海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因及VIGS沉默体系的构建

海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因及vigs沉默体系的构建
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体涉及海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因及vigs沉默体系的构建。


背景技术：

2.海马齿(sesuvium portulacastrum)，又名滨水菜，属于双子叶植物纲石竹亚纲番杏科海马齿属，是一种贴地生长在热带和亚热带近海岸沙地的肉质草本盐生植物，主要分布于热带和亚热带海岸的沙滩上。在中国，海马齿主要分布在海南、广东、福建、澎湖列岛以及台湾中南部的海岸地区。海马齿作为红树林湿地生态系统的一员，是红树林伴生植物，具有繁殖快且在多种逆境环境下表现出其耐盐碱、耐干旱以及耐强光和重金属的自然特性，因而可以作为土壤修复以及盐碱地改造的潜力植物。通过建立遗传转化体系是验证海马齿的抗逆性尤其是耐盐性相关基因功能的有效途径。
3.目前对海马齿相关基因的研究才开始起步，通过pacbio等测序手段及生物信息学工具，科研工作者获得很多基因序列的同时也克隆了很多相关基因，却无法进入更深层次的研究，其中的主要原因就包括应用于海马齿的遗传转化体系不成熟，以及相关遗传转化结果的检测手段较为稀缺。目前海马齿遗传转化体系建立的相关报道甚少。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题为：如何构建一种基于vigs体系的海马齿sppds基因沉默系统。
5.本发明的技术方案为：一种海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因sppds，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.一种用于沉默基因sppds的特异性片段，该特异性片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.一种重组载体，该重组载体由ptrv2载体和连接在ptrv2载体上的特异性片段构成，所述特异性片段的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.沉默基因sppds的vigs沉默系统，该系统包括上述所述的重组载体和辅助载体，所述辅助载体为ptrv1载体，所述重组载体与辅助载体的体积比为1:1。
9.上述所述的重组载体或上述所述的vigs沉默系统在沉默海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因sppds上的应用。
10.沉默海马齿八氢番茄红素脱氢酶基因sppds的vigs沉默体系的构建方法，包括如下步骤：
11.(1)克隆出seq id no.2所示的特异性片段，并将该特异性片段通过同源重组的方法连接至ptrv2载体；
12.(2)将步骤(1)的产物转化至农杆菌中；
13.(3)将步骤(2)得到农杆菌浸染海马齿。
14.进一步地，步骤(1)中，克隆特异性片段的方法为：提取海马齿总的rna,反转得到cdna第一链，以此链为模板，以seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸序列为引物进行第一轮pcr扩增；然后以第一轮pcr扩增产物为模板，以seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸序列为引物进行第二轮pcr扩增，扩增出含有同源臂的特异性片段。
15.进一步地，第一轮pcr扩增的反应参数：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火50℃30s；延伸72℃40s；35个循环；延伸72℃7min；第二轮pcr扩增的反应参数：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火60℃30s；延伸72℃40s；35个循环；延伸72℃7min。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.本发明不依赖于转基因技术，具有操作快速、简单、有效、低成本且实验周期短的特征。利用本发明构建的海马齿vigs体系可有效降低海马齿中sppds基因的表达水平，可实现病毒诱导的相关基因沉默性状，同时本发明所构建的vigs系统具有很好的稳定性，可以用来验证海马齿中基因的功能，对挖掘具有抗逆功能的海马齿基因，培育优良的土壤修复以及盐碱地改造潜力的植物品种奠定基础。
附图说明
18.图1：病毒诱导的海马齿八氢番茄红素脱氢酶(sppds)基因沉默体系的流程图。
19.图2：a1～a3为海马齿叶片总rna提取琼脂糖凝胶电泳图；b1为未酶切的ptrv2空载体琼脂糖凝胶电泳图；b2～b3为ptrv2空载体酶切产物；c1～c3为插入目的片段pcr产物；d1～d3为带有同源臂的插入目的片段pcr产物；e1为ptrv2空载体(dh5α)菌p检测结果；e2～e4为三个阳性克隆sptrv2-pds-dh5α检测结果；f1为ptrv2空载体(gv3101)菌p检测结果；f2～f4为三个阳性克隆sptrv2-pds-gv3101检测结果；m：marker dna ladder dl2000。
