一株隔孢伏革菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一株隔孢伏革菌及其应用。


背景技术：

2.果园等的生产管理过程中，会产生大量的植物废弃物。对于这类废弃物，目前主要的处理方式是焚烧和丢弃，容易造成环境污染和资源浪费。植物废弃物尤其是果园修剪废弃物主要由废弃枝条构成，其主要成分是木质纤维素，在自然状态下存在降解效率低、分解时间长等问题；如果进行堆肥处理，容易出现局部厌氧，从而导致堆肥材料酸化，ph降低，进一步延长了堆肥时间。另外，果园的修枝废弃物大多产生于秋冬季和冬末初春，修剪后环境温度低，进一步抑制了堆肥过程中微生物的活性，降低木质素的分解和转化，导致堆肥时间过长甚至堆肥启动失败。
3.当前研究虽已筛选出多株木质素高效降解菌，如黄孢原毛平革菌(phanerochaete chrysosporium)、变色栓菌(trametes versicolor)、杂色云芝(coriolus versicolor)等。但现已发现的木质素降解真菌大多适合在中性或微碱性(ph＝6～8)条件下发挥功能，且对低温的适应能力差。
4.因此，选育耐酸、耐低温的木质素降解菌是解决秋冬季果园修剪废弃物自然堆肥资源化利用难题的重要方向。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株隔孢伏革菌及其应用。
6.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株隔孢伏革菌(peniophora crassitunicata)hua，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2022年4月29日，保藏编号cgmcc no.40186。
7.相应的，所述隔孢伏革菌在产漆酶中的应用。
8.相应的，所述隔孢伏革菌在产锰过氧化物酶中的应用。
9.相应的，所述隔孢伏革菌在产木质素过氧化物酶中的应用。
10.相应的，所述隔孢伏革菌在堆肥中的应用。
11.相应的，所述隔孢伏革菌在降解木质素中的应用。
12.优选的，所述应用的温度为15℃～35℃。
13.优选的，所述应用的温度为25℃。
14.优选的，所述应用的ph为3～9。
15.优选的，所述应用的ph为5。
16.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一株新的隔孢伏革菌，丰富了微生物资源库。所述隔孢伏革菌可在ph＝3.0～9.0、15℃～35℃范围内生长，具有较好的环境适应能力，因此具有更广阔的应用场景。该菌株可同时分泌漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物
酶；对枝条废弃物具有良好降解效果。
附图说明
17.图1为菌株hua的菌落形态示意图；
18.图2为菌株hua的显微镜示意图；
19.图3为菌株hua的系统发育树示意图；
20.图4为菌株hua产三种木质素降解酶的酶活情况对比示意图；
21.图5为菌株hua降解纤维素对照图；
22.图6为菌株hua降解半纤维素对照图；
23.图7为菌株hua降解木质素对照图。
具体实施方式
24.本发明提供了一株新的隔孢伏革菌(peniophora crassitunicata)hua，其its序列如seq id no：1所示。所述隔孢伏革菌保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.40186，保藏日期2022年4月29日。
25.所述隔孢伏革菌可分泌漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶，且对纤维素、半纤维素和木质素均具有较强的降解能力。
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
27.实施例涉及的培养基如下：
28.1、pda培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
29.2、pda培养基(含0.1％愈创木酚)：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min，灭菌后加1ml愈创木酚。
