一种检测吡虫啉的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测吡虫啉的半抗原、人工抗原、 抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.新烟碱类杀虫剂的作用机制主要是通过选择性控制昆虫神经系统烟碱型乙 酰胆碱酯酶受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，从而导致害虫出现麻痹 进而死亡。由于该类杀虫剂具有独特的作用机制，与常规杀虫剂没有交互抗性， 其不仅具有高效、广谱及良好的根部内吸性、触杀、和胃毒作用，而且对哺乳 动物毒性低，可有效防治同翅目、鞘翅目、双翅目和鳞翅目等害虫，对传统杀 虫剂防治产生抗药性的害虫也有良好的活性。吡虫啉(imidacloprid)是第一个 开发的新烟碱类杀虫剂，尽管一系列新型新烟碱类杀虫剂逐渐投入市场，吡虫 啉仍是目前应用最为广泛的新烟碱类杀虫剂，其销售额一度超越拟除虫菊酯类 杀虫剂。
3.虽然新烟碱类除虫剂对哺乳动物低毒，但已有文献证明过量、长期的摄入 新烟碱类农药对环境及人类健康存在较大的威胁。接触新烟碱类杀虫剂会导致 几种严重的人类疾病，例如癌症，慢性肺部疾病，先天缺陷和不育症等。为了 提高谷物及药食两用物质的产量，吡虫啉杀虫剂常用于该类农产物的害虫的防 治。《gb 2763-2021食品中农药最大残留限量标准》对玉米、小麦等谷物，水 果及蔬菜进行了限量规定，其中玉米和小麦最大残留限量不得超过0.05mg/kg。
4.虽然市场上已有检测吡虫啉的试剂盒，但其使用的半抗原、人工抗原及抗 体均为国外已有报道。目前仍缺乏自主创新的吡虫啉半抗原结构，高特异性和 高灵敏度的吡虫啉抗体，及可适用于多种复杂基质的吡虫啉检测试剂盒。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种检测吡虫啉的半抗原、人工 抗原、抗体及其制备方法和应用。
6.为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
7.提供一种检测吡虫啉的半抗原，其结构式如式ⅰ所示：
[0008][0009]
提供一种检测吡虫啉的人工抗原，其人工抗原既作为免疫原又作为包被原， 其结构式如式ⅱ所示：
[0010][0011]
提供一种检测吡虫啉的的人工抗原的制备方法，人工抗原由半抗原通过活 泼酯法偶联载体蛋白得到。
[0012]
进一步地，一种检测吡虫啉的的人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
s1.将载体蛋白溶解于pbs缓冲液中，0.01mol/l，ph＝7.4，得到载体蛋白 溶液；
[0014]
s2.将半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺溶解于n，n-二甲基 甲酰胺中，得到半抗原溶液；
[0015]
s3.将所述半抗原溶液与所述载体蛋白溶液混合，冰水浴避光搅拌12小时；
[0016]
s4.用pbs缓冲液透析s3所得反应液即得人工抗原。
[0017][0018]
优选地，步骤s4所述透析为透析3天，每天换液4次。
[0019]
优选的，步骤s2中所述半抗原与nhs、dcc的摩尔质量比为1:2:2。
[0020]
优选的，步骤s2中所述半抗原与步骤s1中所述载体蛋白的摩尔质量比为 1～2:1～4。
[0021]
进一步地，载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或者鸡卵清白蛋白任 意一种或几种。
[0022]
提供一种检测吡虫啉的特异性抗体，特异性抗体由人工抗原免疫动物制备 得到的杂交瘤细胞株分泌产生，杂交瘤细胞株命名为imib7c3，其分类命名为 小鼠杂交瘤细胞，已于2022年01月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，保藏编号为cgmcc no.45035。