20.图3：a～c为无任何处理组海马齿叶片表型(空白对照)；d～f为ptrv2空载体侵染25d处理组海马齿叶片表型(阴性对照)；g～i为重组病毒载体sptrv2-pds侵染25d处理组海马齿叶片表型。
21.图4：a为类胡萝卜素含量测定结果；b为实时荧光定量(qrt-pcr)检测结果。ck：空白对照组；ptrv2：空载体ptrv2侵染的海马齿苗；sptrv2-pds：重组病毒载体sptrv2-pds侵染的海马齿苗。
具体实施方式
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
23.实施例1:海马齿sppds基因特异性目的片段的克隆及表达载体构建
24.1.sppds全长基因序列获得
25.海马齿植株材料采自海南省三亚市吉阳区红纱码头附近，实验材料种植于海南师范大学生命科学国家重点实验室，室外条件正常培养。选取长势较好，包含根、茎、叶和花等营养器官在内的完整植株作为材料并利用pacbio三代测序技术进行转录组测序，对转录组测序结果利用本地blast等生物信息学工具查找确认并获得海马齿八氢番茄红素脱氢酶sppds基因cdna全长基因序列，其全长核苷酸序列如seq id no.1所示。
26.2.sppds基因特异性片段克隆
27.利用总rna提取试剂盒提取海马齿总的rna,再利用反转录试剂盒反转得到cdna第一链，以此链为模板，设计sppds基因cds序列中的445bp的特异性片段引物(sppdsf和sppdsr)，以反应参数：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火50℃30s；延伸72℃40s；35个循环；延伸72℃7min；4℃保存。扩增出第一轮pcr产物(图2:c1～c3)。同时设计用于给目的基因片段两端加上同载体xbai和saci酶切位点附近相同序列的同源臂引物(trv2-sppdsf和trv2-sppdsr)，以第一轮pcr产物为模板，同时以反应参数：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火60℃30s；延伸72℃40s；35个循环；延伸72℃7min；4℃保存。扩增出含有同源臂的目的基因产物(图2:d1～d3)，便于利用无缝克隆手段将目的基因插入载体中，引物序列如下：
[0028][0029]
利用高保真mix扩增上述目的片段，pcr体系如下：
[0030][0031]
将pcr产物加入6
×
loading buffer缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳(110v，20min)，之后用胶回收试剂盒回收纯化目的基因。
[0032]
3.对ptrv2载体进行酶切(37℃，2h；65℃，20min)，并回收纯化酶切产物，酶切体系如下：
[0033][0034]
4.利用无缝克隆技术将目的基因与线性化载体进行连接(50℃，30min)，重组反应体系如下：
[0035][0036]
5.大肠杆菌(dh5α)转化和培养
[0037]
(1)将上述重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞(dh5α)，依次冰浴30min，42℃水浴热激80s，热激结束后再次冰浴3min，之后于无菌操作台内加入900ul lb液体培养基(未加抗生素)并在37℃，200rpm条件下振荡培养45min，最后取150ul复苏的菌液，涂布至带有卡那霉素抗性的lb固体培养基上，37℃恒温培养箱倒置过夜培养。
[0038]
(2)用无菌枪头挑取单克隆于1.5ml含有卡那霉素的lb液体培养基的离心管中，在37℃，200rpm条件下震荡培养10h。
[0039]
(3)用通用引物trv2f：ttactcaaggaagcacgat，trv2r：cctaaaacttcagacacgg对单克隆菌液进行pcr阳性检测，检测体系及反应条件如下：
[0040][0041][0042]
(4)将检测阳性的菌落送至生工生物公司进行测序(测序结果见seq id no:2)，将序列比对正确的阳性菌扩大培养后与60％甘油按3:1(菌液:甘油)比例混合保存至-80℃冰箱。(阳性菌命名为sptrv2-pds-dh5α)
[0043]
(5)提取序列正确的阳性菌液质粒于-20℃保存，为下一步转化gv3101农杆菌做准备。
[0044]
6.农杆菌转化和培养
[0045]
本发明选用的农杆菌gv3101感受态细胞采购自上海唯地生物技术有限公司，具体转化步骤如下：
[0046]
(1)于-80℃冰箱取出农杆菌(gv3101)感受态细胞，待其处于冰水相融状态，将其
插入冰中继续融化。
[0047]
(2)将提前测好浓度的sptrv2-pds质粒吸取1ug至100ml已融化的农杆菌(gv3101)感受态细胞中，轻弹混匀之后，依次于冰上5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min进行操作。
[0048]
(3)在超净工作台内加入700ul无抗性的lb液体培养基，于28℃，200rpm的摇床中震荡培养3h使菌体活化。
[0049]
