提早枇杷开花时间的EjWUSa基因及其编码蛋白与应用

提早枇杷开花时间的ejwusa基因及其编码蛋白与应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种枇杷ejwusa蛋白及其编码基因和应用。


背景技术：

2.枇杷属于蔷薇科枇杷属(eriobotrya)植物，原产于我国亚热带的常绿果树，其果实成熟期于正值水果淡季的初夏。货架期的长短影响着枇杷的经济效益，通过花期提前来促进枇杷早熟是延长货架期的重要措施，因此研究花期调控关键基因在调控枇杷花发育过程中的表达特性具有重要意义，并能为枇杷品种的花期定向遗传改良积累基因资源。
3.成年花器官是从顶端分生组织(sam)发育而来的，营养分生组织产生花序分生组织，花序分生组织产生花分生组织(fm)，花分生组织产生花器官原基，最后产生花器官。wuschel(wus)是sam组织中心的特征基因，参与协调cz区干细胞的分裂和分化，调控着侧生器官的发生，例如花器官，叶器官等。在拟南芥中的研究发现，当atwus基因突变后，会引起干细胞的数量得不到维持，从而导致茎端分生组织与花序分生组织的提前终止，异位表达atwus可形成异位的分生组织和突起。尽管如此，wus基因对fm发育的具体影响及分子机制还不是很清楚。其次，花相关基因的研究多集中在草本植物中，尤其是拟南芥和观赏植物中，在木本植物中研究较少，在枇杷中相关的报道更少。因此，研究枇杷wus基因对fm发育的影响及分子机制是非常有必要的，这将有助于枇杷早花品种的选育，并为其他植物开花机制的研究提供参考。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，筛选得到了在花中表达量较高的ejwusa基因，进行了克隆、表达特性和功能特性的分析，提供了一种枇杷ejwusa蛋白及其编码基因和应用。
5.首先，本发明提供枇杷ejwusa蛋白，其为：
6.1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
7.2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
8.本发明还提供编码所述的枇杷ejwusa蛋白的基因。
9.优选的，所述基因的序列如seq id no.1所示。
10.本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
11.本发明还提供所述基因在促进植物开花中的用途。
12.在本发明一个具体实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提早植物的开花结果时间。
13.本发明从枇杷花芽中分离得到了1个枇杷花发育调控密切相关的ejwusa基因，亚细胞定位显示其在细胞核中表达。实时荧光定量pcr显示ejwusa基因在二倍体和三倍体枇杷早、晚花品种中均有表达，且表达量主要集中于花发育的前两个时期和最后一个时期，这
表明ejwusa有利于fm的分化，在花芽的生理分化和形态分化中均发挥着重要的作用。利用基因工程手段构建了ejwusa基因的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能提早拟南芥开花时间，进而促进结果时间。本发明为植物花期的改造提供了很好的应用前景。
附图说明
14.图1所示是ejwusa基因的编码区序列克隆的电泳照片。其中，m为dl2000 dna marker，1为ejwusa基因orf的pcr产物；箭头指示为pcr扩增的目的基因条带。
15.图2所示是枇杷ejwusa基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，显示该基因的表达产物定位于细胞核。gfp：绿色荧光蛋白；bf：明场成像；merged：gfp和bf的合并后的图像。
16.图3所示是枇杷ejwusa基因在在二倍体和三倍体枇杷早、晚花品种中的表达显示出显著差异性。其中，同一品种中不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。s1:花芽的生理分化期；s2:花芽形态分化期；s3:花序主轴分化期；s4:花序支轴分化期；s5:花序侧生支轴快速伸长期；s6:小花分化期；s7:花蕾露白期；s8:盛花期。
17.图4是转基因拟南芥35s:ejwusa阳性植株的pcr鉴定。其中，m为dna分子质量标准(dl2000)，wt为野生型拟南芥阴性对照，p为pfgc5941-ejwusa质粒。
18.图5是超表达拟南芥和野生型拟南芥抽薹时间的照片，过表达拟南芥较野生型拟南芥抽薹提早10d左右。
19.图6是超表达拟南芥莲座叶数目统计图。
20.图7是超表达拟南芥和野生型拟南芥开花时间的照片。过表达拟南芥较野生型拟南芥花期提早9d左右。
具体实施方式
21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
22.实施例1枇杷ejwusa基因cdna序列的克隆
23.采集新鲜长度约0.5cm的枇杷分化期的花芽，迅速取样后，放入冻存管中，放入液氮中速冻2h后，然后放入-80℃超低温冰箱中待用，采用rna提取试剂盒提取枇杷花芽中的总rna。
