菜心分枝性状主效QTL的KASP分子标记及其应用

菜心分枝性状主效qtl的kasp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体为菜心分枝性状主效qtl的kasp分子标记及其应用。


背景技术：

2.菜心(brassica campestris l.ssp.chinensis var.utilis tsen et lee)又名菜薹，是一种以花薹为食用器官的十字花科芸薹属芸薹种中的一二年生草本植物(张华等，2010；黄秀等，2017)，原产于广东，是我国南方地区的特色蔬菜(陈汉才等,2021)，栽培面积广。普通菜心品种主花序生长优势显著，生产上每株通常只收获1个花薹，产量相较于广东地区特色品种增城菜心低，增城菜心在近地面茎基部能形成15个左右的多侧枝，一次种植可以多次收获，侧枝作为商品器官，其数量可以作为来衡量菜心产量的标准(刘乐承等，1998)，因此，选育多分枝菜心品种具有重要的意义。
3.菜心分枝数是数量性状，其形成的机理非常复杂，分枝数容易受到环境的影响，因此基于表型选择的传统常规育种方法对复杂数量性状的选择效果不好，育种周期长、选择效率低，育种周期延长，已经无法完全满足当前菜心育种的需要。分子标记技术和数量遗传学结合，可以将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitative trait loci,qtl)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究利用qtl定位可以确定影响数量性状的基因位点和位置。分子标记辅助育种是将分子遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的手段，直接利用与目标性状基因紧密连锁或共分离的分子标记对个体进行目标区域以及全基因组筛选，以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的dna分子标记。目前kasp已经成功应用于基因分型，通过构建遗传图谱挖掘和性状相关的基因。kasp标记不会受到碱基种类和位点的局限，可以对indel和snp进行检测。利用kasp标记结合表型数据再通过qtl mapping软件可以实现候选基因的精细定位。
4.培育多分枝的菜心品种是提高菜心产量和经济效益的有效途径。目前鉴定的控制菜心分枝数基因很少，尚不能满足分子育种的需要。因此，发掘菜心分枝性状的主效qtl并开发与其紧密连锁的分子标记对多分枝菜心品种分子标记辅助选择育种具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
8.菜心分枝性状主效qtl的kasp分子标记及其应用，所述a0716的kasp分子标记引物
序列如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示。
9.所述a0717的kasp分子标记引物序列如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示。
10.本发明的另一个目的是上述的菜心分枝性状主效qtl的kasp分子标记引物组在多分枝菜心育种中的应用。本发明可应用于菜心分枝性状的早期鉴定和筛选、提高选择效率，为多分枝菜心分子育种提供了一种新的遗传标记。
11.为了达到上述目的，本发明采取了以下技术措施：
12.菜心分枝性状主效qtl的kasp分子标记，通过下述方式获得：
13.(1)利用普通少分枝菜心dh系
‘
cx010’和多分枝增城菜心dh系
‘
cx020’为亲本，杂交产生f1代在自交产生f2代分离群体。
14.(2)所有f2代分离群体植株生长条件完全一致，在分枝表型最明显时期，对两个亲本材料和f2代分离群体的每一株单株进行分枝数的统计。具体方法：调查分枝数的标准为茎基部5cm范围内的分枝数是茎基部分枝。
15.(3)f2群体植株的分枝数出现分离，呈现出正态分布的趋势，说明菜心分枝性状是数量性状。从f2分离群体中挑选具有极端分枝表型和处于中间分枝表型的植株各50株，使用新型植物基因组dna提取试剂盒(天根，北京，中国)提取
‘
cx010’和
‘
cx020’以及f2植株的叶片总dna。
16.(4)构建多分枝表型(12～15个分枝)、少分枝表型(1～3个分枝)和中间分枝表型(7～8个分枝)3个混池，对三个混池和两个亲本进行gradedpool-seq测序，通过片段化试剂盒将dna样品打断成长度为350bp的片段，建库。测序平台为novaseq 6000(illumina)，测序模式为pe150。
17.(5)对原始数据进行质控，使用bwa将reads比对到大白菜v3.0参考基因组(http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/genomes/brassica_rapa/v3.0/)，比对结果经samtools去除重复，根据gatk的分析流程对突变位点进行分析，得到snp和indel信息，采用snpeff对突变位点进行结构注释。
