采用的后处理方法包括抽滤、浓缩反应液除尽溶剂、萃取、柱层析分离等。最终产物用nmr或者质谱来检测证明。
[0059]
[用途]
[0060]
通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病的药物中的用途。
[0061]
通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备蛋白酪氨酸磷酸酶shp2抑制剂中的用途。
[0062]
在所述用途中，通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备e76k突变在内的shp2获得性突变体、野生型shp2、shp1、tcptp以及ptp1b抑制剂中的应用。
[0063]
在所述用途中，通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备e76k突变在内的shp2获得性突变体、野生型shp2、shp1、tcptp以及ptp1b降解剂中的应用。
[0064]
[药物和药物组合物]
[0065]
本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的所述通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，和任选的药学上可接受的辅料。其中，所述药物组合物用于预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病。
[0066]
本发明还提供了一种用于预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病、心血管病或者神经
性疾病的药物，所述药物包含如权利要求5中定义的通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐，和药用辅料。
[0067]
所述辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
[0068]
所述药物或者药物组合物还可以包括载体，所述载体包括微囊、微球、纳米粒和脂质体。
[0069]
所述药物的剂型包括注射液、注射用冻干粉针、控释注射剂、脂质体注射剂、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。
[0070]
有效效果：
[0071]
本发明含杂环-三氮唑并噻二唑杂环具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶shp2的生物活性，可以作为工具化合物研究蛋白酪氨酸磷酸酶shp2在细胞信号转导过程中的生物学功能关联性，为预防和治疗癌症、代谢与免疫疾病提供新的手段。
附图说明
[0072]
图1为化合物wj503抑制细胞增殖实验示意图。
[0073]
图2为化合物wj50的透析时间与shp2
e76k
活性关系示意。
[0074]
图3为化合物wj50对shp2
e76k
抑制效果示意图。
[0075]
图4为化合物wj503对shp2e76k抑制类型示意图。
具体实施方式
[0076]
本技术涉及的合成过程具备包括如下步骤：
[0077]
反应操作1：
[0078][0079]
试剂和条件：a)二氯亚砜(socl2)，无水甲醇，氮气(n2)，80℃，12h；b)水合肼(n2h4.h2o)，甲醇，80℃，12h；c)二硫化碳，氢氧化钾，无水甲醇，室温，12h；d)水合肼(n2h4.h2o)，水，110℃，5h；e)溴化氰，75％乙醇，90℃，16h；f)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温℃，2h；
[0080]
取i-1溶解于无水甲醇中，在冰浴条件下缓慢滴加二氯亚砜，n2保护后置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去meoh，固体加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠
溶液进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物i-2，将i-2溶解于无水甲醇中，滴加水合肼，将该溶液置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去甲醇，固体用水和无水乙醇洗涤，真空干燥，得化合物i-3，将i-3溶解于无水甲醇中，将溶于无水甲醇的koh溶液缓慢滴加到上述溶液中搅拌，缓慢滴加cs2溶液，室温搅拌15h，监测反应完全后，抽滤固体，用无水乙醚进行洗涤，收集固体，直接投下一步，将i-4溶解在水中，滴加水合肼，将该溶液置于110℃油浴锅内加热回流3h，监测反应完全后，向反应液内加入冰水淬灭，在冰浴条件下用浓盐酸调ph 5-6，抽滤固体，真空干燥得i-5，将i-5，溴化氰溶解于75％乙醇溶液中，将反应液置于90℃油浴锅内加热回流20h，监测反应完全后，减压蒸馏至溶剂剩1/4，加入饱和碳酸钠溶液，抽滤，得固体i-6，将i-6，i-7，hatu，dipea溶于dmf中，室温搅拌4h，监测反应完全后，将反应液滴入水中，析出固体，抽滤，经柱层析纯化得化合物i-8。
[0081]
反应操作2
[0082][0083]
试剂和条件：a)三氯氧磷，90℃，16h
[0084]
将ii-1，ii-2溶解在三氯氧磷中，90℃条件下加热回流16h，用水淬灭反应后加入50％氢氧化钠溶液调ph 7-8，用乙酸乙酯萃取后减压旋干溶剂，经柱层析纯化得化合物ii-3。
[0085]
反应操作3
[0086][0087]
试剂和反应条件：a)溴化亚铜(cubr2)，亚硝酸叔丁酯(t-buno2)，乙腈，0℃-室温，3h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h
[0088]
