表面活性剂在疏水层析纯化蛋白中提高回收率的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及表面活性剂在疏水层析纯化蛋白中提高回收率的应用。

背景技术：

1、疏水层析也称疏水作用下层析(hydrophobic interaction chromatographyhic)从分离纯化生命物质的机制来看，也属于吸附层析一类。疏水层析原理如下：蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而依次被洗脱纯化，可用于分离纯化蛋白质，尤其是应用其它方法，例如盐析、等电点沉淀等不易分离纯化的蛋白质。

2、在蛋白质的纯化过程中，许多蛋白都是采用蛋白a柱进行亲和层析。然而，蛋白a树脂的价格比其他常用的离子交换树脂高约30倍，增加了纯化蛋白质的成本。因此，通常利用非亲和层析纯化方法来纯化抗体。

3、非亲和层析方法包括先用阳离子进行捕获，然后进行阴离子层析。经过这两个步骤的层析后，抗体的宿主细胞蛋白(hcp)仍然大于100ppm，使得抗体不符合质量要求。疏水层析在纯化抗体过程中在去除hcp、减少聚体方面具有一定的作用。然而，发明人发现利用疏水层析纯化cd20抗体和度拉鲁肽时，洗脱液的洗脱效果差，cd20抗体和度拉鲁肽的回收率特别低。因此，在疏水层析纯化蛋白过程中，亟需一种纯化疏水性强的蛋白的方法，以提高目的蛋白的回收率，并且hcp杂质满足质量要求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种表面活性剂在疏水层析纯化蛋白抗体中提高回收率的应用，以提高蛋白的回收率。

2、为达此目的，本发明提供了表面活性剂在疏水层析纯化蛋白中提高回收率的应用。

3、在本发明一些实施方式中，所述蛋白选自核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、磷蛋白或重组蛋白。

4、在本发明一些实施方式中，所述重组蛋白为融合蛋白。

5、在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白选自免疫球蛋白融合蛋白、甲状旁腺激素融合蛋白或细胞因子重组融合蛋白。

6、在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白选自glp-1或其变体。

7、在本发明一些实施方式中，所述融合蛋白为度拉鲁肽。

8、在本发明一些实施方式中，所述蛋白选自抗体。

9、在本发明一些实施方式中，所述抗体选自igm、igd、igg、iga或ige，或其各自的抗原结合片段，或其各自的重组抗体。

10、在本发明一些实施方式中，所述重组抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体、小分子抗体或双特异性抗体。

11、在本发明一些实施方式中，所述重组抗体为抗狂犬病毒抗体。

12、在本发明一些实施方式中，所述重组抗体为重组单抗或重组双抗。

13、在本发明一些实施方式中，所述重组抗体选自cd1-cd166中的至少一种。

14、在本发明一些实施方式中，所述重组重组单抗为抗cd20抗体。

15、在本发明一些实施方式中，所述抗cd20抗体选自利妥昔单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、帕妥株单抗或阿妥株单抗至少一种。

16、在本发明一些实施方式中，所述cd20抗体为利妥昔单抗。

17、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析所用的第一洗脱液含有表面活性剂。

18、在本发明一些实施方式中，所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。

19、在本发明一些实施方式中，所述非离子表面活性剂为聚山梨酯。

20、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80中的至少一种。

21、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析所用的第一洗脱液含有聚山梨酯80。

22、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为0.5-2.5w/w％。

23、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为0.5-1.95w/w％。

24、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为1.95-2.05w/w％。

25、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为2.05-2.1w/w％。

26、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为2.1-2.5w/w％。

27、在本发明一些实施方式中，所述聚山梨酯80在所述第一洗脱液中的浓度为1-2w/w％。

28、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液包括第一洗脱液a和第一洗脱液b；

29、所述第一洗脱液a含有30-100mm磷酸盐-柠檬酸和0.3-0.6m硫酸铵，ph值为6-8；

30、所述第一洗脱液b含有所述聚山梨酯80和30-100mm磷酸盐-柠檬酸，ph值为6-8。

31、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液a含有50mm磷酸盐-柠檬酸和0.5m硫酸铵，ph值为6.5；