30.3、pda培养基(含0.01％苯胺蓝)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，苯胺蓝0.1g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
31.4、赫奇逊氏(huchinson)培养基：kh2po
4 1g、nacl 0.1g、mgso4·
7h2o 0.3g、nano
3 2.5g、fecl
3 0.01g、cacl
2 0.1g，用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
32.5、发酵培养基：在赫奇逊氏培养基基础上加入葡萄枝条30g，再用蒸馏水定容至1000ml，121℃灭菌20min。
33.实施例一：隔孢伏革菌的筛选、鉴定及生理生化特性
34.1、微生物的筛选。
35.(1)初筛：选择中国科学院成都生物研究所茂县生态系统定位研究站的华山松凋落物。称取华山松凋落物1g放入盛有无菌水99ml的250ml三角瓶中，在恒温摇床上25℃下180r/min振荡1h，然后静置30min。取上清液进行梯度稀释，将稀释度为0～10-2
的样液分别涂布于pda培养基上，25℃恒温静置培养7d后，挑取菌丝体，在pda培养基上反复接种纯化直至得到纯菌株。
36.(2)复筛：利用愈创木酚平板显色试验和苯胺蓝平板褪色试验进行。愈创木酚平板显色试验：将步骤(1)获得的各纯菌株分别接种在含0.1％愈创木酚的pda培养基中，每个菌株3个平行，于25℃下培养14天。观察平板上是否出现红棕色显色圈，并记录有无显色圈及显色圈直径的大小。通过显色圈产生的时间及显色圈的直径大小，筛选出产漆酶能力强的菌株。苯胺蓝平板褪色试验：将步骤(1)获得的各纯菌株分别接种在含0.01％苯胺蓝的pda培养基中，每个菌株3个平行，于25℃下培养14天。观察平板上是否出现褪色圈，并记录有无褪色圈及褪色圈直径的大小。通过褪色圈产生的时间及褪色圈的直径大小，筛选出产过氧化物酶能力强的菌株。
37.经过复筛，最终确定筛选出产漆酶和产过氧化物酶能力均强的菌株，为目的菌株，反复接种直至获得纯培养，编号为菌株hua。
38.2、微生物的鉴定。菌株hua的菌落形态如图1所示，微生物的显微镜示意图如图2所示。通过its序列检测该菌株与peniophora crassitunicata(mt322660.1)的相似性达99.47％，因此鉴定为隔孢伏革菌(peniophora crassitunicata)。系统发育树如图3所示；its序列如seq id no：1所示。所述隔孢伏革菌保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.40186，保藏日期2022年4月29日。
39.3、所述隔孢伏革菌hua在pda培养基中生长速度慢，菌落初期(图1)为白色，棉絮状，表面稍有点凸起，挑取时具有粘稠感，生长后期菌落逐渐变为黄褐色。显微镜下菌丝透明较细，有锁状联合(图2)。
40.所述隔孢伏革菌hua在含0.1％愈创木酚的pda培养基上显色快，培养的第3天即开始出现显色反应，呈现红棕色显色圈。所述隔孢伏革菌hua先显色，再开始生长(从第6天开始)，红棕色显色圈的面积大于菌落面积，菌株的显色圈直径在初期以较快速度增大，13天以后，菌株随着培养时间增加显色圈以较慢速度增大，最终显色圈直径为3.7cm。
41.所述隔孢伏革菌hua在含0.1％苯胺蓝的pda培养基上产生褪色反应并最终使得培养基中的蓝色全部消失。证明菌株hua具有较强的产过氧化物酶的能力。
42.4、温度和ph环境测试。
43.(1)将菌株hua分别接种在多个pda培养基中(ph＝5)，温度分别设置为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，每个处理设置3个平行，每隔24h测定菌落直径，通过直径大小确定菌株生长温度范围及最适生长温度，共培养10天。
44.(2)将菌株hua分别接种在多个pda培养基中，ph分别设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每个处理设置3个平行，置于25℃恒温培养10天，每隔24h测定菌落直径，通过直径大小确定菌株生长ph范围及最适生长ph。
45.结果如表1所示，表1中，-表示不生长；+代表菌落直径，+越多，表示菌落直径越大、生长情况越好。结果显示：菌株在15℃～35℃范围内均能够生长，最适温度为25℃；在设置的ph为3.0～9.0范围内能够生长，其中最适ph为5.0。