将化合物iii-1和cubr2溶解于乙腈中，冰浴条件下缓慢滴加t-buno2，然后室温下反应3小时，反应完全后用etoac和1m/l稀盐酸洗涤，收集有机相，用无水na2so4干燥，减压旋蒸得化合物iii-2。将粗品iii-2、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯和碳酸铯加入溶剂dmf中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，将合并的有机相用无水na2so4干燥并减压旋蒸除去溶剂，粗品用柱层析纯化得化合物iii-3。将固体iii-3溶解在盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用甲基叔丁基醚(mtbe)和二氯甲烷(dcm)打浆，真空干燥得化合物iii-4。
[0089]
反应操作4
[0090][0091]
试剂和反应条件：a)氯乙酸，三氯氧磷，90℃，12h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，dmf，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h
[0092]
化合物iv-1和氯乙酸溶解在三氯氧磷中，90℃条件下加热回流12小时，将反应液缓慢滴加入水，用50％浓度的氢氧化钠中和至ph7-8，用etoac萃取，合并的有机相用无水na2so4干燥，旋干。粗品通过柱层析纯化得白色固体iv-2。将粗品iv-2、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯和碳酸铯加入溶剂dmf中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取3次，用饱和食盐水洗涤1-2次，将合并的有机相用无水na2so4干燥并减压旋干溶剂，粗品用柱层析纯化得化合物iv-3。将固体iv-3溶解在盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用mtbe和dcm打浆，真空干燥得化合物iv-4。
[0093]
反应操作5
[0094][0095]
试剂和反应条件：a)二硫化碳，氢氧化钾，甲醇，90℃，24h；b)碳酸钾，乙腈，室温，12h
[0096]
将v-1和氢氧化钾溶解在溶剂甲醇中，滴加二硫化碳溶液，将反应置于90℃油浴内加热回流24小时，监测反应完全后，用6m/l盐酸溶液调碱后经柱层析纯化得化合物v-2，将v-2，v-3和碳酸钾溶于乙腈中，室温反应12h，监测反应完全后抽滤，将滤液旋干后经柱层析纯化得化合物v-4。
[0097]
下述制备例中，1h-nmr谱采用bruker av
ⅲ‑
400mhz型核磁共振仪测定；质谱采用型质谱仪测定；试剂主要由上海化学试剂公司提供，产品纯化主要用柱层析法，硅胶(200-300目)，柱色谱法所用的硅胶型号为粗空(zlx－ⅱ)，由安徽良臣硅源材料有限公司生产。
[0098]
如未作特别说明，本发明所采用的方法和仪器等为本领域公知的技术。
[0099]
实施例1
[0100][0101]
试剂和条件：a)二氯亚砜(socl2)，无水甲醇，氮气(n2)，80℃，12h；b)水合肼(n2h4.h2o)，甲醇，80℃，12h；c)二硫化碳，氢氧化钾，无水甲醇，室温，12h；d)水合肼(n2h4.h2o)，水，110℃，5h；e)溴化氰，75％乙醇，90℃，16h；f)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，室温℃，2h；
[0102]
取3-硝基-4甲氨基苯甲酸i-1(5.0g,0.025mol)溶解于50ml无水甲醇中，在冰浴条件下缓慢滴加二氯亚砜(6.1g,0.05mol)，n2保护后置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去meoh，固体加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得化合物i-2(3.7g，产率70％)
[0103]
称取i-2(3g，0.014mol)溶解于30ml无水甲醇中，滴加水合肼(3.6g，0.071mol)，将该溶液置于80℃油浴锅内回流14h，监测反应完全后，减压蒸馏除去甲醇，固体用水和无水乙醇洗涤，真空干燥，得化合物i-3(2.1g，产率70％)
[0104]
称取i-3(2.0g，0.010mol)溶解于20ml无水甲醇中，将溶于无水甲醇的koh(0.841g，0.015mol)溶液缓慢滴加到上述溶液中搅拌，缓慢滴加cs2(1.142g，0.015mol)溶液，室温搅拌15h，监测反应完全后，抽滤固体，用无水乙醚进行洗涤，收集固体，直接投下一步。
[0105]
将i-4(2.0g，0.006mol)溶解在20ml水中，滴加水合肼(0.9g，0.018mol)，将该溶液置于110℃油浴锅内加热回流3h，监测反应完全后，向反应液内加入30ml冰水淬灭，在冰浴条件下用浓盐酸调ph 5-6，抽滤固体，真空干燥得i-5(1.2g，产率70％)
[0106]
称取i-5(1g,0.004mol)，溴化氰(0.530g，0.005mol)溶解于75％乙醇溶液中，将反应液置于90℃油浴锅内加热回流20h，监测反应完全后，减压蒸馏至溶剂剩1/4，加入饱和碳酸钠溶液，抽滤，得红色固体wj291(0.547g，产率50％)
[0107]
称取wj291(0.500g，0.002mol)，2-呋喃甲酸i-7(0.224mol，0.002mol)，hatu(0.760mg，0.002mol)溶于5ml dmf中，滴加dipea(0.774g，0.006mol)，室温搅拌4h，监测反应完全后，将反应液滴入水中，析出固体，抽滤，得橙色固体wj385(0.385g，产率50％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.09(d,j＝2.0hz,1h),8.48-8.45(q,j＝4.8hz,1h),8.38(dd,j＝9.2,2.0hz,1h),7.74(q,j＝4.8hz,1h),7.21(d,j＝9.2hz,1h),7.03(dd,j＝3.2,0.8hz,
1h),6.56(q,j＝1.6hz,1h),3.04(d,j＝4.8hz,3h).ms(esi):m/z calcd for c
15h12
n7o4s[m+h]
+
386.1,found 386.0.
