一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其用途

一种baeyer-villiger单加氧酶及其用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种baeyer-villiger单加氧酶及其用途。


背景技术：

2.龙涎醚是来源于抹香鲸的名贵香料龙涎香的主要香味成分。由于龙涎香的天然来源越来越稀少，且很多国家目前已立法禁止龙涎香交易，龙涎醚已取代龙涎香作为定香剂和致香剂被应用于香水、高端日化产品、香烟等产品中，具有很高的市场价值。目前龙涎醚的主要来源是以植物提取的天然产物香紫苏醇为原料，进行化学氧化、还原、环化三步反应，先后形成香紫苏内酯和香紫苏二醇，最终产生龙涎醚，如图2所示。除了化学法以外，也可以用生物转化—化学催化结合的方式进行龙涎醚的生产：一种是利用真菌cryptococcus albidus atcc 20918以化合物(1)为原料发酵生产化合物(2)(us005212078a,1993)，随后以化合物(2)为原料通过化学法生产化合物(4)；另一种方式是用真菌hyphozyma roseoniger atcc 20624以化合物(1)为原料生产化合物(3)(us4798799a,1989)，再以化合物(3)为原料通过化学法生产化合物(4)。
3.化学-酶法合成龙涎醚近年来也有报道，来源于酸热脂环酸杆菌(alicyclobacillus acidocaldarius)的角鲨烯藿烯环化酶(squalene hopene cyclase,shc)可催化16碳前体(3e,3e)-homofarnesol发生环化反应直接生成龙涎醚(advanced synthesis&catalysis 2018,360,2339-2351)。该方法目前主要存在两个问题：首先，(3e,3e)-homofarnesol需以橙花叔醇为原料经四步化学反应合成(us9758500b2,2017)，成本较高且产率较低；其次，shc催化的反应会产生气味远远低于龙涎醚的同分异构体。因此，龙涎醚的合成方法仍有较大的改进空间。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种真菌来源的baeyer-villiger氧化酶，该酶及表达该酶的工程菌株均能够催化香紫苏醇衍生物发生baeyer-villiger氧化反应生成乙酸酯，后续可通过温和易发的酯键水解、脱水缩合反应生产龙涎醚。为龙涎醚的合成开辟了新的途径。
5.为实现上述目的，本发明首先采用的技术方案是：一种baeyer-villiger单加氧酶，该酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.进一步地，本发明还提供所述baeyer-villiger单加氧酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.进一步地，本发明还提供一种包含所述baeyer-villiger单加氧酶的编码基因的表达载体。
8.进一步地，本发明还提供一种表达所述baeyer-villiger单加氧酶的工程菌，所述工程菌包含所述的表达载体或所述编码基因。
9.进一步地，本发明还提供一种baeyer-villiger单加氧酶的用途，该酶在制备龙涎醚的过程中，用于催化香紫苏醇衍生物发生baeyer-villiger氧化反应。
10.进一步地，本发明还提供一种化学-酶法生产龙涎醚的方法，该方法包括：利用所述的baeyer-villiger单加氧酶催化香紫苏醇衍生物发生baeyer-villiger氧化反应生成乙酸酯，后续通过酯键水解、脱水缩合反应生产龙涎醚；其中，反应体系中，酶与底物的摩尔比为1:4～1:50。
11.与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
12.1.提供一种新型的baeyer-villiger单加氧酶及表达该酶的工程菌；
13.2.baeyer-villiger单加氧酶能够催化香紫苏醇衍生物发生baeyer-villiger氧化反应，为龙涎醚的生产提供了新途径；
14.3.提供一种新的化学-酶法生产龙涎醚的方法，该方法条件温和，成本低廉。
附图说明
15.图1为本发明提供的化学-酶法生产龙涎醚过程中化合物(5)在hrbvmo催化下发生的bayer-villiger氧化反应；
16.图2为现有龙涎醚的化学合成及本发明提供的化学-酶法合成路径；其中a，b，c，d，e，g均为已知反应，f为本发明提供的hrbvmo催化的bayer-villiger氧化反应；
17.图3为hrbvmo的表达质粒图谱；
18.图4为纯化后的hrbvmo的sds-page分析，图中：m.蛋白marker；1.hrbvmo蛋白，理论分子量大小为81kda。
19.图5为化合物(5)和化合物(6)标准品的高分辨质谱检测；图中，a：化合物(5)；b：化合物(6)；
20.图6为化合物(5)和化合物(6)的1h核磁共振图谱；图中，a：化合物(5)；b：化合物(6)；