24.基于本团队前期的枇杷花芽不同发育时期的转录组测序数据，在枇杷ejwusa基因编码区序列全长两端设计特异引物ejwusaf 5'-atggaccctcaacagaac-3'和ejwusar 5'-tcaatatgatctg aagta-3'，反应条件为94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，进行35个循环；72℃10min。pcr反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的条带(图1)，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收pcr产物。连接到pmd19-t载体后，构建pmd19-ejwusa质粒，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对ejwusa基因的编码区序列进行验证。
25.使用dnaman软件对编码区序列验证实验的pcr测序结果，进行序列拼接分析，得到ejwusa基因cdna的编码区序列(seq id no.1)。使用dnastar软件，对ejwusa基因的cdna的
编码区序列进行蛋白质翻译，序列如seq id no.2所示。
26.实施例2枇杷ejwusa基因的亚细胞定位分析
27.利用snapgene软件设计引物：
28.pcambia1300-ejwusaf：5'-gccatggaggccagtgaattcatggaccctcaacagaac-3'；
29.pcambia1300-ejwusar：5'-caggtcgactctagaggatccatatgatctgaagtaatc-3'；以测序正确的pmd19-ejwusa质粒为模板进行扩增，用限制性内切酶ecor1和bamh1对pcambia1300质粒进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用clonexpress ii one step cloning kit将酶、扩增产物和酶切后的pcambia1300载体按照5ul、1ul、4ul配成10ul的体系在50℃下连接30min，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液pcr和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。提取构建好的载体质粒通过冻融法转入农杆菌gv3101感受态细胞。
30.从固体lb培养基平板上挑取农杆菌的单克隆菌落，接种至10ml液体培养基(含rif+kan)中，28℃，250rpm培养至od
600
＝0.5。取5ml培养液离心10min收集菌体，然后加入2ml渗透液重新悬浮菌体，接着离心10min加入2ml渗透液(10mm mgcl2、10mm mes-koh，ph＝5.6，150μm乙酰丁香酮)重新悬浮菌体。最后稀释成od
600
＝0.03～0.1后进行烟草叶片的转化，转化后的烟草暗培养1-2d后，进行gfp荧光的观察。结果表明，ejwusa蛋白定位于细胞核(图2)。
31.实施例3枇杷ejwusa基因的实时荧光定量pcr分析
32.分别提取枇杷二倍体晚花品种“常白1号”和三倍体早花品种“华玉无核”8个时期花芽的总rna，8个时期分别为：花芽生理分化期(s1)、花芽形态分化期(s2)、花序主轴分化期(s3)、花序支轴分化期(s4)、花序侧生支轴快速伸长期(s5)、小花分化期(s6)、花蕾露白期(s7)、盛花期(s8)，其中s1属于fm生理分化期，s2～s8属于fm形态分化期。检测其完整性和浓度后，逆转录成cdna。以枇杷cdna序列为模板，利用oligo7.0软件设计实时荧光定量pcr引物qrtejwusaf:5'-tggatcatgggttggtgttga-3'和qrtejwusar:5'-agccatggatgtcttcaccg-3'。以枇杷ejactin基因为内参基因，引物序列为qrtejactinf：5'-aatggaactggaatggtcaaggc-3'和qrtejactinr：5'-tgccagatcttctccatgtcatc-3'，利用pcr对其特异性进行检测，在确保pcr特异性扩增前提下，进行实时荧光定量pcr实验，每个反应设置3个生物学重复。pcr反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。
33.ejwusa基因在枇杷二倍体晚花品种和三倍体早花品种花芽中均有表达，且在花芽分化的前两个时期和最后一个时期表达量较高(图3)。这表明ejwusa有利于fm的分化，在花芽的生理分化和形态分化中均发挥着重要的作用。
34.实施例4枇杷ejwusa基因转化拟南芥
35.利用软件oligo7.0设计引物，pgc5941-ejwusaf：5'-acaattaccatggggcgcgccatggaccctcaacagaac-3'；pgc5941-ejwusar：5'-ctctagactcacctaggatcctcaatatgatctgaagta-3'；以测序正确的pmd19-ejwusa质粒为模板进行扩增，用限制性内切酶asc1和bamh1对pgc5941质粒进行双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳后进行回收。利用clonexpress ii one step cloning kit将酶、扩增产物和酶切后的pcambia1300载体按照5u、1u、4u配成10u的体