[0023]
提供一种检测吡虫啉的人工抗原组，由载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗 原既作为免疫原又作为包被原制得。
[0024]
提供一种特异性抗体和人工抗原组在用于检测吡虫啉的试剂盒中的应用。
[0025]
提供一种特异性抗体在谷物及药食两用物质中吡虫啉的免疫快速检测中的 应用，以载体蛋白为钥孔血蓝蛋白的人工抗原作为包被原，以载体蛋白为钥孔 血蓝蛋白的人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检 测。
[0026]
本发明的有益效果为：
[0027]
1.本发明制备得到了吡虫啉半抗原，应用半抗原偶联载体蛋白得到用于免疫 的人工抗原，应用半抗原制备得到用于包被的人工抗原，应用人工抗原制备得 到用于检测吡虫啉的抗体，该抗体对吡虫啉具有高灵敏度和高特异性的识别能 力，半抑制浓度为1.3ng/ml，最低检测限为0.1ng/ml，对其类似物氯噻啉有 30.9％交叉反应，吡虫啉代谢物5-羟基吡虫啉和烯烃吡虫啉有9.0％和5.8％的交 叉反应，其他类似物的交叉反应低于1.3％，可排除其类似物的干扰，为建立吡 虫啉的酶联免疫检测方法提供了核心材料。
[0028]
2.本发明建立了一种玉米、小麦、三七、山药、黄芪、大枣、金银花中吡虫 啉的免疫快速检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低，对 操作人员技能要求较低等优点，适用于现场大量样品的快速检测。
[0029]
3.本发明利用吡虫啉抗体开发了吡虫啉免疫检测试剂盒在谷物及药食两用 物质中吡虫啉的免疫快速检测中的应用。
附图说明
[0030]
图1为吡虫啉半抗原的合成路线图；
[0031]
图2为吡虫啉人工抗原的合成路线图；
[0032]
图3为半抗原紫外吸收图谱；
[0033]
图4为bsa载体蛋白紫外吸收图谱；
[0034]
图5为ova载体蛋白紫外吸收图谱；
[0035]
图6为klh载体蛋白紫外吸收图谱；
[0036]
图7为bsa载体蛋白人工抗原紫外吸收图谱；
[0037]
图8为ova载体蛋白人工抗原紫外吸收图谱；
[0038]
图9为klh载体蛋白人工抗原紫外吸收图谱；
[0039]
图10为吡虫啉抗体对吡虫啉的标准抑制曲线。
具体实施方式
[0040]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理 解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的 普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精 神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保 护之列。
[0041]
实施例1
[0042]
吡虫啉半抗原的合成与鉴定
[0043]
取吡虫啉(5.15g)，氢氧化钾(2.25g)溶解于20ml二甲基亚砜，逐滴加 巯基丁酸溶液(2.40g巯基丁酸溶解于二甲基亚砜)，混合溶解于100℃搅拌1 小时，冷却至室温加入50ml纯水，分离纯化即可得到半抗原(吡虫啉半抗原 合成过程见图1)。
[0044]
半抗原质谱结果：ms：c
13h17
n5o4s：339.0，esi-[m-h]-：338.0。
[0045]
半抗原核磁结果：1hnmr(600mhz,meod)δ8.36(d,j＝1.8hz,1h), 7.61(dd,j＝8.3,2.3hz,1h),7.29(d,j＝8.3hz,1h),4.48(s,2h),3.71(dd, j＝10.4,8.2hz,2h),3.52(dd,j＝10.5,8.2hz,2h),3.22
–
3.16(m,2h),2.44(t, j＝7.3hz,2h),2.00
–
1.94(m,2h).