21.图7为化合物(5)在hrbvmo催化下反应产物的gc-ms/ms鉴定；a.化合物(6)标准品的离子色谱图；b.化合物(6)标准品离子碎片谱；c.化合物(5)在hrbvmo催化下反应产物的离子色谱图；d.化合物(5)在hrbvmo催化下反应产物离子碎片谱；
22.图8为化合物(5)在hrbvmo催化下反应产物的高分辨lc-ms检测；a.反应产物中提取离子流色谱图；b.a图中提取到的离子峰处的质谱检测到与化合物(6)理论分子量一致的离子峰。
具体实施方式
23.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
24.实施例1 baeyer-villiger单加氧酶hrbvmo的基因与氨基酸序列分析
25.通过对真菌hyphozyma roseonigra atcc 20624(购自american type culture collection)基因组测序及数据挖掘获得一个长度为2124个碱基的编码基因，该基因编码一个长度为707个氨基酸的蛋白，命名为hrbvmo。该编码基因序列如seq id no.2所示，蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
26.通过对该蛋白hrbvmo进行pfam分析(在线工具地址http://pfam.xfam.org/)发现，该蛋白属于flavin-containing monooxygenase(fmo)蛋白家族，因此其催化反应时需要黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)作为辅因子。随后，在uniprot数据库(www.uniprot.org)中对该蛋白进行功能预测，与其一致性最高且有功能研究报道的蛋白为4-羟基苯乙酮单加氧酶(序列号：q93tj5)，该酶能够催化4-羟基苯乙酮发生bayer-villiger氧化反应生成4-乙酰氧基苯酚，hrbvmo与该酶的序列一致性为36％。
27.为了确定hrbvmo氨基酸序列的新颖性，本发明课题组通过在线blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在genbank中搜索它的同源蛋白并按序列相似性排列，表1中所列的为genebank数据库中与hrbvmo一致性最高的30个序列，其中只有一个蛋白的基因序列与hrbvmo一致性大于60％，其余29个蛋白均低于60％。该分析结果说明hrbvmo蛋白为从未公开过的蛋白序列。
28.表1.genebank中与hrbvmo编码基因一致性最高的前30个蛋白的基因序列
29.30.实施例2 hrbvmo的克隆
31.以hyphozyma roseonigra atcc 20624(购自american type culture collection)菌落为模板，以bv-f及bv-r为引物对hrbvmo的编码基因片段进行扩增。采用takara公司的primestar max dna polymerase，按照试剂盒说明书配置反应体系。
32.扩增程序为：
[0033][0034]
以pet28a为模板，28a-f及28a-r为引物对pet28a进行线性化扩增。
[0035]
扩增程序为：
[0036][0037]
以上扩增引物序列如表2所示。
[0038]
表2.hrbvmo编码基因克隆至pet28a的引物及其序列
[0039][0040]
将获得的hrbvmo编码基因片段与线性化的pet28a载体片段利用无缝克隆试剂盒进行连接形成表达载体pet28a-hrbvmo，图谱如图3所示。将上述表达载体转化至大肠杆菌表达菌株escherichia coli rosseta-gami 2(de3)，获得表达菌株rg2-hrbvmo。菌株rg2-hrbvmo表达c端带有组氨酸纯化标签的hrbvmo蛋白，可通过ni-nta亲和层析柱进行蛋白纯化。
[0041]
实施例3 hrbvmo蛋白的表达与纯化
[0042]
挑取rg2-hrbvmo单克隆接到培养基中(含有50μg/ml卡那霉素和10μg/ml氯霉素双抗性)进行种子液培养，37℃、220rpm摇床培养8-12h；扩大培养的比例为1:500～1:100，37℃、220rpm摇床培养约4h，当od
600
达到0.6～0.8时加入iptg开始诱导，iptg终浓度可以为0.2～1mm。诱导条件为18～30℃诱导18-24h。将诱导结束的菌液在4℃、3000～6000g条件下离心10min，收集菌体。
[0043]
收集的菌体用50ml预冷的lysis buffer重悬，在冰浴中利用超声破碎仪对菌体进