[0108]
实施例2
[0109][0110]
试剂和条件：a)三氯氧磷，90℃，16h；
[0111]
将ii-1(294.0mg,1.0mmol)，ii-2(167.0mg,1.0mmol)溶解在三氯氧磷(5ml)中，90℃条件下加热回流16h，用水淬灭反应后加入50％氢氧化钠溶液调ph 7-8，用乙酸乙酯萃取后(30ml
×
2)减压旋干溶剂，经柱层析纯化得橙色固体wj425(207.0mg,产率：48.7％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.05(d,j＝2.0hz,1h),8.49(d,j＝8.4hz,2h),8.39(d,j＝9.2hz,1h),8.30(d,j＝8.4hz,2h),8.17(d,j＝7.6hz,1h),7.38(d,j＝9.2hz,1h),4.07
–
4.04(m,1h),1.34(d,j＝6.0hz,6h).ms(esi):m/z calcd for c
18h16
n7o4s[m+h]
+
426.1,found 426.2.
[0112]
实施例3
[0113][0114]
试剂和反应条件：a)溴化亚铜(cubr2)，亚硝酸叔丁酯(t-buno2)，乙腈，0℃-室温，3h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，dmf，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h；
[0115]
称取化合物wj284(511.2mg,1.8mmol)、cubr2(284.0mg,2.0mmol)溶于乙腈(8ml)中，冰浴条件下缓慢加入t-buno2(204.2mg,2.0mmol)，缓慢升温至室温下反应3小时，反应完全后用etoac(20ml)和1m/l稀盐酸(10ml)洗涤，有机相用无水na2so4干燥，减压旋蒸除去溶剂得化合物iii-1(350.3mg,1.0mmol)。将粗品iii-1(300.0mg,0.9mmol)、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(276.1mg,1.3mmol)和碳酸铯(559.0mg,1.7mmol)加入溶剂dmf(8ml)中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取(20ml
×
2)，用饱和食盐水(10ml
×
2)洗涤有机相，将合并的有机相用无水na2so4干燥并除去etoac，粗品用柱层析纯化得化合物wj482(285.1mg,0.6mmol)。将固体wj482溶解在5ml盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用mtbe和dcm淋洗，真空干燥得白色固体wj418(180.7mg,产率24.0％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.34(s,2h),7.87(t,j＝8.0hz,1h),7.70(t,j＝8.0hz,1h),7.57(t,j＝8.0hz,1h),3.73
–
3.68(m,4h),1.90
–
1.78(m,4h),1.35-1.33(m,3h).ms(esi):m/z calcd for c
15h18
cl3n6s[m+h]
+
419.0,found 383.0.
[0116]
实施例4
[0117][0118]
试剂和反应条件：a)氯乙酸，三氯氧磷，90℃，12h；b)碳酸铯，(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯，dmf，室温，12h；c)盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)，室温，2-3h；
[0119]
化合物iv-1(984.2mg,3.8mmol)和氯乙酸(359.1mg,3.8mmol)溶解在三氯氧磷(12ml)中，90℃条件下加热回流12小时，将反应液缓慢滴加入水，用50％浓度的氢氧化钠中和至ph7-8，用etoac萃取(30ml
×
3)，合并的有机相用无水na2so4干燥，旋干。粗品通过柱层析纯化得白色固体iv-2(540.6mg,1.7mmol)。将粗品iv-2(540.6mg,1.7mmol)、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(545.7mg,2.6mmol)和碳酸铯(1.1g,3.4mmol)加入溶剂dmf(15ml)中，室温反应12小时后，将反应液滴入水中，用etoac萃取(20ml
×
3)，用饱和食盐水洗涤有机相1次(20ml)，将合并的有机相用无水na2so4干燥并减压旋蒸除去溶剂，粗品用柱层析纯化得化合物wj496(618.3mg，1.3mmol)。将固体wj496溶解在盐酸-1,4-二氧六环溶液(4m/l)(10ml)中，室温反应2-3小时，抽滤固体，用mtbe和dcm淋洗，真空干燥得化合物wj432(296.7mg,产率18.1％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.49(s,2h),7.92(d,j＝7.6hz,1h),7.79(d,j＝7.6hz,1h),7.61(t,j＝7.6hz,1h),4.62(s,2h),3.41-3.40(m,2h),3.16-3.11(m,2h),2.08-2.02(m,2h),1.93-1.89(m,2h),1.36(s,3h),ms(esi):m/z calcd for c
16h20
cl3n6s[m+h]
+
433.1,found 397.0.
