一株具有抗氧化活性的唾液链球菌QS-20及其应用

一株具有抗氧化活性的唾液链球菌qs-20及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有抗氧化活性的唾液链球菌qs-20及其应用。


背景技术：

2.人乳中存在丰富的微生物（包括细菌，病毒和真菌），这些微生物不仅在新生儿肠道免疫系统启动、婴儿肠道免疫功能发育以及程序化进程中发挥重要作用，而且可以保护婴儿免受疾病和成长过程中一些感染。目前，已经从母乳中分离并鉴定的微生物主要有葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属和明串珠菌属等。其中，葡萄球菌、链球菌、双歧杆菌和乳酸菌是母乳中的优势菌群，具有重要的益生作用。因此，研究及开发人乳中链球菌的具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供了一株具有抗氧化活性的唾液链球菌qs-20及其应用，该菌具有抗氧化活性、产酸特性、耐胆盐能力和抑菌能力。
4.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一株具有抗氧化活性的唾液链球菌qs-20，所述唾液链球菌qs-20的分类名为streptococcus salivarius，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc 7.456，保藏日期：2022年1月13日；该生物材料的存活性检测结果为：存活。
5.进一步的，所述唾液链球菌qs-20为白色凸起菌落，表面光滑，菌落直径0.2-1mm，细胞呈球形或者卵圆形，直径不超过1 μm，呈链状排列。
6.进一步的，所述唾液链球菌qs-20具有抗氧化活性、产酸特性、耐胆盐能力和抑菌能力。
7.进一步的，所述唾液链球菌qs-20的核苷酸序列如seq id no.1所示本发明还提供了所述的唾液链球菌qs-20在用于制备抗氧化剂中的应用。
8.进一步的，所述抗氧化剂的作用时间为12h~36h。
9.进一步的，所述唾液链球菌qs-20通过清除dpph自由基、过氧化氢达到抗氧化的作用。
10.本发明还提供了所述的唾液链球菌qs-20在用于制备发酵剂中的应用。
11.进一步的，所述发酵剂的发酵时间为0h~3h。
12.本发明还提供了所述的唾液链球菌qs-20在用于制备抑菌剂中的应用。
13.进一步的，所述抑菌剂能够抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌。
14.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本发明从母乳中分离出益生菌，以dpph清除率为筛选指标获得一株具有较好抗氧
化能力的唾液链球菌qs-20，该菌具有很好的抗氧化活性，能够有效清除dpph自由基、过氧化氢等氧化物质；还具有良好的产酸耐酸特性，为其在发酵食品中的应用提供依据。除此之外，唾液链球菌qs-20还具有耐胆盐能力，有利于该菌在肠道中定植，并且其对多种病原菌，比如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌具有很好的抑制活性。因此，唾液链球菌qs-20应用场景广泛。
附图说明
15.图1为部分菌株的16srdna扩增pcr产物电泳图。
16.图2为qs-20菌株系统进化树分析。
17.图3为唾液链球菌qs-20的菌落形态和细胞形态图。
18.图4为唾液链球菌qs-20的生长曲线和产酸曲线。
19.图5为唾液链球菌qs-20的dpph自由基清除作用。
20.图6为唾液链球菌qs-20的耐酸曲线。
21.图7为唾液链球菌qs-20的耐胆盐曲线。
22.图8为唾液链球菌qs-20对细菌的抑制效果。
具体实施方式
23.结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
24.下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
25.实施例1：唾液链球菌qs-20的分离筛选和鉴定1、分离鉴定新鲜母乳用生理盐水，按照不同的浓度进行稀释并涂布于mrs固体培养基，37℃倒置培养48h。挑取菌体光滑、呈白色或乳白色单菌落进行革兰氏染色并镜检，选择杆状且革兰氏阳性菌，在mrs固体培养基上划线纯化2-3次。挑取划线纯化的单菌落接种于mrs液体培养基继续37℃培养24~48h后，将菌液与灭菌甘油按照1∶1比例混合置于-80℃冰箱保藏待用。
26.（1）采用天根基因组试剂盒提取基因组dna；（2）16srdnapcr扩增，采用通用引物，上游引物27f：gagagtttgatcctggctcag，下游引物1492r：tacggctaccttgttacgac。