(4)6000rpm离心1min将菌体沉淀收集于离心管底部并吸取部分上清，用移液枪重新吹打悬浮菌液，吸取100ul左右菌液涂布于卡那、利福平双抗性的lb固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。
[0050]
(5)在超净工作台用无菌枪头挑取单克隆于1.5ml含有卡那、利福平的lb液体培养基的离心管中，在28℃，200rpm条件下震荡培养24h。
[0051]
(6)用通用引物对单克隆菌液进行pcr阳性检测，方法同5.(3)。
[0052]
(7)对检测呈阳性的单克隆进行扩大培养，于超净工作台内将阳性菌液与60％甘油按3:1比例混合保存至-80℃冰箱。(阳性菌命名为sptrv2-pds-gv3101)
[0053]
7.重组菌的扩大培养
[0054]
取重组菌sptrv2-pds-gv3101(干扰载体)、ptrv2-gv3101(空载体)、trv1-gv3101(辅助载体)三种菌液于超净工作台内，各吸取500ul至45ml含有卡那霉素(50ug/ml)、利福平(20ug/ml)抗性的lb液体培养基中，于28℃，200rpm条件下震荡培养10-12h其中trv1-gv3101(辅助载体)菌液按照与另外两种菌1:1的体积进行扩大培养。
[0055]
8.侵染菌液的制备
[0056]
待7.中所有菌液的od600值均达到1.5-1.8之间时，于4000rpm离心15min，缓慢倒掉上清液，收集菌体沉淀。配置重悬液母液：mes(9.76g/100ml，ph＝5.6)；mgcl2(20.33g/100ml)；as(0.3924g/10ml，避光-20℃保存)。分别吸取重悬液母液mes:4ml，mgcl2:2ml，as:200ul于无菌容器内，用无菌水定容至200ml配置成重悬液工作液。随后用重悬液工作液重新悬浮菌体沉淀至od600值达到1.5-1.8之间，室温静置4h。随后将菌液sptrv2-pds-gv3101(干扰载体)与trv1-gv3101(辅助载体)按照体积比1:1混合，标为混合菌液1；将菌液ptrv2-gv3101(空载体)与trv1-gv3101(辅助载体)按照体积比1:1混合，标为混合菌液2。
[0057]
9.海马齿幼苗侵染
[0058]
对海马齿材料进行菌液侵染前两天，保证营养土充分的湿度，使得海马齿叶片足够饱满。准备好混合菌液1和混合菌液2，选用规格为1ml的无菌一次性注射器，用针头轻轻在海马齿叶片背面扎一个不刺穿叶片的小伤口，随后用注射器吸取菌液并将其分别注射至海马齿叶片中，保证菌液蔓延至整个叶片。注射侵染工作完成后，将海马齿材料放在室温黑暗条件下生长24小时，随后使其在弱光下缓冲12小时，最后放于26℃恒温培养室中正常培养。(注：侵染组sptrv2-pds为实验组，侵染组ptrv2为阴性对照组，ck组为无处理的空白对照组)
[0059]
10.海马齿vigs系统沉默效率检测
[0060]
(1)如图3所示：a～c为空白对照组叶片表型；d～f为ptrv2空载体侵染25d叶片表型(阴性对照)；g～i为重组病毒载体sptrv2-pds侵染25d叶片表型。重组病毒载体sptrv2-pds实验组海马齿出现植株生长缓慢及叶片发黄症状，而空白对照组相较于阴性对照组海
马齿叶片表现为更加肥厚且叶面积更大，这可能是因为注射器针头刺伤叶片及ptrv2空载体病毒轻微感染的缘故，但叶片颜色差异不大，未出现黄化现象，说明沉默载体发挥了作用。
[0061]
(2)不同海马齿材料叶片类胡萝卜素含量分析：类胡萝卜素含量测定方法参照植物生理学实验指导，项目指标测定设置5个生物学重复。
[0062]
(3)不同海马齿材料sppds基因相对表达量分析：反转录和实时荧光定量反应分别采用ii all-in-one first-strand cdna synthesis supermix for qpcr(one-step gdna removal)和abclonal genious 2
×
sybr green fast qpcr mix，以海马齿gapdh基因作为内参基因，选择将沉默区域和非沉默区域都包含在内的核酸序列区段设计实时荧光定量引物用于海马齿中sppds基因检测，定量引物如下：
[0063]
gapdh-f：ttggcatcgttgagggtct
[0064]
gapdh-r：cagtgggaacacggaaagc
[0065]
qpcr-pds-f：aggccaaggtcctgaagtat
[0066]
qpcr-pds-r：cagcaccttccatcgaagcc
[0067]
扩增程序为：95℃温育3min，95℃温育5s，60℃温育30s，共40个循环。基因相对表达量数据处理采用2-δδct
法，每个样品做三个生物学重复。
[0068]
(4)通过对不同材料的类胡萝卜素含量及sppds基因相对表达量进行测定，结果表明，重组病毒载体sptrv2-pds侵染海马齿25天后，sptrv2-pds组海马齿叶片类胡萝卜素含量极显著低于ck组和ptrv2组，ptrv2组类胡萝卜素含量较低于ck组但差异不显著。同时，对海马齿sppds基因相对表达量比较发现，sptrv2-pds组pds基因相对表达量显著低于ck组和ptrv2组，而ck组和ptrv2组pds基因相对表达量无显著差异。这表明sptrv2-pds组有效沉默了海马齿pds基因，并使得类胡萝卜素含量相较于ck组和ptrv2组极显著下降，进一步证明重组病毒载体在海马齿植株内复制转移并发挥了作用。(详见图4)这些数据说明，vigs系统同样适用于海马齿基因功能鉴定，且具有一定的稳定性。