[0120]
实施例5
[0121][0122]
试剂和反应条件：a)二硫化碳，氢氧化钾，甲醇，90℃，24h；b)碳酸钾，乙腈，室温，12h；
[0123]
将v-1(259.0mg,1.0mmol)和氢氧化钾(56.1mg,1.0mmol)溶解在溶剂甲醇(15ml)中，滴加二硫化碳溶液(304.6mg,4.0mmol)，将反应置于90℃油浴内加热回流24小时，监测反应完全后，用6m/l盐酸溶液调碱后经柱层析纯化得化合物wj301(100.0mg,0.3mmol)，将wj301(80.0mg,0.27mmol)，v-2(58.1mg,0.27mmol)，碳酸钾(74.5mg,0.54mmol)溶解在溶剂乙腈中，室温反应12h，监测反应完全后，抽滤，滤液旋干就经柱层析纯化得白色固体wj436(50.0mg,产率：42.5％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.30(s,1h),8.15
–
8.13(m,1h),7.92(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.88(d,j＝7.6hz,1h),7.73(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),7.61(q,j＝8.0hz,2h),4.69(s,2h).ms(esi):m/z calcd for c
16h10
cl2n5o2s2[m+h]
+
438.0,found 438.0.
[0124]
除了适当替换相应的反应化合物外，以下化合物的制备参照上述制备的方法，得到不同化合物，结果如表1所示。
[0125]
表1不同杂环-三氮唑并噻二唑杂环化合物的表征数据结果
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134][0135]
实验例6：含杂环-三氮唑并噻二唑杂环化合物抑制shp2活性测试
[0136]
1)材料：
[0137]
蛋白：shp2全长(met1-arg 593)，将ptpn11基因克隆到含有n-末端6
×
his标签的pet-15b质粒中(cat.no.69661-3)，通过大肠杆菌(bl21)表达系统表达得到his标签融合蛋白并借助akta avant25蛋白纯化系统进行分离和纯化。参考文献nature,2016,535(7610):148-152.
[0138]
2)过程：采用快速荧光定量检测法，在384孔黑色微孔微孔板(optiplate-384 black opaque，perkin elmer)中检测酶活性。底物difmup经shp2水解得到difmu并产生荧光。反应溶液体系为：60mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
model)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(standard deviation,sd)或者标准误差(standard error,se)表示。每次测试均以shp099为参照(ic
50
＝4.98
±
0.26μm)。所有数据都在我们知识能力范围内尽可能做到可信，精确，正确。
[0150]
实验例8：化合物抑制ptp结构域shp2活性测试
[0151]
应用大肠杆菌表达系统表达得到gst融合蛋白；荧光底物，omfp。过程:采用荧光底物omfp，在384黑底孔板中观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μm的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物omfp，omfp水解底物omf在被485nm激发光激发后可发射出波长为530nm的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μm为首要浓度的化合物做ic
50
测试。实验中采用的对照化合物为na3vo4。
[0152]
实验例9：化合物抑制野生型shp1活性测试
[0153]
应用大肠杆菌表达系统表达得到gst融合蛋白；荧光底物，omfp。过程:采用荧光底物omfp，观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μm的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物omfp，omfp水解底物omf在被485nm激发光激发后可发射出波长为530nm的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率(％inhibition)大于50％，则选取8个浓度，50μm为首要浓度的化合物做ic
50
测试
[0154]
实验例10：化合物抑制ptp结构域ptp1b活性测试
[0155]
应用大肠杆菌表达系统表达得到gst融合蛋白；荧光底物，omfp。过程:采用荧光底物omfp，在384黑底孔板中观察不同化合物对重组酶的活性的抑制。首先选取单点浓度50μm的化合物与酶在室温下孵育，最后迅速加入底物omfp，omfp水解底物omf在被485nm激发光激发后可发射出波长为530nm的可检测的荧光信号，从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μm为首要浓度的化合物做ic