27.pcr反应体系为50ul：taqreactionbuffer(10
×
)5ul，pcrdye5ul，dnpts1ul，taqdymerase0.5ul，dna模板2ul，27f2ul，1492r2ul，加水补充至50ul。
28.pcr扩增程序为：95℃预变性5min；循环30次（95℃、30s变性；55℃、30s退火；72℃、90s延伸）；72℃延伸7min，末端延伸20℃、3min。
29.（3）pcr扩增产物测序pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，送至青岛擎科生物技术公司进行测序。测得序列通过blast程序与genbank数据库进行同源性比对。
30.从三份不同的母乳样品中利用透明圈法分离获得16株细菌，进行16srdna扩增均
得到约1500 bp的目的条带（图1），其核苷酸序列如seq id no.1所示。
31.将目的条带测序后进行系统进化树分析，由图2的系统进化树可知qs-20菌株与streptococcus salivarius亲缘关系最近，因此其属于唾液链球菌。
32.将菌株qs-20进行菌种保藏，所述唾液链球菌qs-20的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2022年1月13日；分类命名为：唾液链球菌streptococcus salivarius，保藏编号为cgmcc 7.456，该生物材料的存活性检测结果为：存活。
33.2、形态学观察对qs-20菌株进行菌落形态和革兰氏染色细胞形态观察，结果如图3所示。qs-20菌株白色凸起菌落，表面光滑，菌落直径0.2-1mm，细胞呈球形或者卵圆形，直径不超过1 μm，呈链状排列，在液体培养基中常呈沉淀生长。qs-20菌株在添加有碳酸钙的mrs培养基上可以产酸形成透明圈，革兰氏染色的结果表明qs-20菌株为革兰氏阳性菌，同时该菌株的过氧化氢酶实验呈现阴性，该结果进一步说明qs-20菌株为革兰氏阳性菌中的链球菌，这与进化树分析结果一致。
34.实施例2：唾液链球菌qs-20的生化性质1、唾液链球菌qs-20菌株的生长曲线和产酸曲线参见图4，qs-20菌株可以在较短时间内快速进入对数生长期，适应性强，适应周期短，5-15h进入指数生长期，后进入稳定期，52 h之内没有明显的衰亡期。在指数生长期内，唾液链球菌qs-20的产酸性较强，ph明显下降，因此适合作为发酵剂。
35.2、唾液链球菌qs-20菌株抗氧化活性测定dpph自由基被抗氧化剂还原后，成为稳定的dpph分子，使颜色由深紫色变为淡黄色，dpph的紫色强度与样品的抗氧化活性成反比。dpph具有稳定结构，若能将其清除，则表明受试菌株具有降低过氧化氢、清除各类自由基的连锁反应作用。将唾液链球菌qs-20菌株接种于mrs肉汤液体培养基中，测定不同培养时间发酵上清液抗氧化活性。
36.结果如图5所示，可以看出qs-20菌株具有很高的dpph清除率，在12h之后清除率达到70%以上，36h可以达到80%以上，显示出较强的抗氧化活性。
37.3、唾液链球菌qs-20菌株的耐酸能力测定将qs-20菌株接种到ph 3.0的mrs肉汤液体培养基中培养3、5h，以不含菌体的ph 3.0的液体培养基为空白，测定od600 nm，以培养时间为横坐标，吸光度值为从坐标，画折线趋势图。
38.结果如图6可知，在3h内吸光值逐渐增加，说明qs-20菌株可以存活并生长；在5h的吸光值与3h相比，变化不大，说明菌株的生长受到抑制。由此可知，该菌株在酸性条件下的最大存活耐受时间为0-3h。
39.4、唾液链球菌qs-20菌株耐胆盐能力测定将qs-20菌株接种到含不同胆盐浓度（0.1%、0.2%、0.3%）的mrs肉汤液体培养基中培养3、5h，以不含菌体的不同浓度胆盐的液体培养基为空白，测定od600nm的吸光度，以培养时间为横坐标，吸光度值为从坐标，画折线趋势图。
40.结果如图7可知，唾液链球菌qs-20在5h内能够存活并生长，3h以后高浓度的胆盐会对菌株的生长起到一定的抑制作用。
41.实施例3：唾液链球菌qs-20的抑菌能力分析培养大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌，并检测唾液链球菌qs-20对上述菌株的抑菌活性。
42.图8的结果显示，唾液链球菌qs-20菌株对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌均有抑制活性，其中对于枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制活性较强。
43.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。