系在50度下连接30分钟，并将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，之后进行菌液pcr和双酶切验证后进行测序，确保目的基因序列成功连接到载体。验证正确的质粒命名为fgc5941-ejwusa质粒。
36.取1μg的pfgc5941-ejwusa质粒，加入100μl农杆菌感受态细胞，混合均匀；冰浴5min，转入液氮迅速冷冻5min，快速置于37℃，水浴5min；加入800μl的lb液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至lb(50ml lb+50μg/ml kan+50μg/ml rif)固体选择培养基中，涂布均匀，在28℃条件下倒置培养48h。
37.将含有pfgc5941-ejwusa阳性克隆的农杆菌在25ml固体平板培养基(含有25μg/ml kan+25μg/ml rif)上划线，28℃，倒置培养48h；挑取单菌落至5ml lb液体培养基(50μg/ml kan和50μg/ml rif)，在28℃摇床中，200rpm振荡培养15-20h，取100μl至10ml lb液体培养基(50μg/ml kan和50μg/ml rif)培养过夜，再取2ml菌液至100ml lb液体培养基(50μg/ml kan和50μg/ml rif)培养至od
600
＝0.8～1.5，将菌液转至2个50ml离心管，在4℃，5 000rpm离心5min，倒掉上清液，每管加入侵染缓冲液(0.5％silwet l-77，5％蔗糖，1/2ms培养基)50ml。
38.将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(珍珠岩：蛭石：营养土＝1:4:5)，在温度22℃，湿度70％，14h光照/10h黑暗条件下培养；转基因前将野生型拟南芥植株浇透水；在侵染时将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽侵入pfgc5941-ejwusa农杆菌浸染液中60s；罩上黑色塑料袋，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养24h后，揭开黑色塑料袋，放置正常培养；上述方法侵染3次，间隔时间为7d。
39.收取ejwusa转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中进行春化处理14d；将春化的种子均匀播撒在培养土上，喷洒水后用保鲜膜覆盖保湿，发芽后揭去保鲜膜，按照常规的水肥管理。待苗子长至十天左右喷洒20mg/l的草铵膦，每三天喷洒一次，一共喷洒三次。将存活的的拟南芥植株培养20d左右，每一植株取一定量的叶片，提取ejwusa转基因拟南芥dna，取1小片拟南芥的叶片置于2.0ml的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μl提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μl乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；13000rpm，高速离心5min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，13000rpm，离心10min，倒掉清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μl无菌水。
40.以未转基因野生型拟南芥的dna作为对照，对转基因拟南芥的阳性植株进行ejwusa基因进行确证。根据枇杷ejwusa基因克隆引物(ejwusaf：5'-atggaccctcaacagaac-3'和ejwusar：5'-tcaatatgatctgaagta-3')，用2
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mix taq，1μl dna，对抗草铵膦的拟南芥植株进行pcr鉴定，并把胶回收纯化液送擎科公司测序；共获得9株阳性的ejwusa超表达t0代拟南芥植株(图4)。
41.实施例5枇杷ejwusa基因的转基因拟南芥的表型鉴定
42.我们对拟南芥的抽薹时间、莲座叶数目和开花时间进行了观察、统计和拍照。在相同的种植条件下，超表达拟南芥在萌芽后21天时抽薹，而野生型拟南芥在31天时才抽薹(图5)；前人研究发现，拟南芥莲座叶的数目与开花早晚成负相关，野生型拟南芥抽薹时莲座叶的数目一般为12或13片。因此，我们在拟南芥花薹高1cm时统计了莲座叶的数目：超表达拟
南芥抽薹时莲座叶的数目仅有7、8片，少量植株有9片，明显少于12或13片(图6)。最后，我们统计了拟南芥的开花时间：超表达拟南芥在萌发后28d时开花，而野生型拟南芥在37天时才开花(图7)。值得注意的是，与野生型拟南芥相比，超表达拟南芥在花薹较高时才开花。
43.由此可知，ejwusa是花分生组织特征基因，负责花分生组织的起始分化与形成，其转基因拟南芥材料可用于植物开花时间的改造，进而使植物提早开花及果实成熟时间，有利于早熟品种的选育。
44.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。