46.表1菌株hua在不同温度和ph环境下的生长情况对照表
47.温度10℃15℃20℃25℃30℃35℃40℃hua菌株-++++++++++++++++-ph3.04.05.06.07.08.09.0hua菌株++++++++++++++++++++
48.实施例二：隔孢伏革菌的三种木质素降解酶的酶活测试
49.将菌株接种到100ml的液态pda培养基中，每个处理设置3个平行。置于25℃摇床中180r/min培养7天，每隔24h取样。取样获得的菌液在4℃下10000r/min离心10min后收集的上清液为粗酶液。检测漆酶(lac)、木质素过氧化物酶(lip)和锰过氧化物酶(mnp)三种木质素降解酶的酶活性。
50.漆酶活力定义：1min内氧化1μmol的abts为一个酶活单位u，消光系数ε＝3.6
×
104mol-1
·
l
·
cm-1
。木质素过氧化物酶活力定义：1min内氧化1μmol黎芦醇为一个酶活单位u，消光系数ε＝9.3
×
103mol-1
l
·
cm-1
。锰过氧化物酶活力定义：1min内将1μmol的mn
2+
氧化为mn
3+
为一个酶活单位u，消光系数ε＝2.2
×
104mol-1
·
l
·
cm-1
。
51.所有酶活计算公式是：(106/ε)
×
(v
总
/v
酶
)
×
(
△
od/
△
t)。式中，单位为u/l，v
总
和v
酶
分别表示酶活测定反应体系的总体积和反应添加的上清液体积，ε为消光系数。
52.结果如图4所示。从图4可以看出：菌株hua的lac在培养过程中逐渐增强，从第3天以后大幅上升，最高酶活达到53.18u/l；mnp酶活最高，第3天达到174.01u/l，而后逐渐下降；lip在第5天达到活性峰值9.51u/l。
53.实施例三：隔孢伏革菌降解葡萄枝条废弃物的能力展示
54.将葡萄枝条剪成约3cm小段，干燥后粉碎至35目。将菌株hua接种到液体pda培养基中，25℃摇床培养3～5天，获得菌液。锥形瓶中装入100ml含有葡萄枝条的发酵培养液，按5％(v/v)菌液进行接种，于25℃、180r/min下震荡培养，同时以5％(v/v)无菌水代替菌液，作为空白对照(ck)。分别在0、4、8、12、16、20天取样，测定纤维素、半纤维素、木质素含量。木质素、纤维素和半纤维素的相对降解率计算公式：相对降解率(％)＝(a0-an)/a0
×
100％。式中，an表示第n天木质素(或纤维素、半纤维素)的含量，a0表示第0天木质素(或纤维素、半纤维素)的含量。结果如表2和图5、6、7所示，图5为纤维素降解对照图，图6为半纤维素降解对照图，图7为木质素降解对照图。表中数据为平均值
±
标准误(n＝3)；同列不同小写字母表示同一样品不同时间差异显著(p＜0.05)。
55.表2hua菌株降解葡萄枝条情况对照表
[0056][0057][0058]
表2结果中，菌株hua明显加速了纤维素降解，底物的纤维素含量最初为45.07％，菌株hua组在第20天下降至最低，其含量为37.16％，相对降解率为17.55％。再结合图5，对照组的纤维素含量在整个发酵期间比较平稳，而菌株hua组的纤维素含量降低趋势比较显著。结合图6，对于半纤维素，经过20天发酵后，最终含量分别为8.26％(对照组)、7.27％(菌株hua)，相对降解率为28.13％(对照组)、36.74％(菌株hua)，二者整体趋势都是呈现逐渐下降，但是菌株hua组半纤维素含量始终低于对照，此外相对于第0天，菌株hua中半纤维素
含量随着时间表现出明显下降。结合图7，葡萄枝条经菌株hua发酵20天后，最终木质素含量分别为26.49％(对照组)、24.63％(菌株hua)，菌株hua的相对降解率(10.47％)要远高于对照组(3.69％)，说明菌株hua的添加可以改善木质素的降解。本试验说明菌株hua促进了木质纤维素的降解。整个过程中，对照组的木质纤维素含量高，菌株hua组的木质纤维素含量始终要低一些，最终木质素和纤维素的相对降解率要比对照组高，因此与对照相比，添加菌株hua有利于葡萄枝条木质纤维素成分的降解。需要说明的是：空白对照组虽然对枝条进行了一定的表面灭菌，但枝条内部含有内生菌，随着发酵时间的进行，内生菌对枝条中的纤维素等也会有一定的降解作用。
[0059]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。