18.(6)经过ridit检验分析后对数据进行降噪，统计p值显著的位点占滑窗区域总位点的比例，从而判断出与性状显著关联的区域。降噪参数为窗口大小0.2mb，p值阈值为10-8
。最终定位a07染色体28.0～28.9mb区域的区间为候选qtl区间，调控分枝数的基因定位在a07染色体。
19.(7)根据snp信息，在候选区间内均匀选取选择前后100bp不存在其他变异的snp位点，然后设计引物将snp位点转化为kasp标记。通过检测亲本及部分f2群体单株的基因型，筛选获得基因分型良好的kasp标记，用于遗传连锁图谱构建。
20.(8)利用特异性的kasp标记分析f2群体中每个单株的基因型，利用qtl icimapping软件并将基因型和表型数据结合进行qtl分析。基于上述的技术措施，最终获得了控制菜心分枝数的qtl位点qbrtl1，所述的主效qtl定位在菜心的a07染色体。所述所述qbrtl1包括两个连锁的kasp分子标记为a0716和a0717，lod峰值(10.41)位于7号染色体27cm处，贡献率为20.81％，加性效应和显性效应分别为1.52和2.37。a0716标记的多态性碱基和a0717标记的多态性碱基的物理位置分别在a07染色体上第28007027bp和第28031606bp处，两者之间的距离约为24.6kb。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的菜心分枝数主效qtl的kasp分子标记及其应用，通过发掘菜心分枝性状主效qtl紧密连锁的标记开发得到，本发明的kasp分子标记定位的qtl遗传效果明显稳定，能够满足分子育种的需要。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
23.图1是本发明两亲本的形态图。(
‘
cx010’的分枝特征是有1～3个腋芽生出，但是只能形成一个有效分枝进行收获。
‘
cx020’的分枝特征是在莲座叶附近能产生12～15个分枝收获。)
24.图2是本发明两亲本分枝数统计图。
25.图3是f2群体植株的分枝数分布图。(横坐标表示分枝频数分布，纵坐标表示单株数量。结果表明分枝数呈正态分布，证明分枝数属于数量性状)。
26.图4为用gradedpool-seq方法鉴定菜心分枝数基因的初定位图。(横坐标为染色体位置坐标，单位为100kb，纵坐标为窗口内p值低于阈值的点占窗口总点数量的比值，点的位置越高与性状关联程度越强。最终定位a07染色体28.0～28.9mb区域即最高峰的区间为候选qtl区间，调控分枝数的基因定位在a07染色体)。
27.图5为本发明实施例中菜心分枝性状主效qtl(qbrtl1)的定位图。
28.图6为本发明实施例中a0716对f2群体的基因型鉴定结果图。(与少分枝菜心
‘
cx010’基因型相同的单株，基因型为gg，表现为少分枝；与多分枝菜心
‘
cx020’基因型相同的单株，基因型为aa，表现为多分枝；杂合基因型的单株，基因型为ga，表现为中间分枝。)
29.图7为本发明实施例中a0717对f2群体的基因型鉴定结果图。(与少分枝菜心
‘
cx010’基因型相同的单株，基因型为tt，表现为少分枝；；与多分枝菜心
‘
cx020’基因型相同的单株，基因型为gg，表现为多分枝；杂合基因型的单株，基因型为tg，表现为中间分枝。)
具体实施方式
30.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
31.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
32.其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施方式时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
34.菜心分枝数分离群体的构建及性状调查：
35.本实施例中使用普通少分枝菜心dh系
‘
cx010’(图1a)和多分枝增城菜心dh系
‘
cx020’为亲本(图1b)，二者分枝数差异显著(图2)，通过杂交再自交构建f2分离群体。在菜心分枝表型最明显时期对对两个亲本材料和f2代分离群体的每一株单株进行分枝数目的统计。具体方法：调查分枝数的标准为茎基部5cm范围内的分枝数是茎基部分枝。
36.f2群体植株的分枝数出现分离，呈现出正态分布的趋势，说明菜心分枝性状是数量性状(图3)。
37.亲本及f2群体叶片总dna的提取：
38.(1)取新鲜叶片加入液氮研磨成粉末后加入400μl缓冲液lp1和6μl rnase a，震荡1min，再室温放置10min；加入130μl缓冲液lp2，充分混匀后振荡1min；12000rpm离心5min，将上清液转入到1.5ml离心管中；