[0046]
半抗原的结构式如式ⅰ所示：
[0047]
[0048]
半抗原采用系统命名法命名为：3-[5-(2-硝基亚氨基咪唑啉-1-基甲基)-2
‑ꢀ
吡啶基硫基]丁酸。
[0049]
实施例2
[0050]
吡虫啉人工抗原的合成与鉴定
[0051]
1、吡虫啉人工抗原的合成
[0052]
将半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白，具体地说，称取0.05mmol半抗原， 0.1mmolnhs和0.1mmol dcc溶解于500μl dmf中，室温下避光搅拌12h， 得到活化液；将0.1mmol载体蛋白溶解于1ml的pbs缓冲液(0.01mol/l，ph ＝7.4)中，再将活化液冰水浴搅拌下缓慢逐滴加入，冰水浴反应12h；用pbs 缓冲液透析3天，每天4次，透析结束后即得吡虫啉人工抗原，分装于离心管 中，于-20℃保存，以供使用(吡虫啉人工抗原合成过程见图2)。
[0053]
优选地，载体蛋白为牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)、钥孔血蓝 蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin，ova) 任意一种或几种。
[0054]
其中，pbs缓冲液的配方：na2hpo4·
12h2o 2.96g，nacl 8.0g，kh2po
4 0.20 g，加蒸馏水定容至1000ml。
[0055]
2、吡虫啉人工抗原的鉴定
[0056]
对半抗原进行紫外扫描鉴定，结果如图3所示，对bsa，ova，klh分别 进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，结果如图4-6所示，并通过比较偶联前后 的各物质的最高吸光值，发现吡虫啉半抗原最大吸收波长为270nm处，载体蛋 白bsa，ova，klh最大吸收波长均在280nm左右，取上述不同载体蛋白合 成的人工抗原，进行紫外扫描，结果如图7-9所示，吡虫啉人工抗原的最大吸收 波长则处于载体蛋白与半抗原之间。表明人工抗原偶联成功。
[0057]
实施例3
[0058]
分泌吡虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株
[0059]
1.小鼠的免疫
[0060]
用实施例2制备得到的以klh为载体蛋白的人工抗原免疫雌性balb/c小鼠。 取人工抗原与等体积的免疫佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂，加强免疫均用弗 氏不完全佐剂)乳化均匀后，采用腹腔及背部皮下多点注射法免疫小鼠，每两 周免疫一次，第三次免疫后，眼眶取血测定抗血清效价。选取免疫效果最好的 小鼠加强一次免疫，3天后取脾细胞进行融合。
[0061]
2.细胞融合与细胞株建立
[0062]
通过聚乙二醇(peg2000)法将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合，通过hat 培养基进行杂交瘤细胞筛选，利用间接竞争酶联免疫吸附剂测定检测阳性细胞 孔，并测定阳性细胞孔的抑制效果，对最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆， 最终筛选获得吡虫啉单克隆抗体杂交瘤细胞株imib7c3。
[0063]
实施例4
[0064]
吡虫啉单克隆抗体的制备
[0065]
取实施例3获得的分泌吡虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行传代培养， 吸取0.2ml细胞悬液，按照10
5-106细胞/只对健康空白balb/c小鼠进行腹腔接 种。将生长状况良好，腹部明显隆起的小鼠进行腹水采集，对腹水进行纯化， 获得吡虫啉单克隆抗体。
[0066]
实施例5
[0067]
吡虫啉抗体的灵敏度及特异性测定
[0068]
1、吡虫啉免疫原及包被原组合选择
[0069]
采用间接竞争elisa方法检测不同包被原的效价及抑制率，并根据结果筛 选最优包被原。
[0070]
表1吡虫啉免疫原和包被原组合的效价和抑制率数据
[0071][0072]
吡虫啉三种包被原的效价和抑制率检测结果如表1所示。获得最佳的包被 原为以klh为载体蛋白的包被原，即免疫原和包被原为同源人工抗原。
[0073]
2、吡虫啉抗体灵敏度测定
[0074]
吡虫啉抗体灵敏度的测定，通过建立吡虫啉抗体间接竞争elisa标准曲线 并求出半数抑制量浓度(ic50)来表示。
[0075]
标准曲线建立具体步骤包括：
[0076]
(1)将实施例3制备的吡虫啉单克隆抗体(1.5mg/ml)用pbs稀释为 1:64000，同时设置空白对照孔(用pbs代替)；
[0077]
(2)将吡虫啉人工抗原(1mg/ml)用包被液稀释为1:16000，包被96孔 酶标板，每孔加入100μl，37℃恒温箱温育2h，弃去包被液，用pbst(0.01 m pbs，0.1％tween-20(v/v))洗涤4次，拍干；
[0078]
(3)用pbs将吡虫啉稀释至100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562，0.781， 0.391，0.098，0.049，0ng/ml(三组平行)，将50μl各浓度吡虫啉溶液分别加 入96孔酶标板，再加入步骤(1)所述吡虫啉抗体稀释液，每孔加50μl。在37℃ 下温育30min后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs，0.1％tween-20(v/v)) 洗涤4次，拍干；.