32、所述第一洗脱液b含有所述聚山梨酯80和30-100mm磷酸盐-柠檬酸，ph值为6.5。

33、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的载量为5-20mg/ml。

34、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的载量10mg/ml。

35、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析纯化蛋白包括以下步骤：

36、利用第一平衡缓冲液平衡疏水层析柱，将含有cd20抗体的样品装载到疏水层析柱内；

37、利用所述第一洗脱液洗脱所述疏水层析柱色谱柱内的目的蛋白，收集洗脱液；

38、所述第一平衡缓冲液含有50-100mm磷酸盐-柠檬酸，0.5-1.5m硫酸铵，ph值为6.0-8.0。

39、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析的洗脱模式为线性洗脱。

40、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液a的体积由100％线性降低至0％，同时所述第一洗脱液b的体积由0％线性提高至100％。

41、在本发明一些实施方式中，洗脱液的收集范围为目的蛋白峰值前的100-峰值-目的蛋白峰值后的100mau。

42、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析柱内的填料包括丁基、苯基、辛基或聚丙二醇基团。

43、在本发明一些实施方式中，所述疏水层析柱为capto phenyl impres。

44、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的用量为5-40倍柱体积。

45、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的用量为10-20倍柱体积。

46、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的用量为10-15倍柱体积。

47、在本发明一些实施方式中，所述第一洗脱液的用量为15倍柱体积。

48、在本发明一些实施方式中，所述含有目的蛋白的样品为经过阳离子交换层析得到的样品，或经过阳离子交换层析后，又经阴离子交换层析得到的样品。

49、在本发明一些实施方式中，所述含有目的蛋白的样品为经过阳离子交换层析得到的样品。

50、在本发明一些实施方式中，所述含有目的蛋白的样品为经过阳离子交换层析后，又经阴离子交换层析得到的样品。

51、在本发明一些实施方式中，所述阳离子交换层析包括以下步骤：

52、利用第二平衡缓冲液平衡阳离子交换色谱柱，将含有目的蛋白的样品装载到所述阳离子交换色谱柱内；

53、利用第二平衡缓冲液洗涤所述阳离子交换色谱柱；

54、利用第二洗脱液洗脱所述阳离子交换色谱柱中的目的蛋白，收集洗脱液，从而得到含有目的蛋白的样品；

55、所述第二平衡缓冲液含有50mm磷酸盐-柠檬酸和50mm氯化钠，ph值为4.5；

56、所述第二洗脱液含有缓冲液a和缓冲液b；所述缓冲液a与所述缓冲液b的体积比为20-40:80-60；

57、所述缓冲液a含有50mm磷酸盐-柠檬酸和50mm氯化钠，ph值为4.5；

58、所述缓冲液b含有50mm磷酸盐-柠檬酸和50mm氯化钠，ph值为8.0。

59、在本发明一些实施方式中，所述第二平衡缓冲液为所述缓冲液a。

60、在本发明一些实施方式中，所述阳离子交换色谱柱的填料包括磺酸官能团或羧酸官能团。

61、在本发明一些实施方式中，所述阳离子交换色谱柱为poros xs。

62、在本发明一些实施方式中，所述第二洗脱液的用量为5-40倍柱体积。

63、在本发明一些实施方式中，所述第二洗脱液的用量为10-20倍柱体积。

64、在本发明一些实施方式中，所述阴离子交换层析包括以下步骤：

65、利用第三平衡缓冲液平衡阴离子交换色谱柱，然后将所述经过阳离子交换层析收集的洗脱液装载到所述阴离子交换色谱柱内；

66、利用第三洗脱液洗脱所述阴离子交换色谱柱内的目的蛋白；

67、所述第三平衡缓冲液含有50mm磷酸盐-柠檬酸，ph值6-7.5；

68、所述第三洗脱液含有50mm磷酸盐-柠檬酸，ph值6-7.5。

69、在本发明一些实施方式中，所述阴离子交换色谱柱包括叔胺离子官能团、季铵离子官能团、多胺官能团或二乙基氨基乙基官能团。

70、在本发明一些实施方式中，所述阴离子交换色谱柱为capto adhere。

71、在本发明一些实施方式中，所述第三洗脱液的用量为8-20倍柱体积。

72、在本发明一些实施方式中，所述第三洗脱液的用量为10-15倍柱体积。

73、本发明提供的表面活性剂在疏水层析纯化蛋白中提高回收率的应用能够提高蛋白的回收率，使得回收率在93％以上，甚至于95％以上。并且该应用在提高蛋白的回收率同时，还能显著降低宿主细胞蛋白(hcp)等杂质含量，使得蛋白中hcp的含量降为几十个ppm，甚至是几个ppm，制备出高纯度、高质量的蛋白。