行破碎，破碎程序为功率为290w，超声破碎4s，停止8s，超声总时长为15min。在4℃13000g 60min条件下离心取上清，上清液与3ml ni-nta树脂在4℃的下孵育1小时使目标蛋白与树脂充分结合，先后用15ml lysis buffer和15ml wash buffer冲洗，用5ml elution buffer洗脱收集目标蛋白，用ultracel-30k的超滤管对洗脱液浓缩至2.5ml。将脱盐柱pd-10用25ml desalting buffer平衡，将2.5ml浓缩蛋白液加入到脱盐柱pd-10中，加入3.5ml的desalting buffer收集蛋白，用分光光度计测定纯化蛋白质的浓度为2mg/ml，取10μl蛋白用于sds-page检测，检测结果如图4所示。剩余蛋白用液氮速冻并保存于-80℃。
[0044]
上述蛋白纯化各缓冲液配方：
[0045]
lysis buffer(1l)：6g nah2po4、17.5g nacl、100g甘油，0.68g咪唑，ph 8.0。
[0046]
wash buffer(1l)：6g nah2po4、17.5g nacl、100g甘油，1.36g咪唑溶，ph 8.0。
[0047]
elution buffer(1l)：6g nah2po4、17.5g nacl、100g甘油，17.02g咪唑，ph 8.0。
[0048]
desalting buffer(1l)：6g nah2po4、100g甘油，ph 7.4。
[0049]
实施例4 hrbvmo蛋白的功能鉴定
[0050]
(1)hrbvmo蛋白的底物与产物标准品的制备
[0051]
作为验证hrbvmo蛋白功能的底物与产物，化合物(5)(香紫苏酮)和化合物(6)(香紫苏二醇乙酸酯)均通过化学法合成。其中化合物(5)的合成条件依据参考文献synthetic communications 2004,34,3631
–
3643，化合物(6)的合成条件依据参考文献chemistry of natural compounds 2011,47,574
–
578，合成并纯化后的化合物(5)和化合物(6)经高分辨质谱(如图5所示)及核磁共振1h谱(如图6所示)鉴定，确认与参考文献吻合，具体数据如下：
[0052]
化合物(5)：高分辨质谱分子量303.2295([m+na]
+
,理论值303.2295)。
[0053]1h nmr(600mhz,cdcl3,δ,ppm,j/hz):0.79(6h,s),0.86(3h,s),1.15(3h,s),1.08
–
1.88(2h,m),2.13(3h,s),2.59(1h,ddd,j＝5.7,7.8,17.8),2.65(1h,dd,j＝7.8,17.8).
[0054]
化合物(6)：高分辨质谱分子量319.2248([m+na]
+
,理论值319.2244)。
[0055]1h nmr(600mhz,cdcl3,δ,ppm,j/hz):0.79(6h,s),0.86(3h,s),1.15(3h,s),1.08
–
1.88(2h,m),2.13(3h,s),2.59(1h,ddd,j＝5.7,7.8,17.8),2.65(1h,dd,j＝7.8,17.8).
[0056]
以上核磁数据与参考文献一致。
[0057]
(2)hrbvmo蛋白催化香紫苏醇衍生物发生bayer-villiger氧化反应的产物鉴定
[0058]
hrbvmo蛋白催化的反应如图1所示，具体过程如下：
[0059]
2.8mg化合物(5)溶于二甲基亚砜(dmso)制成10mm底物母液，50mm nah2po
4-nah2po
4 ph 7.5作为反应缓冲液。
[0060]
反应体系：fad 30μm，nadph 1mm，gdh 1μm，葡萄糖10mm，化合物(5)100μm，hrbvmo 10μm(终浓度)，总体积200μl。反应5小时后用200μl乙酸乙酯萃取，产物用于后续检测。对照样品与以上反应样品相同处理，唯一不同点在于所用酶为100℃处理10min失活后的hrbvmo。
[0061]
反应产物首先在气相色谱(gc-ms/ms)上进行检测，所用仪器型号为thermo q exactive
tm gc orbitrap
tm gc-ms/ms。检测结果如图7所示，化合物(5)在hrbvmo催化下反应生成出峰时间(28.04min)及离子碎片(图7中c、d所示)与化合物(6)(如图7中a、b所示)相同的物质，证明其产物为化合物(6)。随后，将样品与对照的样品用氮吹仪吹干后用40％甲醇溶解，进行高分辨lc-ms分析，如图8所示，从反应样品中可提取到化合物(6)的离子峰。由
gc-ms/ms和lc-ms结果可以确定，hrbvmo能够催化香紫苏酮发生bayer-villiger反应生成香紫苏二醇乙酸酯。该结果为hrbvmo应用于龙涎醚的合成提供了有力的证据。
[0062]
本发明提供的化学-酶法生产龙涎醚的方法中，化合物(5)的生产可通过起始原料香紫苏醇进行一步氧化生产，其报道的最高产率为90％(tetrahedron 1993,49,10405
–
10412；tetrahedron 2011,67,1142
–
1144；chemistry of natural compounds 2021,57,101
–
110.)，而后续的酯键水解及环化均为环境友好、成本低廉的反应，因此本发明对于龙涎醚合成方法的改进具有重要意义，能够带来显著的经济效益。