39.(2)加入1.5倍体积的lp3缓冲液后振荡混匀15s，离心管中会出现絮状沉淀；将溶液转入到吸附柱cb3中，12000rpm离心1min，倒掉废液；往吸附柱加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心1min，倒掉废液，重复两遍；12000rpm离心2min后倒掉废液，将吸附柱室温放置至残余漂洗液晾干；
40.(3)将吸附柱转入到新的1.5ml离心管中，悬空滴入50μl洗脱缓冲液te，室温放置5min，12000rpm离心2min，使用酶标仪检测基因组dna的浓度，-30℃冰箱保存。
41.菜心分枝qtl候选区间的初步定位：
42.(1)构建多分枝表型(12～15个分枝)、少分枝表型(1～3个分枝)和中间分枝表型(7～8个分枝)3个混池，对三个混池和两个亲本进行gradedpool-seq测序，通过片段化试剂盒将dna样品打断成长度为350bp的片段，建库。测序平台为novaseq 6000(illumina)，测序模式为pe150。
43.(2)对原始数据进行质控，使用bwa将reads比对到大白菜v3.0参考基因组(http://brassicadb.org/brad/datasets/pub/genomes/brassica_rapa/v3.0/)，比对结果经samtools去除重复，根据gatk的分析流程对突变位点进行分析，得到snp和indel信息，采用snpeff对突变位点进行结构注释。
44.(3)经过ridit检验分析后对数据进行降噪，统计p值显著的位点占滑窗区域总位点的比例，从而判断出与性状显著关联的区域。降噪参数为窗口大小0.2mb，p值阈值为10-8
。最终定位a07染色体28.0～28.9mb区域的区间为候选qtl区间，调控分枝的基因定位在a07染色体(图4)。
45.根据snp信息，在候选区间内均匀选取选择前后100bp不存在其他变异的snp位点，然后利用primer 5软件设计引物将snp位点转化为kasp标记。
46.(1)a0716的kasp标记：正向引物(forward primer,5
’‑3’
)seq id no.1(gaaggtgaccaagttcatgctccaacacaaccagccctat)和seq id no.2(gaaggtcggagtcaacggattccaacacaaccagccctac)分别在5’末端连上fam和vic接头(adaptor)序列，作为其kasp正向引物来分别检测主效qbrtl1紧密连锁标记，a0716的单核苷酸标记(snp)的多态性。共用反向引物(reveser primer,5
’‑3’
)序列为seq id no.3(aacgtattaaatattggaattgaa)。
47.(2)a0717的kasp标记：正向引物(forward primer,5
’‑3’
)seq id no.4(gaaggtgaccaagttcatgctgatgtgcttatttatgtccac)和seq id no.5(gaaggtcggagtcaacggattgatgtgcttatttatgtccaa)分别在5’末端连上fam和vic接头(adaptor)序列，作为其kasp正向引物
来分别检测主效qbrtl1紧密连锁标记，a0716的单核苷酸标记(snp)的多态性。共用反向引物(reverse primer,5
’‑3’
)序列为seq id no.6(aaaacaacaaaaacatccccgctccg)。
48.遗传图谱构建和qtl定位：
49.pcr反应体系(1.6μl)：dna 0.8μl，2
×
kasp master mix+assay 0.8μl。
50.pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃延伸60s，每个循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃延伸60s，共26个循环。
51.利用intelliqube基因分型检测平台(lgc)进行基于kasp技术的基因分型，根据扩增产物的荧光信号判断f2植株的基因型。
52.利用qtl icimapping 4.2软件对f2群体的kasp标记基因型和表型数据进行连锁分析构建a07染色体上目标位点附近分子标记遗传连锁图谱。
53.基于该遗传图谱、f2群体的基因型数据以及分枝表型数据，利用qtl icimapping 4.2软件进行qtl检测，检测到一个主效qtl位点(表1，图5).
54.表1 a07染色体上分枝主效qtl位点基本信息
[0055][0056]
本发明的菜心分枝数主效qtl的kasp分子标记及其应用，通过发掘菜心分枝主效qtl紧密连锁标记开发得到，本发明的kasp分子标记引物可对杂交后代的菜心基因型鉴定，能够满足分子育种的需要。
[0057]
序列表
[0058]
序列表
[0059][0060]
[0061]
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。