50
测试。实验中采用的对照化合物为na3vo4。
[0156]
实验例11：化合物抑制ptp结构域tcptp活性测试
[0157]
应用大肠杆菌表达系统表达得到gst融合蛋白；底物，pnpp。过程:采用紫外底物pnpp，观察不同化合物对活性片断的活性抑制，以初步评价化合物的作用效果。tcptp水解底物pnpp的磷酯键得到的产物在405nm处有很强的光吸收。首先选取单点浓度50μm，2ml的化合物与88ml底物pnpp，直接加入10ml的ptp1b。因此可以直接监测405nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。如果抑制率大于50％，则选取8个浓度，50μm为首要浓度的化合物做ic
50
测试。
[0158]
实验例12：化合物抑制mv-4-11细胞活性测试
[0159]
1)材料：
[0160]
细胞株：mv-4-11
[0161]
试剂：luminescent cell viability assay reagent细胞培养基：imdm，96孔白底板；
[0162]
2)过程：收集mv-4-11细胞，离心后重悬计数。将细胞以1.0
×
104个细胞/孔的密度接种于透明96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液体积为80μl，将接种细胞后的培养板置于37℃恒温培养箱平衡至少30min，培养条件为37℃+5％co2。将化合物用培养基(imdm+10％
fbs)稀释至起始浓度500μm，2倍梯度稀释，并保证dmso浓度小于0.002％。将稀释好的化合物20μl加入细胞中，每个浓度3个复孔(化合物起始终浓度为100μm)，在37℃恒温培养箱中培养7天。使用celltiteraqueous non-radioactive cell proliferation assay(mts)试剂检测细胞增殖情况，20μl/孔，37℃恒温培养箱中孵育2～3小时，置于酶标仪读值，读取双波长690nm及490nm，计算细胞相对活力。
[0163]
3)样品处理：样品用dmso溶解，-20℃保存，dmso在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。
[0164]
4)数据处理及结果说明：
[0165]
测试活性剂量依赖关系，即ic
50
/ec
50
值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为graphpad prism 6，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration
–
response model)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(standard deviation,sd)或者标准误差(standard error,se)表示。
[0166]
实施例13：化合物的酶动力学性质实验
[0167]
酶动力学实验技术：研究抑制剂的作用类型，可以进一步明确抑制剂的作用机理，推测抑制剂在酶上的结合部位及作用方式等。首先采用透析法或者大体积稀释法确定化合物是否是可逆抑制剂，如果是可逆抑制剂，则在不同的底物浓度(大约为酶的km值的1/8到8倍之间)下，检测反应初速度。然后根据michaelis-menten方程(公式1)拟合v～[s]曲线，得到km和vmax值。
[0168][0169]
可逆抑制剂又可以细分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂及反竞争性抑制剂，根据km与vmax的关系，来具体判定是哪种类型的可逆抑制剂。除了做可逆抑制剂分析试验，同时还需要确定化合物与蛋白的结合快慢。
[0170]
所有数据都在我们知识能力范围内尽可能做到可信，精确，正确。
[0171]
所得测试结果见表2。
[0172]
表2含杂环-三氮唑并噻二唑杂环化合物的生物活性数据
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177][0178]
其中，a代表ic
50
小于等于5μm，b代表5μm《ic
50
《20μm，c代表20μm《ic
50
《50μm，d代表ic
50
》50μm，
“‑”
代表活性未测。
[0179]
表2中阳性化合物wj503对mv-4-11细胞的抗增殖活性结果如图1所示。从图1可以看出化合物wj503(ic
50
＝13.11
±
4.45μm)具有一定的抑制细胞生长活性，成剂量依赖型。
[0180]
表2中阳性化合物wj503的透析时间与shp2
e76k
活性关系如图2所示。图2结果显示，随着时间的延长，wj503逐步与shp2 e76k
解离，shp2 e76k
的活性逐步恢复，可以看出化合物wj503为可逆性抑制剂。
[0181]
表2中阳性化合物wj503对shp2
e76k
抑制效果与时间没有依赖关系如图3所示。图3结果显示，化合物wj503为快结合抑制剂。
[0182]
表2中阳性化合物wj503对shp2
e76k
抑制类型结果如图4所示。图4结果显示，化合物wj503表现出竞争型抑制剂特征。综上所述，化合物503为shp2
e76k
蛋白酶的一种可逆竞争型快结合抑制剂。