[0079]
(4)加入100μl羊抗鼠二抗igg-hrp(2000倍稀释)，在37℃下温育30min 后，弃去孔中液体，用pbst(0.01m pbs，0.1％tween-20(v/v))洗涤4次， 拍干；
[0080]
(7)每孔加100μl显色液，在室温下显色15min；
[0081]
(8)每孔加入50μl终止液(1m hcl)终止反应，并用酶标仪在450nm 处读取od值；
[0082]
其中pbst的配方为：na2hpo4·
12h2o 2.96g，nacl 8.0g，kh2po
4 0.20g， 加蒸馏水定容至1000ml使溶解，后加入tween-201.0ml使成0.1％pbst。
[0083]
以od值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin软件四 参数对函数进行曲线拟合：半数抑制量浓度为ic50，以标准曲线中ic10所对 应的药物浓度为检测限，以ic20～ic80为检测范围。
[0084]
以吡虫啉为标准品建立elisa的标准曲线，最低检测限为0.1ng/ml，半抑 制浓度为1.3ng/ml，线性范围0.2～9.6ng/ml。结合图10可知，以吡虫啉为标 准品建立的标准曲线具备典型的s型曲线，检测灵敏度好。
[0085]
3、吡虫啉抗体特异性测定
[0086]
通过吡虫啉与其类似物进行交叉反应实验来确定吡虫啉抗体的特异性，用 交叉反应率(cr)表示抗体的特异性，交叉反应越小，特异性越好。
[0087]
将吡虫啉及其类似物作为竞争抗原，分别做系列稀释，采用间接竞争elisa 方法测定，步骤参考灵敏度验证的实验方法，得到各类似物的ic50值。用以下 公式计算吡虫啉和各类似物的交叉反应率(cr)：
[0088][0089]
吡虫啉与其类似物交叉反应实验结果如表2所示。
[0090]
表2吡虫啉与其类似物交叉反应实验结果
[0091]
[0092][0093]
从表2可知，吡虫啉抗体对吡虫啉的交叉反应率为100％，ic50值为1.3 ng/ml，与吡虫啉类似物氯噻啉有30.9％的交叉反应，与其类似物5-羟基吡虫啉 和烯烃吡虫啉分别
有9.0％和5.8％的交叉反应。
[0094]
实施例6
[0095]
吡虫啉酶联免疫试剂盒开发
[0096]
1、酶标板的制备
[0097]
用包被缓冲液将klh蛋白载体半抗原稀释成62.5ng/ml，每孔加入100μl， 37℃孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤4次，拍干，用铝膜真空密封保 存。
[0098]
2、检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒的组建
[0099]
组建检测吡虫啉的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
[0100]
(1)包被原处理过的酶标板；
[0101]
(2)吡虫啉标准品溶液7瓶，浓度分别为0.1μg/l，0.5μg/l，1μg/l，5μg/l， 10μg/l，20μg/l，50μg/l。
[0102]
(3)羊抗鼠二抗igg-hrp
[0103]
(4)底物显色液由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯 胺；
[0104]
(5)终止液为1m盐酸；
[0105]
(6)洗涤液为ph值为7.4，含有0.1％吐温-20。
[0106]
3、实际样品检测
[0107]
(1)样品制备过程
[0108]
准确称取样品1g至15ml离心管,加入样品提取液(80％甲醇)5ml，超 声提取10min,离心(4000rpm，5min)，取上清100μl和样品稀释液(900μl) 混匀，即可进行试剂盒检测。
[0109]
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。加入标准品/样本50μl到对应的微孔中，后加 入抗体溶液50μl，37℃反应30min，用洗板液(0.1％pbst)洗板4次，拍干； 加入100μl二抗溶液，37℃反应30min,用洗板液(0.1％pbst)洗板4次，拍 干；然后将显色液a和b进行混合(1：1)，100μl加入至酶标板，室温反应 15min后，每孔加入50μl终止液(1m hcl)，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm处，测定每孔od值。
[0110]
4、检测结果分析
[0111]
标准品或样本的吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除 以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，得到标准品或样本的吸光率。 以标准品吸光率为纵坐标，以吡虫啉标准品浓度(ng/ml)的对数为横坐标，绘 制标准曲线图。将样本的吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对 应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中吡虫啉的实际浓度。
[0112]
5、灵敏度及线性实验
[0113]
选取小麦、玉米、三七、黄芪、山药、大枣、金银花共7种谷物及药食两 用物质，以100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562，0.781，0.391，0.098，0.049， 0ng/ml系列浓度对空白样品进行加标，绘制不同基质中抑制曲线，不同基质中 检测吡虫啉的灵敏度与线性结果如表3。
[0114]
表3不同基质灵敏度及线性实验结果
[0115][0116][0117]
6、添加回收实验
[0118]
选取小麦、玉米、三七、黄芪、山药、大枣、金银花共7种谷物及药食两 用物质，分别以3种浓度50、100和200ng/ml(黄芪加标浓度分别为100，200， 400ng/ml)加标，设置未加标样品且经验证不含吡虫啉。
[0119]
按以下回收率公式计算：回收率＝加标样品吡虫啉检出浓度/加标浓度
ꢀ×
100％。
[0120]
添加回收实验的结果如表4所示。
[0121]
表4样本添加回收试验结果
[0122][0123]
结果显示小麦、玉米、三七、黄芪、山药、大枣、金银花共7种谷物及药 食两用物质的添加回收率均在65％～120％之间，变异系数均小于10％，证明 试剂盒的精密度高，稳定性好，能满足吡虫啉的检测要求。
[0124]
本发明制备得到了吡虫啉半抗原，应用半抗原偶联载体蛋白得到用于免疫 的人工抗原，应用半抗原制备得到用于包被的人工抗原，应用人工抗原制备得 到用于检测吡虫
啉的抗体，该抗体对吡虫啉具有高灵敏度和高特异性的识别能 力，半抑制浓度为1.3ng/ml，最低检测限为0.1ng/ml，对其类似物氯噻啉有 30.9％交叉反应，吡虫啉代谢物5-羟基吡虫啉和烯烃吡虫啉有9.0％和5.8％的交 叉反应，其他类似物的交叉反应低于1.3％，可排除其类似物的干扰，为建立吡 虫啉的酶联免疫检测方法提供了核心材料。
[0125]
本发明建立了一种玉米、小麦、三七、山药、黄芪、大枣、金银花中吡虫 啉的免疫快速检测方法，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、成本低，对 操作人员技能要求较低等优点，适用于现场大量样品的快速检测。而上述方法 建立的关键在于设计出合适的吡虫啉半抗原及人工抗原并获得灵敏度高、特异 性强的抗体。另外，本发明利用吡虫啉抗体开发了吡虫啉免疫检测试剂盒在谷 物及药食两用物质中吡虫啉的免疫快速检测中的应用。
[0126]
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本 发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限 制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在 权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利 要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0127]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施 方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经 适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。